Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

אנו מודים במיוחד לטימו פריטש על טיפול מעולה בבעלי חיים והרמן דרינג, מוחמד אלסיי, סול פוזה - מנדז, יעקב פון טרוטה, קומאלי ולישטי וברברה וינטר על תמיכתם המועילה. אנו גם אסירי תודה לכל שאר חברי מעבדת קסטר על המשוב שלהם. הפרויקט מומן בחלקו על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG, KO1949/7-2) פרויקט 241961032 (ל- RWK) ובונדסמיניסטריום פיור בילדונג או פורשונג (BMBF; פרויקט CIPRESS נוירון II ERA-Net 01EW1520 ל- JCM) הוא הודה.

כל עבודת בעלי החיים המתוארת כאן היא בהתאם לתקנות המשפטיות (EU-הוראה 2010/63). תחזוקה וטיפול בדגים אושרו על ידי הרשויות המקומיות ועל ידי נציג רווחת בעלי החיים של תותיית בראונשווייג.
1. הכנת נוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי (ACSF), אגוראז נמס נמוך ומחטי זכוכית חדות
<ol><li>הכן את ACSF על ידי המס?...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).</li><li>Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

השיטה המוצגת מספקת גישה חלופית לבידוד המוח או לטיפול בזחלי דגי זברה עם תרופות המעכבות פיגמנטציה להקלטת תמונות ברזולוציה גבוהה של נוירונים בסביבת הוויו שלהם. איכות התמונות המתועדת בשיטה זו דומה לתמונות ממוחות מוסברים, אך בתנאים טבעיים.
יתר על כן, אובדן בעוצמת הפלואורס?...

במהלך העשורים האחרונים, דג הזברה (דניו rerio) התפתח כאחד האורגניזמים מודל החוליות הפופולרי ביותר עבור מחקרים התפתחותיים עובריים וזחלים. פוריותן הגדולה של נקבות דגי הזברה יחד עם התפתחות הרחם האקסית המהירה של העובר ושקיפותו בשלבים התפתחותיים עובריים מוקדמים הם רק כמה גורמים מרכזיים שהופכים את דג הזברה לאורגניזם מודל רב עוצמה כדי להפוך שאלות התפתחותיות1. התקדמות בטכנולוגיות גנטיות מולקולריות בשילוב עם רזולוציה גבוהה במחקרי הדמיה vivo מותר לטיפול מנגנונים ביולוגיים תאים שבבסיס תהליכים התפתחותיים2. בפרט, בתחום ההבחנה העצבית, הפיזיולוגיה, הקישוריות והתפקוד, דגי הזברה שפכו אור על יחסי הגומלין של דינמיקה מולקולרית, תפקודי מוח והתנהגות אורגניגנית בפירוט חסר תקדים.
עם זאת, רוב המחקרים הללו מוגבלים לשלבים עובריים וזחליים מוקדמים במהלך השבוע הראשון של ההתפתחות כמו שקיפות של רקמת מערכת העצבים הולך לאיבוד בהדרגה. בשלבים אלה, רקמת המוח נמנעת מגישה על ידי גישות מיקרוסקופיות ברזולוציה גבוהה להיות מוגן על ידי בידול הגולגולת פיגמנטציה3.
לכן, שאלות מרכזיות של הבחנה עצבית, התבגרות, ופלסטיות כגון עידון של קישוריות עצבית או קנה מידה סינפטי קשה ללמוד. תהליכים תאיים אלה חשובים על מנת להגדיר מנגנונים תאיים המניעים, למשל, התנהגות חברתית, קבלת החלטות או התנהגות מבוססת מוטיבציה, תחומים שבהם מחקר דגי זברה על זחלים בני מספר שבועות תרם לאחרונה ממצאים מרכזיים המבוססים על מחקרים התנהגותיים4.
גישות פרמקולוגיות לעכב פיגמנטציה בזחלי דגי זברה במשך מספר שבועות הם בקושי אפשרי או אפילו עלול לגרום השפעות מזיקות5,6,7,8. זנים מוטנטיים כפולים או משולשים עם פגמים פיגמנטציה ספציפיים, כגון קספר9 או קריסטל10, הפכו לכלים בעלי ערך רב, אך הם מייגעים ברבייה, מספקים צאצאים מעטים ומהווים את הסכנה של צבירת מומים גנטיים עקב הכלאה מופרזת.
כאן, הליך פולשני מינימלי כחלופה מסופק כי הוא חל על כל זן דג זברה. הליך זה הותאם ממחקרים אלקטרופיזיולוגיים כדי לתעד פעילות עצבית בזחלי דגי זברה חיים וערים. בטלוסטים, עור וסחוס גולגולת רך ניתן להסיר בזהירות על ידי מיקרו קילוף שכבות אלה, כי הם אינם שזורים היטב עם כלי המוח. זה מאפשר חשיפת רקמת מוח המכילה נוירונים ודרכיים אקסונליות ללא נזק להקלטת מורפולוגיה עצבית, כולל מבנים סינפטיים ותכולתם המולקולרית, אשר בתורם כוללים תצפית על שינויים פיזיולוגיים כגון Ca2 + ארעיים או אירועי תחבורה תאיים עד מספר שעות. יתר על כן, מעבר לאפיונים תיאוריים, הגישה הישירה לרקמת המוח מאפשרת חקירה של תפקודים עצביים בוגרים באמצעות מתן חומרים נוירופרמקולוגיים וגישות אופטוגנטיות. לכן, יחסי תפקוד מבנה אמיתיים יכולים להתגלות במוח דגי הזברה הצעירים באמצעות אסטרטגיית חשיפה זו למוח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

