Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

Мы особенно благодарим Тимо Фрича за отличный уход за животными и Германа Дёринга, Мохамеда Эльсея, Сола Позе-Мендеса, Якоба фон Троту, Комали Валишетти и Барбару Винтер за их полезную поддержку. Мы также благодарны всем остальным сотрудникам лаборатории Köster за их отзывы. Проект частично финансировался Немецким исследовательским фондом (DFG, KO1949/7-2), проектом 241961032 (RWK) и Бундесминистериумом для Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS project 01EW1520 to JCM) признан.

Все работы с животными, описанные здесь, соответствуют правовым нормам (Директива ЕС 2010/63). Содержание и обращение с рыбой были одобрены местными властями и представителем по защите животных Технического университета Брауншвейга.
1. Препарат искусственной спинномозговой ...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).</li><li>Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

Представленный способ обеспечивает альтернативный подход к выделению мозга или обработке личинок рыбок данио фармацевтическими препаратами, ингибируя пигментацию для записи изображений нейронов с высоким разрешением в их среде in vivo. Качество изображений, записанных с помощью э...

За последние десятилетия рыбка данио(Danio rerio)эволюционировала как один из самых популярных модельных организмов позвоночных для эмбриональных и личиночных исследований развития. Большая плодовитость самок рыбок данио в сочетании с быстрым ex utero развитием эмбриона и его прозрачностью на ранних эмбриональных стадиях развития являются лишь несколькими ключевыми факторами, которые делают рыбок данио мощным модельным организмом для решения вопросов развития1. Достижения в области молекулярно-генетических технологий в сочетании с исследованиями изображений in vivo с высоким разрешением позволили обратиться к клеточным биологическим механизмам, лежащим в основе процессов развития2. В частности, в области дифференцировки нейронов, физиологии, связности и функции рыбки данио пролили свет на взаимодействие молекулярной динамики, функций мозга и поведения организма в беспрецедентных деталях.
Тем не менее, большинство из этих исследований ограничены эмбриональной и ранней личиночной стадиями в течение первой недели развития, поскольку прозрачность ткани нервной системы постепенно теряется. На этих этапах ткани мозга не доступ к микроскопии высокого разрешения, которые защищаются дифференцировка черепа и пигментацией3.
Поэтому ключевые вопросы дифференцировки нейронов, созревания и пластичности, такие как уточнение нейронной связности или синаптическое масштабирование, трудно изучать. Эти клеточные процессы важны для того, чтобы определить клеточные механизмы, управляющие, например, социальным поведением, принятием решений или поведением, основанным на мотивации, областями, в которые исследования рыбок данио на личинках в возрасте нескольких недель недавно внесли ключевые выводы, основанные на поведенческих исследованиях4.
Фармакологические подходы к ингибированию пигментации у личинок рыбок данио в течение нескольких недель едва осуществимы или могут даже вызвать пагубные последствия5,6,7,8. Двойные или тройные мутантные штаммы со специфическими дефектами пигментации, такие как каспер9 или кристалл10,стали чрезвычайно ценными инструментами, но трудоемки в разведении, дают мало потомства и представляют опасность накопления генетических пороков развития из-за чрезмерного инбридинга.
Здесь предусмотрена минимально инвазивная процедура в качестве альтернативы, которая применима к любому штамму рыбок данио. Эта процедура была адаптирована из электрофизиологических исследований для регистрации активности нейронов у живых и бодрствующий личинок рыбок данио. При телеостах кожа и мягкий хрящ черепа могут быть аккуратно удалены путем микроочистки этих слоев, поскольку они не плотно переплетаются с сосудистой оболочкой головного мозга. Это позволяет подвергать воздействию ткани мозга, содержащей нейроны и аксональные тракты, без повреждений и регистрировать морфологию нейронов, включая синаптические структуры и их молекулярное содержимое, которые, в свою очередь, включают наблюдение физиологических изменений, таких как переходные процессы Ca2 + или внутриклеточные транспортные события в течение нескольких часов. Более того, помимо описательных характеристик, прямой доступ к мозговой ткани позволяет исследовать зрелые нейронные функции с помощью введения нейрофармакологических веществ и оптогенетических подходов. Таким образом, истинные структурные функциональные отношения могут быть выявлены в мозге ювенильных рыбок данио, используя эту стратегию воздействия на мозг.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

