Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

Vi takker spesielt Timo Fritsch for utmerket dyrepleie og Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti og Barbara Winter for deres hjelpsomme støtte. Vi er også takknemlige til alle de andre medlemmene av Köster-laboratoriet for deres tilbakemeldinger. Prosjektet ble delvis finansiert av det tyske forskningsstiftelsen (DFG, KO1949/7-2) prosjektet 241961032 (til RWK) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS prosjekt 01EW1520 til JCM) er anerkjent.

Alt dyrearbeid som er beskrevet her er i samsvar med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63). Vedlikehold og håndtering av fisk er godkjent av lokale myndigheter og av dyrevelferdsrepresentanten for Technische Universität Braunschweig.
1. Fremstilling av kunstig cerebro spinalvæske (ACSF), lav smeltende agarose og skarpe glassnåler
<ol><li>Forbered ACSF ved å oppløse de oppførte kjemikaliene ved å følge konsentrasjoner i destillert vann. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).</li><li>Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

Den presenterte metoden gir en alternativ tilnærming til hjerneisolasjon eller behandling av sebrafisk larver med legemidler som hemmer pigmentering for registrering av høyoppløselige bilder av nevroner i deres in vivo-miljø. Kvaliteten på bilder som er tatt med denne metoden, kan sammenlignes med bilder fra utplantede hjerner, men under naturlige forhold.
Videre unngås et tap i intensitet av fluorescens, fordi det ikke er behov for behandling med fikseringer18...

I løpet av de siste tiårene har sebrafisken (Danio rerio) utviklet seg som en av de mest populære virveldyrmodellorganismer for embryonale og larveutviklingsstudier. Den store fecundity av sebrafisk kvinner kombinert med den raske ex utero utviklingen av embryoet og dets gjennomsiktighet i tidlige embryonale utviklingsstadier er bare noen få nøkkelfaktorer som gjør sebrafisk til en kraftig modellorganisme for å kle opp utviklingsspørsmål1. Fremskritt innen molekylær genetisk teknologi kombinert med høyoppløselige in vivo-avbildningsstudier tillatt for å adressere cellebiologiske mekanismer som ligger til grunn for utviklingsprosesser2. Spesielt innen nevronal differensiering, fysiologi, tilkobling og funksjon har sebrafisk kastet lys over samspillet mellom molekylær dynamikk, hjernefunksjoner og organismisk oppførsel i enestående detalj.
Likevel er de fleste av disse studiene begrenset til embryonale og tidlige larvestadier i løpet av den første uken av utviklingen, da gjennomsiktigheten av nervesystemvevet gradvis går tapt. På disse stadiene forhindres hjernevev fra tilgang ved høyoppløselige mikroskopi tilnærminger blir skjermet av hodeskalledifferensiering og pigmentering3.
Derfor er viktige spørsmål om nevronal differensiering, modning og plastisitet som raffinement av nevrontilkobling eller synaptisk skalering vanskelig å studere. Disse cellulære prosessene er viktige for å definere cellulære mekanismer som driver, for eksempel sosial atferd, beslutningstaking eller motivasjonsbasert oppførsel, områder som sebrafiskforskning på flere uker gamle larver nylig har bidratt med viktige funn basert på atferdsstudier4.
Farmakologiske tilnærminger for å hemme pigmentering i sebrafisk larver i flere uker er knapt mulig eller kan til og med forårsake skadelige effekter5,6,7,8. Doble eller tredoble mutantstammer med spesifikke pigmenteringsfeil, som casper9 eller krystall10, har blitt enormt verdifulle verktøy, men er arbeidskrevende i avl, gir få avkom og utgjør faren for å akkumulere genetiske misdannelser på grunn av overdreven innavl.
Her er en minimal invasiv prosedyre som et alternativ gitt som gjelder for enhver sebrafiskstamme. Denne prosedyren ble tilpasset fra elektrofysiologiske studier for å registrere nevronal aktivitet i levende og våken sebrafisk larver. I teleoster kan hud og myk hodeskallebrusk forsiktig fjernes ved mikroskalling av disse lagene, fordi de ikke er tett vevd sammen med hjernens vaskulatur. Dette gjør det mulig å eksponere hjernevev som inneholder nevroner og axonale trakter uten skade og for registrering av nevronal morfologi, inkludert synaptiske strukturer og deres molekylære innhold, som igjen inkluderer observasjon av fysiologiske endringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthendelser i opptil flere timer. Videre, utover beskrivende karakteriseringer, muliggjør direkte tilgang til hjernevev forhør av modne nevronfunksjoner ved hjelp av nevrofarmakologisk substansadministrasjon og optogenetiske tilnærminger. Derfor kan ekte strukturfunksjonsrelasjoner avsløres i den juvenile sebrafiskhjernen ved hjelp av denne hjerneeksponeringsstrategien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