הבנת השינויים הארעיים המתרחשים במהלך התפתחות המוח וההתבגרות דורשת הדמיה מפורטת ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן ברזולוציה תאית ותת-תאית. ההתקדמות בטכנולוגיות מולקולריות והדמיה אפשרה לנו לקבל תובנות מפורטות רבות על מנגנונים תאיים ומולקולריים של התפתחות המוח בעובר דג הזברה השקוף. לאחרונה, תהליכים של עידון קישוריות עצבית המתרחשים בשלבים מאוחרים יותר של זחל מספר שבועות לאחר ההפריה, שהם למשל שליטה על התנהגות חברתית, קבלת החלטות או התנהגות מונעת מוטיבציה, עברו למוקד המחקר. בשלבים אלה, פיגמנטציה של עור דג הזברה מפריעה לחדירת אור לרקמת המוח, ופתרונות לשלבים עובריים, למשל, עיכוב פרמקולוגי של פיגמנטציה, אינם אפשריים יותר.
לכן, פתרון כירורגי זעיר פולשני לגישה מיקרוסקופית למוח של דגי זברה ערים מסופק כי נגזר גישות אלקטרופיזיולוגיות. בטלוסטים, עור וסחוס גולגולת רך ניתן להסיר בזהירות על ידי מיקרו קילוף שכבות אלה, חשיפת נוירונים הבסיסיים ועלונים אקסוניים ללא נזק. זה מאפשר הקלטה של מורפולוגיה עצבית, כולל מבנים סינפטיים ותכולתם המולקולרית, ותצפית על שינויים פיזיולוגיים כגון Ca2 + ארעי או אירועי תחבורה תאיים. בנוסף, חקירה של תהליכים אלה באמצעות עיכוב פרמקולוגי או מניפולציה אופטוגנטית היא אפשרית. גישה זו של חשיפה למוח מספקת מידע על שינויים מבניים ופיזיולוגיים בתאי העצב, כמו גם על המתאם והתלות ההדדית של אירועים אלה ברקמת מוח חיה בטווח של דקות או שעות. הטכניקה מתאימה להדמיה מוחית של זחלי דגי זברה עד 30 יום לאחר ההפריה, השלב ההתפתחותי האחרון שנבדק עד כה. זה, אם כן, מספק גישה לשאלות חשובות כגון עידון סינפטי ושינוי קנה מידה, הובלה אקסונית ודנדריטית, מיקוד סינפטי של מטען ציטוס שלד או ביטוי תלוי פעילות מקומית. לכן, ניתן לצפות לשימוש נרחב בגישת הרכבה והדמיה זו.

איור 3Aג הצג זחל 14 dpf של הקו הטרנסגני Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] כשהגולגולת עדיין שלמה. תאי הפיגמנט בעור השכבת-על מפוזרים על כל הראש ומפריעים לאות הפלואורסצנטיות באזור העניין (כאן, המוח הקטן). עם הזחל במצב זה, לא ניתן להשיג תמונות ברזולוצ...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

