Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

Agradecemos especialmente a Timo Fritsch por el excelente cuidado de los animales y a Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti y Barbara Winter por su útil apoyo. También estamos agradecidos a todos los demás miembros del laboratorio de Köster por sus comentarios. El proyecto fue financiado en parte por el proyecto de la Fundación Alemana de Investigación (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (a RWK) y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS proyecto 01EW1520 a JCM) es reconocido.

Todo el trabajo con animales descrito aquí está de acuerdo con las regulaciones legales (Directiva UE 2010/63). El mantenimiento y la manipulación de los peces han sido aprobados por las autoridades locales y por el representante de bienestar animal de la Technische Universität Braunschweig.
1. Preparación de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), agarosa de baja fusión y agujas de vidrio afiladas
<ol><li>Prepare el ACSF disolviendo los productos químicos enumerados a las siguie...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. 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F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

El método presentado proporciona un enfoque alternativo para el aislamiento cerebral o el tratamiento de larvas de pez cebra con productos farmacéuticos que inhiben la pigmentación para registrar imágenes de alta resolución de neuronas en su entorno in vivo. La calidad de las imágenes grabadas con este método es comparable a las imágenes de cerebros explantados, pero en condiciones naturales.
Además, se evita una pérdida de intensidad de fluorescencia, ya que no hay necesida...

En las últimas décadas, el pez cebra(Danio rerio)ha evolucionado como uno de los organismos modelo de vertebrados más populares para estudios de desarrollo embrionario y larvario. La gran fecundidad de las hembras de pez cebra junto con el rápido desarrollo ex utero del embrión y su transparencia durante las primeras etapas del desarrollo embrionario son solo algunos factores clave que hacen del pez cebra un poderoso organismo modelo para abordar las preguntas del desarrollo1. Los avances en las tecnologías genéticas moleculares combinados con estudios de imágenes in vivo de alta resolución permitieron abordar los mecanismos biológicos celulares subyacentes a los procesos de desarrollo2. En particular, en el campo de la diferenciación neuronal, la fisiología, la conectividad y la función, el pez cebra ha arrojado luz sobre la interacción de la dinámica molecular, las funciones cerebrales y el comportamiento organísmico con un detalle sin precedentes.
Sin embargo, la mayoría de estos estudios se restringen a etapas embrionarias y larvales tempranas durante la primera semana de desarrollo, ya que la transparencia del tejido del sistema nervioso se pierde progresivamente. En estas etapas, el tejido cerebral se ve impedido de acceder por los enfoques de microscopía de alta resolución quedando protegido por la diferenciación y pigmentación del cráneo3.
Por lo tanto, las cuestiones clave de la diferenciación neuronal, la maduración y la plasticidad, como el refinamiento de la conectividad neuronal o la escala sináptica, son difíciles de estudiar. Estos procesos celulares son importantes para definir los mecanismos celulares que impulsan, por ejemplo, el comportamiento social, la toma de decisiones o el comportamiento basado en la motivación, áreas a las que la investigación del pez cebra sobre larvas de varias semanas de edad ha contribuido recientemente con hallazgos clave basados en estudios de comportamiento4.
Los enfoques farmacológicos para inhibir la pigmentación en larvas de pez cebra durante varias semanas son apenas factibles o incluso pueden causar efectos perjudiciales5,6,7,8. Las cepas mutantes dobles o triples con defectos específicos de pigmentación, como casper9 o cristal10,se han convertido en herramientas tremendamente valiosas, pero son laboriosas en la reproducción, proporcionan poca descendencia y plantean el peligro de acumular malformaciones genéticas debido a la endogamia excesiva.
Aquí, se proporciona un procedimiento mínimamente invasivo como alternativa que es aplicable a cualquier cepa de pez cebra. Este procedimiento se adaptó a partir de estudios electrofisiológicos para registrar la actividad neuronal en larvas de pez cebra vivas y despiertas. En los teleóstos, la piel y el cartílago blando del cráneo se pueden eliminar cuidadosamente mediante la micro-peeling de estas capas, ya que no están estrechamente entrelazadas con la vasculatura cerebral. Esto permite exponer el tejido cerebral que contiene neuronas y tractos axonales sin daño y registrar la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas y su contenido molecular, que a su vez incluye la observación de cambios fisiológicos como transitorios de Ca2 + o eventos de transporte intracelular durante varias horas. Además, más allá de las caracterizaciones descriptivas, el acceso directo al tejido cerebral permite interrogar las funciones neuronales maduras mediante la administración de sustancias neurofarmacológicas y enfoques optogenéticos. Por lo tanto, las verdaderas relaciones de función de la estructura se pueden revelar en el cerebro juvenil del pez cebra utilizando esta estrategia de exposición cerebral.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

