Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

Ringraziamo in particolare Timo Fritsch per l'eccellente cura degli animali e Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti e Barbara Winter per il loro utile supporto. Siamo anche grati a tutti gli altri membri del laboratorio Köster per il loro feedback. Il progetto è stato finanziato in parte dal progetto della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (a RWK) e dal Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; È riconosciuto il progetto ERA-Net NEURON II CIPRESS 01EW1520 to JCM).

Tutto il lavoro sugli animali qui descritto è conforme alle normative legali (Direttiva UE 2010/63). La manutenzione e la manipolazione del pesce sono state approvate dalle autorità locali e dal rappresentante per il benessere degli animali della Technische Universität Braunschweig.
1. Preparazione di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), acarosio a bassa fusione e aghi di vetro affilati
<ol><li>Preparare l'ACSF sciogliendo le sostanze chimiche elencate alle seguenti concentrazioni i...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).</li><li>Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

Il metodo presentato fornisce un approccio alternativo all'isolamento cerebrale o al trattamento delle larve di zebrafish con farmaci che inibiscono la pigmentazione per la registrazione di immagini ad alta risoluzione di neuroni nel loro ambiente in vivo. La qualità delle immagini registrate con questo metodo è paragonabile alle immagini provenienti da cervelli espiantati, ma in condizioni naturali.
Inoltre, si evita una perdita di intensità di fluorescenza, perché non è necessa...

Negli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) si è evoluto come uno degli organismi modello di vertebrati più popolari per gli studi sullo sviluppo embrionale e larvale. La grande fecondità delle femmine di zebrafish unita al rapido sviluppo ex utero dell'embrione e alla sua trasparenza durante le prime fasi di sviluppo embrionale sono solo alcuni dei fattori chiave che rendono il pesce zebra un potente organismo modello per affrontare le domande sullo sviluppo1. I progressi nelle tecnologie genetiche molecolari combinati con studi di imaging in vivo ad alta risoluzione hanno permesso di affrontare i meccanismi biologici cellulari alla base dei processi di sviluppo2. In particolare, nel campo della differenziazione neuronale, della fisiologia, della connettività e della funzione, zebrafish ha fatto luce sull'interazione tra dinamica molecolare, funzioni cerebrali e comportamento organismico con dettagli senza precedenti.
Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono limitati agli stadi embrionali e larvali precoci durante la prima settimana di sviluppo, poiché la trasparenza del tessuto del sistema nervoso viene progressivamente persa. In queste fasi, il tessuto cerebrale è impedito dall'accesso con approcci microscopici ad alta risoluzione che vengono schermati dalla differenziazione del cranio e dalla pigmentazione3.
Pertanto, le questioni chiave della differenziazione neuronale, della maturazione e della plasticità come il perfezionamento della connettività neuronale o il ridimensionamento sinaptico sono difficili da studiare. Questi processi cellulari sono importanti per definire i meccanismi cellulari che guidano, ad esempio, il comportamento sociale, il processo decisionale o il comportamento basato sulla motivazione, aree a cui la ricerca sui pesci zebra su larve di diverse settimane ha recentemente contribuito con risultati chiave basati su studi comportamentali4.
Gli approcci farmacologici per inibire la pigmentazione nelle larve di zebrafish per diverse settimane sono a malapena fattibili o possono persino causare effetti dannosi5,6,7,8. I ceppi mutanti doppi o tripli con specifici difetti di pigmentazione, come casper9 o crystal10, sono diventati strumenti tremendamente preziosi, ma sono laboriosi nell'allevamento, forniscono pochi figli e rappresentano il pericolo di accumulare malformazioni genetiche a causa di un'eccessiva consanguineità.
Qui, viene fornita una procedura minimamente invasiva come alternativa applicabile a qualsiasi ceppo di zebrafish. Questa procedura è stata adattata da studi elettrofisiologici per registrare l'attività neuronale nelle larve di zebrafish viventi e sveglie. Nei teleostei, la pelle e la cartilagine morbida del cranio possono essere accuratamente rimosse micro-peeling di questi strati, perché non sono strettamente intrecciati con la vascolarizzazione cerebrale. Ciò consente di esporre il tessuto cerebrale contenente neuroni e tratti assonali senza danni e di registrare la morfologia neuronale, comprese le strutture sinaptiche e il loro contenuto molecolare, che a sua volta include l'osservazione di cambiamenti fisiologici come transitori di Ca2+ o eventi di trasporto intracellulare per un massimo di diverse ore. Inoltre, al di là delle caratterizzazioni descrittive, l'accesso diretto al tessuto cerebrale consente l'interrogazione delle funzioni neuronali mature mediante la somministrazione di sostanze neurofarmacologiche e approcci optogenetici. Pertanto, le vere relazioni funzionali alla struttura possono essere rivelate nel cervello del pesce zebra giovanile utilizzando questa strategia di esposizione cerebrale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