Понимание эфемерных изменений, которые происходят во время развития и созревания мозга, требует детальной визуализации высокого разрешения в пространстве и времени с клеточным и субклеточным разрешением. Достижения в области молекулярных технологий и технологий визуализации позволили нам получить множество подробных сведений о клеточных и молекулярных механизмах развития мозга у прозрачного эмбриона рыбки данио. В последнее время процессы уточнения нейронной связности, которые происходят на более поздних личиночных стадиях через несколько недель после оплодотворения, которые, например, являются контролем социального поведения, принятием решений или поведением, основанным на мотивации, переместились в фокус исследований. На этих стадиях пигментация кожи рыбок данио препятствует проникновению света в ткани мозга, и растворы для эмбриональных стадий, например, фармакологическое ингибирование пигментации, больше не осуществимы.
Поэтому предоставляется минимально инвазивное хирургическое решение для микроскопии доступа к мозгу бодрствующих рыбок данио, которое получено из электрофизиологических подходов. В телеостах кожа и мягкий хрящ черепа могут быть аккуратно удалены путем микрочистки этих слоев, обнажая нижележащие нейроны и аксональные тракты без повреждений. Это позволяет регистрировать морфологию нейронов, включая синаптические структуры и их молекулярное содержимое, а также наблюдать физиологические изменения, такие как переходные процессы Ca2 + или внутриклеточные транспортные события. Кроме того, возможно опрашивание этих процессов с помощью фармакологического торможения или оптогенетических манипуляций. Этот подход к воздействию на мозг предоставляет информацию о структурных и физиологических изменениях в нейронах, а также о корреляции и взаимозависимости этих событий в живой ткани мозга в диапазоне минут или часов. Этот метод подходит для визуализации мозга in vivo личинок рыбок данио в течение 30 дней после оплодотворения, последнего этапа развития, проверенного до сих пор. Он, таким образом, обеспечивает доступ к таким важным вопросам, как синаптическая очистка и масштабирование, аксональный и дендритный транспорт, синаптическое нацеливание цитоскелетного груза или локальная активность-зависимая экспрессия. Таким образом, можно ожидать широкого использования этого подхода к монтажу и визуализации.

Рисунок 3A,С показать 14 dpf личинку трансгенной линии Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] с черепом, все еще неповрежденным. Пигментные клетки в накладной коже распределяются по всей голове и мешают сигналу флуоресценции в интересующей област...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Здесь мы представляем метод изображения эмбрионального мозга рыбок данио in vivo вплоть до личиночной и ювенильной стадий. Эта микроинвазивная процедура, адаптированная из электрофизиологических подходов, обеспечивает доступ к клеточным и субклеточным деталям зрелого нейрона и может сочетаться с оптогенетическими и нейрофармакологическими исследованиями для характеристики функции мозга и лекарственного вмешательства.

Визуализация in vivo полностью активной мозговой ткани у бодрствующих личинок рыбок данио и молоди путем удаления черепа и кожи