Comprender los cambios efímeros que ocurren durante el desarrollo y la maduración del cerebro requiere imágenes detalladas de alta resolución en el espacio y el tiempo a resolución celular y subcelular. Los avances en las tecnologías moleculares y de imágenes nos han permitido obtener numerosos conocimientos detallados sobre los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo cerebral en el embrión transparente de pez cebra. Recientemente, los procesos de refinamiento de la conectividad neuronal que ocurren en etapas larvales posteriores varias semanas después de la fertilización, que son, por ejemplo, el control del comportamiento social, la toma de decisiones o el comportamiento impulsado por la motivación, se han trasladado al foco de la investigación. En estas etapas, la pigmentación de la piel del pez cebra interfiere con la penetración de la luz en el tejido cerebral, y las soluciones para las etapas embrionarias, por ejemplo, la inhibición farmacológica de la pigmentación, ya no son factibles.
Por lo tanto, se proporciona una solución quirúrgica mínimamente invasiva para el acceso de microscopía al cerebro del pez cebra despierto que se deriva de enfoques electrofisiológicos. En los teleóstos, la piel y el cartílago blando del cráneo se pueden eliminar cuidadosamente mediante la micro-peeling de estas capas, exponiendo las neuronas subyacentes y los tractos axonales sin daño. Esto permite registrar la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas y su contenido molecular, y la observación de cambios fisiológicos como transitorios de Ca2+ o eventos de transporte intracelular. Además, es factible el interrogatorio de estos procesos mediante inhibición farmacológica o manipulación optogenética. Este enfoque de exposición cerebral proporciona información sobre los cambios estructurales y fisiológicos en las neuronas, así como la correlación e interdependencia de estos eventos en el tejido cerebral vivo en el rango de minutos u horas. La técnica es adecuada para imágenes cerebrales in vivo de larvas de pez cebra hasta 30 días después de la fertilización, la última etapa de desarrollo probada hasta ahora. Por lo tanto, proporciona acceso a cuestiones tan importantes como el refinamiento sináptico y la escala, el transporte axonal y dendrítico, la orientación sináptica de la carga citoesquelética o la expresión dependiente de la actividad local. Por lo tanto, se puede anticipar un amplio uso para este enfoque de montaje e imágenes.

Figura 3A,C muestran una larva de 14 dpf de la línea transgénica Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] con el cráneo aún intacto. Las células pigmentarias en la piel superpuesta se distribuyen por toda la cabeza y están interfiriendo con la señal de fluorescencia en la región de interés (aquí, cerebelo). Con la larva en esta condición, no es posible obtener imágenes de alta resolución del cerebro. ...