Comprendere i cambiamenti effimeri che si verificano durante lo sviluppo e la maturazione del cervello richiede un'imaging dettagliato ad alta risoluzione nello spazio e nel tempo a risoluzione cellulare e subcellulare. I progressi nelle tecnologie molecolari e di imaging ci hanno permesso di ottenere numerose informazioni dettagliate sui meccanismi cellulari e molecolari dello sviluppo del cervello nell'embrione trasparente di zebrafish. Recentemente, i processi di raffinamento della connettività neuronale che si verificano in fasi larvali successive diverse settimane dopo la fecondazione, che sono ad esempio il controllo del comportamento sociale, il processo decisionale o il comportamento guidato dalla motivazione, si sono spostati al centro della ricerca. In queste fasi, la pigmentazione della pelle del pesce zebra interferisce con la penetrazione della luce nel tessuto cerebrale e le soluzioni per gli stadi embrionali, ad esempio l'inibizione farmacologica della pigmentazione, non sono più fattibili.
Pertanto, viene fornita una soluzione chirurgica minimamente invasiva per l'accesso al microscopio al cervello del pesce zebra sveglio che deriva da approcci elettrofisiologici. Nei teleostei, la pelle e la cartilagine cranica morbida possono essere accuratamente rimosse micro-peeling di questi strati, esponendo i neuroni sottostanti e i tratti assonali senza danni. Ciò consente di registrare la morfologia neuronale, comprese le strutture sinaptiche e il loro contenuto molecolare, e l'osservazione di cambiamenti fisiologici come i transitori di Ca2+ o gli eventi di trasporto intracellulare. Inoltre, è possibile interrogare questi processi mediante inibizione farmacologica o manipolazione optogenetica. Questo approccio di esposizione cerebrale fornisce informazioni sui cambiamenti strutturali e fisiologici nei neuroni, nonché sulla correlazione e l'interdipendenza di questi eventi nel tessuto cerebrale vivo nell'intervallo di minuti o ore. La tecnica è adatta per l'imaging cerebrale in vivo di larve di zebrafish fino a 30 giorni dopo la fecondazione, l'ultimo stadio di sviluppo testato finora. Fornisce quindi l'accesso a questioni importanti come il raffinamento e il ridimensionamento sinaptico, il trasporto assonale e dendritico, il targeting sinaptico del carico citoscheletrico o l'espressione locale dipendente dall'attività. Pertanto, è possibile prevedere un ampio utilizzo di questo approccio di montaggio e imaging.

Figura 3A,C mostrano una larva di 14 dpf della linea transgenica Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] con il cranio ancora intatto. Le cellule del pigmento nella pelle sovrapposta sono distribuite su tutta la testa e interferiscono con il segnale di fluorescenza nella regione di interesse (qui, cervelletto). Con la larva in questa condizione, non è possibile ottenere immagini ad alta risoluzione del cervello....

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In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Qui presentiamo un metodo per immaginare il cervello embrionale del pesce zebra in vivo fino agli stadi larvale e giovanile. Questa procedura microinvasiva, adattata da approcci elettrofisiologici, fornisce l'accesso ai dettagli cellulari e subcellulari del neurone maturo e può essere combinata con studi optogenetici e neurofarmacologici per caratterizzare la funzione cerebrale e l'intervento farmacologico.

Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Questo metodo consente la visualizzazione del cervello di Zebrafish in fasi larvali successive per consentire l'osservazione dell'architettura neuronale in modo altamente dettagliato in vivo che in precedenza non era possibile. Le cellule pigmentate, che sono emerse durante il successivo sviluppo larvale e impediscono al cervello di avere immagini chiare, non sono un problema con questo metodo perché vengono semplicemente rimosse. Con il metodo, dovrebbe essere possibile studiare i processi che si verificano nelle fasi successive durante lo sviluppo larvale del cervello, i processi che influiscono sulla plasticità sinaptica, sulla degenerazione dei neuroni o sulla loro rigenerazione.Prima di iniziare l'esperimento utilizzare un estrattore di micropipette per preparare aghi di vetro affilati e sottili da capillari di vetro. Quindi, utilizzare una pipetta pasteur di plastica per raccogliere la larva in una capsula di Petri di 90 millimetri di diametro contenente la soluzione appropriata. Trasferire la larva selezionata in una capsula di Petri di 35 millimetri di diametro contenente ACSF e posizionare un coperchio di vetro quadrato da 24 per 24 millimetri nel coperchio della capsula di Petri.Quindi aliquotare il volume di ACSF necessario per l'esperimento in una fiala appropriata per l'ossigenazione con carbogeno. Per incorporare la larva, utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire la larva anestetizzata in una camera di montaggio sotto uno stereomicroscopio. Se una larva è ancora in grado di muoversi, non usare il pesce per l'esperimento fino a quando il pesce non è completamente incapace di muoversi.Quando la larva è immobile, rimuovere con cura il mezzo in eccesso e aggiungere immediatamente almeno un millilitro di acarosio a bassa fusione sulla larva. Orienta il pesce zebra con la regione dorsale rivolta verso l'alto il più vicino possibile alla superficie dell'agarose. Se la larva verrà emersa utilizzando un microscopio invertito, dopo una solidificazione, tagliare l'agarose contenente la larva in un piccolo blocco cuboide.Per esporre il cervello per l'imaging, tagliare via l'agarose in eccesso sulla regione di interesse del cervello se necessario e utilizzare un ago di vetro per fare una piccola incisione attraverso la pelle vicino, ma non sopra, la regione di interesse senza penetrare troppo profondamente nel tessuto. Muovendo a malapena l'ago appena sotto la superficie della pelle, continua a fare tagli molto piccoli intorno alla regione di interesse fino a quando la pelle sopra la regione di interesse può essere rimossa o spinta da parte. Quando il tessuto è stato rimosso da tutti gli embrioni, aggiungere una piccola goccia di acarosio a bassa fusione alla camera di imaging precedentemente preparata di un microscopio invertito e utilizzare una piccola spatola per capovolgere il blocco di agarose cuboide di 180 gradi sulla goccia di agarose nella camera di imaging.Quando l'agarose si è solidificato, riempire la camera di imaging con ACSF fresco e iniziare a immaginare la larva. Qui si può osservare una larva transgenica intatta di 14 giorni dopo la fecondazione con il cranio ancora intatto. Come mostrato, le cellule pigmentate all'interno della pelle sovrapposta sono distribuite su tutta la testa, interferendo con il segnale fluorescente nella regione di interesse.Dopo l'intervento chirurgico al cranio aperto, l'area di interesse diventa liberamente accessibile per l'imaging dettagliato ad alta risoluzione. La barriera cutanea, cranica e/o emato-encefalica ostacolano anche la penetrazione di sostanze nel cervello, come illustrato dalla robusta colorazione del colorante nucleare osservata in queste cellule cerebrali solo dopo un intervento chirurgico al cranio aperto. Questi vantaggi si osservano anche a 30 giorni dopo la fecondazione.Nei pesci transgenici contenenti una vascolarizzazione cerebrale fluorescente dovuta all'espressione della proteina fluorescente rossa, mCherry, nelle cellule endoteliali, la codifica a colori ai valori di profondità della pila di immagini dimostra che anche i vasi sanguigni profondamente sepolti all'interno del cervello a quasi 250 micron sono ancora chiaramente visibili e rintracciabili. Quando si esegue questa procedura, tenere sempre presente che si tratta di un intervento chirurgico in un animale vivente. Pertanto, richiede rispetto e una mente focalizzata.Dopo questa procedura, la registrazione della morfologia neuronale, comprese le strutture sinaptiche, gli eventi fisiologici e di trasporto intracellulare può essere eseguita in larve più vecchie di sette giorni dopo la fecondazione. Con questa tecnica, speriamo di fornire un approccio che consenta di studiare anche i processi cellulari nel cervello che si verificano in fasi larvali successive e che sono coinvolti nello stabilire, ad esempio, comportamenti complessi come il comportamento sociale o il processo decisionale.

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L&#39;esposizione del Maiale CNS per l&#39;analisi istologica: Un manuale per la decapitazione, Teschio di apertura, e Cervello di rimozione

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etichettatura e imaging di placche amiloidi nel tessuto cerebrale utilizzando la curcumina polifenolo naturale

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Calcio dei periciti cerebrali e imaging emodinamico nei topi transgenici in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...