Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

特に、ティモ・フリッチの優れた動物ケアとヘルマン・ドーリング、モハメド・エルザイ、ソル・ポーズ・メンデス、ヤコブ・フォン・トロサ、コマリ・ヴァリシェッティ、バーバラ・ウィンターの皆様の支援に感謝します。また、Kösterラボの他のすべてのメンバーの皆様のフィードバックに感謝しています。このプロジェクトの一部は、ドイツ研究財団(DFG、KO1949/7-2)プロジェクト241961032(RWK)とブンデスミニウム・フュル・ビルドゥン・ウント・フォルシュン(BMBF;エラネットニューロンII CIPRESSプロジェクト01EW1520にJCM)が認められる。

ここに記載されているすべての動物の仕事は、法的規制(EU指令2010/63)に従っています。魚の維持と取り扱いは、地元当局と技術大学ブラウンシュヴァイクの動物福祉代表によって承認されています。
1. 人工脳脊髄液(ACSF)、低融解アガロース、鋭いガラス針の調製
<ol><li>蒸留水中の以下の濃度で記載された化学物質を溶解することによってACSFを準備します。134 mM NaCl (58.44...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).</li><li>Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

提示された方法は、脳の単離またはそれらの インビボ 環境でニューロンの高解像度画像を記録するための色素沈着を阻害する医薬品とゼブラフィッシュ幼虫の治療に代わるアプローチを提供する。この方法で記録された画像の品質は、自然な条件下で、植えられた脳からの画像に匹敵します。
さらに、固定剤18での治療は必要としないため、蛍?...

ここ数十年、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、胚性および幼虫発生研究のための最も人気のある脊椎動物モデル生物の一つとして進化してきました。初期胚発生期の胚の急速な 元子宮 の発達とその透明性と相まってゼブラフィッシュメスの大きな胎児性は、ゼブラフィッシュを発達の問題を和らげるための強力なモデル生物にする重要な要因のほんの一部である1。分子遺伝学的技術の進歩と高分解能 インビボ イメージング研究を組み合わせることで、発達過程の基礎となる細胞生物学的メカニズムに対処することが可能となった2.特に、神経細胞の分化、生理、接続性、機能の分野において、ゼブラフィッシュは、分子動力学、脳機能、および生物的挙動の相互作用をこれまでにない詳細に明示しています。
しかし、これらの研究のほとんどは、神経系組織の透明性が徐々に失われるため、発達の最初の週の間に胚および初期の幼虫段階に限定されている。これらの段階では、脳組織は、頭蓋骨の分化と色素沈着によって遮蔽される高分解能顕微鏡アプローチによってアクセスを妨げられる。
したがって、神経の分化、成熟、および神経の結合性の改良やシナプススケーリングなどの可塑性の主要な問題は研究が困難である。これらの細胞プロセスは、例えば、社会的行動、意思決定、または動機に基づく行動を駆動する細胞メカニズムを定義するために重要であり、数週間前の幼虫に関するゼブラフィッシュ研究が最近行動研究4に基づいて重要な知見を提供している領域。
ゼブラフィッシュ幼虫の色素沈着を数週間阻害する薬理学的アプローチは、ほとんど実現可能ではないか、5、6、7、8の有害な影響を引き起こす可能性さえある。キャスパー9や結晶10のような特定の色素沈着欠陥を有する二重または三重突然変異株は、非常に貴重な道具となっているが、繁殖に骨の折れる、少数の子孫を提供し、過剰な近親交配による遺伝的奇形を蓄積する危険性がある。
ここでは、任意のゼブラフィッシュ株に適用可能な代替として最小限の侵襲的手順が提供される。この手順は、生きていると目覚めたゼブラフィッシュ幼虫の神経活動を記録するために電気生理学的研究から適応されました.テレオストでは、皮膚および柔らかい頭蓋骨軟骨は、脳血管構造と密接に織り交ぜられていないため、これらの層をマイクロ剥離することによって慎重に除去することができる。これにより、ニューロンおよび軸索管を含む脳組織を損傷なく暴露し、シナプス構造とその分子内容物を含む神経形態を記録することができ、Ca2+ 過渡または細胞内輸送事象などの生理学的変化の観察を数時間まで含む。さらに、脳組織への直接的なアクセスは、記述的特徴付け以外にも、神経薬理学的物質の管理と光遺伝学的アプローチによる成熟した神経機能の問い合わせが可能です。したがって、この脳暴露戦略を用いて、真の構造機能関係を若年ゼブラフィッシュ脳で明らかにすることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