Å forstå de flyktige endringene som oppstår under hjerneutvikling og modning krever detaljert høyoppløselig avbildning i rom og tid ved cellulær og subcellulær oppløsning. Fremskritt innen molekylære og avbildningsteknologier har gjort det mulig for oss å få mange detaljerte innsikter i cellulære og molekylære mekanismer for hjerneutvikling i det gjennomsiktige sebrafiskembryoet. Nylig har prosesser for raffinering av nevronforbindelse som oppstår på senere larvestadier flere uker etter befruktning, som for eksempel er kontroll over sosial atferd, beslutningstaking eller motivasjonsdrevet oppførsel, beveget seg i fokus for forskning. På disse stadiene forstyrrer pigmentering av sebrafiskhuden lysinntrengning i hjernevev, og løsninger for embryonale stadier, for eksempel farmakologisk hemming av pigmentering, er ikke mulig lenger.
Derfor er en minimalt invasiv kirurgisk løsning for mikroskopitilgang til hjernen til våken sebrafisk gitt som er avledet fra elektrofysiologiske tilnærminger. I teleoster kan hud og myk hodeskallebrusk forsiktig fjernes ved mikroskalling av disse lagene, og utsetter underliggende nevroner og axonale trakter uten skade. Dette gjør det mulig å registrere nevronal morfologi, inkludert synaptiske strukturer og deres molekylære innhold, og observasjon av fysiologiske endringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthendelser. I tillegg er avhør av disse prosessene ved hjelp av farmakologisk inhibering eller optogenetisk manipulasjon mulig. Denne hjerneeksponeringsmetoden gir informasjon om strukturelle og fysiologiske endringer i nevroner, samt korrelasjon og gjensidig avhengighet av disse hendelsene i levende hjernevev i løpet av minutter eller timer. Teknikken er egnet for in vivo hjerneavbildning av sebrafisk larver opptil 30 dager etter befruktning, det siste utviklingsstadiet testet så langt. Det gir dermed tilgang til slike viktige spørsmål som synaptisk raffinement og skalering, axonal og dendritisk transport, synaptisk målretting av cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsavhengig uttrykk. Derfor kan en bred bruk for denne monterings- og bildemetoden forventes.

Figur 3A,C vise en 14 dpf larve av den transgene linjen Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] med skallen fortsatt intakt. Pigmentcellene i overleggshuden fordeles over hele hodet og forstyrrer fluorescenssignalet i interesseområdet (her cerebellum). Med larven i denne tilstanden er det ikke mulig å oppnå høyoppløselige bilder av hjernen. Figur 3B viser en larve av samme trans...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Her presenterer vi en metode for å avbilde sebrafisk embryonal hjerne in vivo upto larval og juvenile stadier. Denne mikroinvasive prosedyren, tilpasset elektrofysiologiske tilnærminger, gir tilgang til cellulære og subcellulære detaljer om moden nevron og kan kombineres med optogenetikk og nevrofarmakologiske studier for karakterisering av hjernefunksjon og legemiddelintervensjon.

In vivo avbildning av fullt aktivt hjernevev i våken sebrafisk larver og juveniler av hodeskalle og hudfjerning