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Этот метод позволяет визуализировать мозг рыбок данио на более поздних личиночных стадиях, чтобы позволить наблюдать нейронную архитектуру очень подробным образом in vivo, что ранее было невозможно. Пигментные клетки, которые появились во время более позднего развития личинок и мешают мозгу четкой визуализации, не являются проблемой с этим методом, потому что они просто удаляются. С помощью метода должна быть возможность изучения процессов, которые происходят на более поздних стадиях во время личинкового развития мозга, процессов, влияющих на синаптическую пластичность, дегенерацию нейронов или их регенерацию.Перед началом эксперимента используйте съемник микропипетки для приготовления острых, тонких, стеклянных игл из стеклянных капилляров. Затем используйте пластиковую пипетку Пастера, чтобы собрать личинку в чашку Петри диаметром 90 миллиметров, содержащую соответствующий раствор. Переложите выбранную личинку на чашку Петри диаметром 35 миллиметров, содержащую ACSF, и поместите квадратную стеклянную крышку диаметром 24 на 24 миллиметра в крышку чашки Петри.Затем аликвотирует объем ACSF, необходимый для эксперимента, в соответствующий флак для оксигенации карбогеном. Чтобы встроить личинку, используйте пипетку Пастера для переноса обезболенной личинки в монтажную камеру под стереомикроскопом. Если какая-либо личинка все еще способна двигаться, не используйте рыбу для эксперимента, пока рыба полностью не сможет двигаться.Когда личинка неподвижна, осторожно удалите лишнюю среду и сразу же добавьте на личинку хотя бы один миллилитр низкоплавкой агарозы. Ориентируйте рыбок данио с дорсальной областью, обращенной вверх как можно ближе к поверхности агарозы. Если личинка будет изображена с помощью перевернутого микроскопа, после затвердевания обрежьте агарозу, содержащую личинку, в небольшой кубовидный блок.Чтобы подвергнуть мозг визуализации, обрежьте избыточную агарозу над интересующей областью мозга по мере необходимости и используйте стеклянную иглу, чтобы сделать небольшой разрез через кожу вблизи, но не над интересующей областью, не проникая слишком глубоко в ткань. Едва перемещая иглу прямо под поверхностью кожи, продолжайте осторожно делать очень маленькие надрезы вокруг интересующей области, пока кожа над интересующей областью не может быть удалена или отодвинуна в сторону. Когда ткань была удалена из всех эмбрионов, добавьте небольшую каплю низкоплавкой агарозы в ранее подготовленную камеру визуализации инвертированного микроскопа и используйте небольшой шпатель, чтобы перевернуть кубовидный блок агарозы на 180 градусов на каплю агарозы в камере визуализации.Когда агароза затвердеет, заполните камеру визуализации свежим ACSF и начните визуализацию личинки. Здесь может наблюдаться интактная 14-дневная трансгенная личинка после оплодотворения с еще неповрежденным черепом. Как показано, пигментные клетки внутри накладывающегося кожного отдела распределены по всей голове, мешая флуоресцентному сигналу в интересующей области.После операции на открытом черепе интересующая область становится свободно доступной для детальной визуализации с высоким разрешением. Барьер кожи, черепа и или гематоэнцефалических барьеров также препятствует проникновению веществ в мозг, о чем свидетельствует сильное окрашивание ядерным красителем, наблюдаемое в этих клетках мозга только после операции на открытом черепе. Эти преимущества наблюдаются и через 30 дней после оплодотворения.У трансгенных рыб, содержащих флуоресцентную сосудистую сеть мозга из-за экспрессии красного флуоресцентного белка mCherry, в эндотелиальных клетках цветовое кодирование на значениях глубины стека изображений демонстрирует, что даже кровеносные сосуды, глубоко погребенные в мозге почти до 250 микрон, все еще хорошо видны и прослеживаются. При выполнении этой процедуры всегда имейте в виду, что это операция у живого животного. Поэтому это требует уважения и сосредоточенного ума.После этой процедуры запись морфологии нейронов, включая синаптические структуры, физиологические и внутриклеточные транспортные события могут быть выполнены у личинок старше семи дней после оплодотворения. С помощью этой методики мы надеемся обеспечить подход, позволяющий изучать также клеточные процессы в головном мозге, которые происходят на более поздних личиночинках, и которые участвуют в установлении, например, такого сложного поведения, как социальное поведение или принятие решений.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Покадровый Живая съемка клонально Связанные нейронные клетки-предшественники в развивающихся данио рерио переднего мозга

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Автоматизированная Высокая пропускная Поведенческий анализ в личинки данио

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Одновременный<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Функциональное тестирование двух сетчатки по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Система электроретинограммы

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Воздействие на ЦНС Pig для гистологического анализа: Руководство для обезглавливания черепа Открытие и Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Маркировка и изображение амилоидных пластин в мозговой ткани с использованием природного полифенола куркумина

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Гидрофобный метод очистки тканей для ткани мозга крыс

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Имплантация краниального окна для повторной визуализации In Vivo у бодрствующих мышей

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Кальций и гемодинамическая визуализация перицитов головного мозга у трансгенных мышей In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...