脳の発達と成熟の間に起こる一時的な変化を理解するには、細胞および細胞内解像度での空間と時間における詳細な高解像度イメージングが必要です。分子および画像技術の進歩により、透明ゼブラフィッシュ胚における脳の発達の細胞および分子メカニズムに関する多くの詳細な洞察を得ることができています。最近では、受精の数週間後に起こる神経細胞の結合性の改善プロセスは、例えば社会的行動、意思決定、動機づけによる行動の制御など、研究の焦点に移っています。これらの段階では、ゼブラフィッシュ皮膚の色素沈着は、脳組織への光の浸透を妨げ、胚性段階の溶液、例えば、色素沈着の薬理学的阻害は、もはや実現不可能である。
従って、目覚めたゼブラフィッシュの脳への顕微鏡アクセスのための低侵襲外科的解決は、電気生理学的アプローチに由来する提供される。テレオストでは、皮膚および柔らかい頭蓋骨軟骨は、これらの層をマイクロ剥離することによって慎重に除去することができ、根底にあるニューロンおよび軸索管を損傷することなく露出させる。これにより、シナプス構造とその分子内容を含む神経形態、およびCa2+ 過渡性または細胞内輸送事象などの生理学的変化の観察を記録することができます。さらに、薬理学的阻害または光遺伝学的操作によってこれらのプロセスの尋問が可能である。この脳暴露アプローチは、ニューロンの構造的および生理学的変化に関する情報だけでなく、分または時間の範囲で生きている脳組織におけるこれらの事象の相関関係および相互依存性に関する情報を提供する。この技術は、受精後30日までのゼブラフィッシュ幼虫のインビボ脳イメージングに適している、これまでにテストされた最新の発達段階。したがって、シナプスの洗練とスケーリング、軸索および樹状輸送、細胞骨格貨物のシナプスターゲティング、または局所活動依存式などの重要な質問へのアクセスを提供します。したがって、この取り付けおよびイメージングアプローチの幅広い使用が期待できます。

図3A、C トランスジェニックラインTg[-7.5Ca8:GFP] の14 dpf幼虫を示すbz12[15] 頭蓋骨はまだそのままです。重ね合わせの皮膚の色素細胞は頭全体に分布し、対象領域(ここでは小脳)における蛍光シグナルに干渉している。この状態では、この状態では、脳の高解像度画像を得ることは不可能です。 <strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

ここでは、幼虫および若年期までの生体内でゼブラフィッシュ胚性脳を画像化する方法を提示する。この微侵襲的な手順は、電気生理学的アプローチから適応され、成熟したニューロンの細胞および細胞内の詳細へのアクセスを提供し、脳機能および薬物介入を特徴付けるための光遺伝学および神経薬理学的研究と組み合わせることができる。