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Denne metoden gjør det mulig å visualisere Zebrafish-hjernen i senere larvestadier for å tillate observasjon av nevronarkitekturen på en svært detaljert måte in vivo som tidligere ikke har vært mulig. Pigmentceller, som dukket opp under senere larvutvikling og forhindrer hjernen i å fjerne avbildning, er ikke noe problem med denne metoden fordi de bare fjernes. Med metoden bør det være mulig å studere prosesser som oppstår på senere stadier under larvalutvikling av hjernen, prosesser som påvirker synaptisk plastisitet, degenerasjon av nevroner eller regenerering.Før du begynner eksperimentet, bruk en mikropipettetrekker for å forberede skarpe, tynne glassnåler fra glasskapillærer. Deretter bruker du en pasteurpipette i plast for å samle larve i en Petri-tallerken med en diameter på 90 millimeter som inneholder riktig løsning. Overfør den valgte larven til en Petri-tallerken med en diameter på 35 millimeter som inneholder ACSF og legg et 24 x 24 millimeter, firkantet glassdeksel glir inn i Petri-parabolens lokk.Deretter aliquot volumet av ACSF nødvendig for eksperimentet i en passende phial for oksygenering med karbogen. For å legge inn larven, bruk en Pasteur pipette for å overføre den bedøvede larven til et monteringskammer under et stereomikroskop. Hvis noen larve fortsatt er i stand til å bevege seg, ikke bruk fisken til eksperimentet før fisken er helt ute av stand til å bevege seg.Når larven er immobil, fjern forsiktig overflødig medium og legg umiddelbart minst en milliliter lav smeltende agarose på larven. Orienter sebrafisken med dorsalområdet vendt opp så nær overflaten av agarose som mulig. Hvis larven vil bli avbildet ved hjelp av et omvendt mikroskop, etter en størkning, trim agarose som inneholder larven i en liten cuboid blokk.For å eksponere hjernen for avbildning, trim bort overflødig agarose over hjerneregionen av interesse etter behov og bruk en glassnål for å gjøre et lite snitt gjennom huden nær, men ikke over, interesseområdet uten å trenge for dypt inn i vevet. Knapt flytte nålen like under hudoverflaten, fortsett å forsiktig gjøre svært små kutt rundt området av interesse til huden over interesseområdet kan fjernes eller skyves til side. Når vevet er fjernet fra alle embryoene, legg til en liten dråpe lav smeltende agarose til det tidligere forberedte bildekammeret til et invertert mikroskop og bruk en liten spatel for å snu cuboid agarose blokken 180 grader på agarose-fallet i bildekammeret.Når agarose har størknet, fyll bildekammeret med fersk ACSF og begynn å forestille larven. Her kan en intakt 14 dager etter befruktning transgen larve med skallen fortsatt intakt observeres. Som vist fordeles pigmentcellene i overleggshuden over hele hodet, og forstyrrer fluorescerende signal i interesseområdet.Etter åpen hodeskalle kirurgi, området av interesse blir fritt tilgjengelig for detaljert høyoppløselig bildebehandling. Huden, skallen og eller blodhjernebarrieren hindrer også penetrasjon av stoffer i hjernen, som illustrert av den robuste kjernefysiske fargestofffargingen som ble observert i disse hjernecellene bare etter åpen hodeskallekirurgi. Disse fordelene observeres også ved 30 dager etter befruktning.I transgen fisk som inneholder en fluorescerende hjernevaskulatur på grunn av uttrykket av det røde fluorescerende proteinet, mCherry, i endotelceller, viser fargekoding ved dybdeverdiene i bildestakken at selv blodkar dypt begravet i hjernen til nesten 250 mikron fortsatt er tydelig synlige og sporbare. Når du utfører denne prosedyren, husk alltid at dette er en operasjon i et levende dyr. Derfor krever det respekt og et fokusert sinn.Etter denne prosedyren kan registrering av nevronal morfologi, inkludert synaptiske strukturer, fysiologiske og intracellulære transporthendelser utføres i larver eldre enn syv dager etter befruktning. Med denne teknikken håper vi å gi en tilnærming som gjør det mulig å studere også cellulære prosesser i hjernen som oppstår på senere larvestadier, og som er involvert i å etablere for eksempel slike komplekse atferd som sosial atferd eller beslutningstaking.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av Proprioceptors i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver og pupper

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Automatiserte høy gjennomstrømming Behavioral Analyser i sebrafisk Larver

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Eksponering av Pig CNS for Histologisk analyse: En håndbok for halshogging, Skull Åpning og Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Merking og Imaging av amyloid plaketter i Brain tissue bruke Natural polyphenol curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

En hydrofob vevsryddingsmetode for rottehjernevev

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantasjon av et kranialvindu for gjentatt in vivo-avbildning i våkne mus

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjernen pericyte kalsium og hemodynamisk avbildning i transgene mus i Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...