שיטה זו מאפשרת הדמיה של מוח דג זברה בשלבים מאוחרים יותר של זחל כדי לאפשר את התצפית של הארכיטקטורה העצבית בצורה מפורטת מאוד ב vivo כי בעבר לא היה אפשרי. תאי פיגמנט, אשר הופיעו במהלך התפתחות זחל מאוחר יותר ומונע את המוח הדמיה ברורה, אינם בעיה עם שיטה זו כי הם פשוט מוסרים. בשיטה, יש ללמוד תהליכים המתרחשים בשלבים מאוחרים יותר במהלך התפתחות הזחל של המוח, תהליכים המשפיעים על פלסטיות סינפטית, ניוון של נוירונים או התחדשותם.לפני תחילת הניסוי השתמש במשיכת מיקרופיפט כדי להכין מחטי זכוכית חדות, דקות, מנימי זכוכית. לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטר פלסטיק כדי לאסוף זחל לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ המכיל את הפתרון המתאים. מעבירים את הזחל הנבחר לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה ACSF ומניחים 24 על 24 מילימטר, מרובע, כיסוי זכוכית להחליק לתוך מכסה צלחת פטרי.ואז aliquot את הנפח של ACSF הדרוש לניסוי לתוך phial מתאים עבור חמצון עם קרבוגן. כדי להטמיע את הזחל, השתמש בצינור פסטר כדי להעביר את הזחל המרדים לתא הרכבה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. אם כל זחל עדיין מסוגלים לזוז, לא להשתמש בדגים לניסוי עד הדגים אינם מסוגלים לזוז לחלוטין.כאשר הזחלים הם חסרי תנועה, בזהירות להסיר את מדיום עודף מיד להוסיף לפחות מיליליטר אחד של אגרוז נמס נמוך על הזחל. כוון את דג הזברה עם אזור הגב הפונה למעלה קרוב ככל האפשר לפני השטח של האגארוז. אם הזחל יצולם באמצעות מיקרוסקופ הפוך, לאחר התחזקות, גזמו את האגורוז המכיל את הזחל לבלוק קובואידי קטן.כדי לחשוף את המוח להדמיה, לקצץ את עודף agarose מעל אזור המוח של עניין לפי הצורך ולהשתמש במחט זכוכית כדי להפוך חתך קטן דרך העור ליד, אבל לא מעל, אזור העניין מבלי לחדור עמוק מדי לתוך הרקמה. בקושי להזיז את המחט ממש מתחת לפני העור, להמשיך בזהירות לעשות חתכים קטנים מאוד סביב אזור העניין עד העור מעל אזור העניין ניתן להסיר או לדחוף הצידה. כאשר הרקמה הוסרה מכל העוברים, הוסף טיפה קטנה של אגרוז נמס נמוך לתא ההדמיה שהוכן בעבר של מיקרוסקופ הפוך והשתמש במרית קטנה כדי להפוך את בלוק אגרוז הקוביואיד 180 מעלות על טיפת האגרוז בתא ההדמיה.כאשר האגורוז התגבש, מלאו את תא ההדמיה ב-ACSF טרי והתחילו להדמיה את הזחל. כאן, זחל מהונדס שלם 14 ימים לאחר ההפריה עם הגולגולת עדיין שלם ניתן לראות. כפי שמוצג, תאי הפיגמנט בתוך העור המניח מפוזרים על כל הראש, מפריעים לאות הפלואורסצנטי באזור העניין.לאחר ניתוח גולגולת פתוח, תחום העניין הופך לנגיש באופן חופשי להדמיה מפורטת ברזולוציה גבוהה. מחסום העור, הגולגולת או מוח הדם מעכבים גם את חדירת החומרים למוח, כפי שממחיש צבע גרעיני איתן הכתם שנצפו בתאי מוח אלה רק לאחר ניתוח גולגולת פתוח. יתרונות אלה נצפים גם ב 30 ימים לאחר ההפריה.בדגים מהונדסים המכילים כלי דם מוחי פלואורסצנטי בשל הביטוי של חלבון פלואורסצנטי אדום, mCherry, בתאי אנדותל, קידוד צבע בערכי העומק של מחסנית התמונה מדגים כי אפילו כלי דם קבורים עמוק בתוך המוח כמעט 250 מיקרון עדיין גלויים בבירור למעקב. בעת ביצוע הליך זה תמיד יש לזכור כי זהו ניתוח בחיה חיה. לכן, זה דורש כבוד ונפש ממוקדת.לאחר הליך זה, הקלטה של המורפולוגיה העצבית, כולל מבנים סינפטיים, אירועי הובלה פיזיולוגיים תאיים יכולה להתבצע בזחלים מעל שבעה ימים לאחר ההפריה. בטכניקה זו, אנו מקווים לספק גישה המאפשרת לחקור גם תהליכים תאיים במוח המתרחשים בשלבים מאוחרים יותר של זחל, וכי הם מעורבים ביצירת, למשל, התנהגויות מורכבות כגון התנהגות חברתית או קבלת החלטות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

הסרת &quot;חוברת הדרכת עריפת הראש, פתיחת גולגולת, ו Brain: חשיפה של החזיר CNS לניתוח היסטולוגית

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...