目覚めしたゼブラフィッシュ幼虫と頭蓋骨と皮膚除去による若年組織の完全に活性な脳組織のインビボイメージング

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

この方法は、後の幼虫段階でゼブラフィッシュの脳を視覚化し、これまで不可能であった生体内で非常に詳細な方法で神経アーキテクチャを観察することを可能にする。後の幼虫の発達中に出現し、脳の明確なイメージングを防ぐ色素細胞は、単に除去されるため、この方法では問題ありません。この方法では、脳の幼虫発達中に後期に起こるプロセス、シナプス可塑性、ニューロンの変性、またはそれらの再生に影響を与えるプロセスを研究することが可能であるべきである。実験を開始する前に、マイクロピペットプーラーを使用して、ガラスの毛細血管から鋭く薄いガラス針を準備します。次に、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、適切な溶液を含む直径90ミリメートルのペトリ皿に幼虫を集めます。選択した幼虫をACSFを含む直径35ミリメートルのペトリ皿に移し、24×24ミリメートル、正方形、ガラスカバースリップをペトリ皿蓋に入れます。その後、実験に必要なACSFの体積をカルボゲンとの酸素化に適したフィアルにアリコートする。幼虫を埋め込むには、パスツールピペットを使用して、麻酔した幼虫を実体顕微鏡下の取り付けチャンバーに移します。幼虫がまだ動くことができれば、魚が完全に動くことができないまで、実験に魚を使わないで下さいます。幼虫が不動の場合は、余分な培地を慎重に取り除き、すぐに少なくとも1ミリリットルの低融解アガロースを幼虫に加える。ゼブラフィッシュの向きを、後ろ地をできるだけアガロースの表面に近づけます。幼虫が反転顕微鏡を用いて画像化される場合は、固化後、幼虫を含むアガロースを小さな立方体ブロックにトリミングする。イメージングのために脳を露出させるために、必要に応じて関心のある脳領域の上に余分なアガロースをトリミングし、ガラス針を使用して、組織に深く浸透することなく、関心のある領域の近くの皮膚を小さな切開を行います。かろうじて皮膚表面の下に針を移動し、関心のある領域の皮膚が取り除かれるか、または脇に押し出すことができるまで、関心のある領域の周りに非常に小さなカットを慎重に行い続けます。組織がすべての胚から取り除かれたら、以前に調製された反転顕微鏡のイメージングチャンバーに低融解アガロースの小さな滴を加え、小さなヘラを使用して、画像チャンバーのアガロースドロップに180度の立方体アガロースブロックを反転させます。アガロースが固まったら、イメージングチャンバーに新鮮なACSFを充填し、幼虫のイメージングを開始します。ここでは、そのまま受精後14日間のトランスジェニック幼虫をそのまま頭蓋骨をそのまま観察することができる。図示のように、重ね合わせ皮膚内の色素細胞は頭全体に分布し、対象領域における蛍光シグナルを妨害する。開いた頭蓋骨の手術の後、対象領域は、詳細な高解像度イメージングのために自由にアクセスできるようになります。皮膚、頭蓋骨、または血液脳関門はまた、開いた頭蓋骨手術後にのみこれらの脳細胞で観察される堅牢な核色素染色によって示されるように、脳への物質の浸透を妨げる。これらの利点は、受精後30日でも観察される。赤い蛍光タンパク質の発現による蛍光脳血管構造を含むトランスジェニック魚では、mCherry、内皮細胞において、画像スタックの深さ値で色分けすると、脳内に深く埋もれた血管でさえも、250ミクロン近くまではっきりと見え、追跡可能であることを示している。この手順を実行する場合は、常にこれは生きている動物の手術であることを覚えておいてください。したがって、それは尊敬と焦点を当てた心を必要とします。この手順の後、シナプス構造を含む神経形態の記録、生理学的および細胞内輸送事象は、受精後7日以上経過した幼虫で行うことができる。この技術により、後の幼虫段階で起こる脳内の細胞プロセスを研究し、例えば社会的行動や意思決定などの複雑な行動の確立に関与するアプローチを提供したいと考えています。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

組織学的分析のための豚CNSの露出：斬首、スカルオープニングのためのマニュアル、および脳の取り外し

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

天然ポリフェノールクルクミンを用いた脳組織におけるアミロイドプラークの標識とイメージング

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

ラット脳組織の疎水性組織除去法

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...