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In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Este método permite la visualización del cerebro del pez cebra en etapas larvales posteriores para permitir la observación de la arquitectura neuronal de una manera altamente detallada in vivo que antes no era posible. Las células pigmentarias, que surgieron durante el desarrollo larvario posterior e impiden que el cerebro se contaja las imágenes claras, no son un problema con este método porque simplemente se eliminan. Con el método, debería ser posible estudiar los procesos que ocurren en etapas posteriores durante el desarrollo larvario del cerebro, los procesos que impactan en la plasticidad sináptica, la degeneración de las neuronas o su regeneración.Antes de comenzar el experimento, use un extracdor de micropipetas para preparar agujas de vidrio afiladas y delgadas a partir de capilares de vidrio. A continuación, use una pipeta Pasteur de plástico para recolectar la larva en una placa de Petri de 90 milímetros de diámetro que contenga la solución adecuada. Transfiera la larva seleccionada a una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro que contenga ACSF y coloque un deslizamiento de vidrio cuadrado de 24 por 24 milímetros en la tapa de la placa de Petri.Luego, alícute el volumen de ACSF necesario para el experimento en un frasco apropiado para la oxigenación con carbógeno. Para incrustar la larva, use una pipeta Pasteur para transferir la larva anestesiada a una cámara de montaje debajo de un estereomitroscopio. Si alguna larva aún puede moverse, no use el pez para el experimento hasta que los peces sean completamente incapaces de moverse.Cuando la larva esté inmóvil, retire cuidadosamente el exceso de medio e inmediatamente agregue al menos un mililitro de agarosa de baja fusión sobre la larva. Oriente el pez cebra con la región dorsal mirando hacia arriba lo más cerca posible de la superficie de la agarosa. Si la larva será fotografiada usando un microscopio invertido, después de una solidificación, recorte la agarosa que contiene la larva en un pequeño bloque cuboide.Para exponer el cerebro para obtener imágenes, recorte el exceso de agarosa sobre la región cerebral de interés según sea necesario y use una aguja de vidrio para hacer una pequeña incisión a través de la piel cerca, pero no sobre, la región de interés sin penetrar demasiado profundamente en el tejido. Apenas moviendo la aguja justo debajo de la superficie de la piel, continúe haciendo cortes muy pequeños con cuidado alrededor de la región de interés hasta que la piel sobre la región de interés pueda ser removida o apartada. Cuando el tejido se haya extraído de todos los embriones, agregue una pequeña gota de agarosa de baja fusión a la cámara de imágenes previamente preparada de un microscopio invertido y use una pequeña espátula para voltear el bloque de agarosa cuboide 180 grados sobre la gota de agarosa en la cámara de imágenes.Cuando la agarosa se haya solidificado, llene la cámara de imágenes con ACSF fresco y comience a obtener imágenes de la larva. Aquí, se puede observar una larva transgénica intacta 14 días después de la fertilización con el cráneo aún intacto. Como se muestra, las células pigmentarias dentro de la piel superpuesta se distribuyen por toda la cabeza, interfiriendo con la señal fluorescente en la región de interés.Después de la cirugía de cráneo abierta, el área de interés se vuelve de libre acceso para obtener imágenes detalladas de alta resolución. La piel, el cráneo y/o la barrera hematoencefálica también dificultan la penetración de sustancias en el cerebro, como lo ilustra la robusta tinción de tinte nuclear observada en estas células cerebrales solo después de la cirugía de cráneo abierto. Estas ventajas también se observan a los 30 días después de la fertilización.En peces transgénicos que contienen una vasculatura cerebral fluorescente debido a la expresión de la proteína fluorescente roja, mCherry, en células endoteliales, la codificación por colores en los valores de profundidad de la pila de imágenes demuestra que incluso los vasos sanguíneos profundamente enterrados dentro del cerebro a casi 250 micras todavía son claramente visibles y rastreables. Al realizar este procedimiento siempre tenga en cuenta que se trata de una cirugía en un animal vivo. Por lo tanto, requiere respeto y una mente enfocada.Después de este procedimiento, el registro de la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas, los eventos fisiológicos y de transporte intracelular se puede realizar en larvas mayores de siete días después de la fertilización. Con esta técnica, esperamos proporcionar un enfoque que permita estudiar también los procesos celulares en el cerebro que ocurren en etapas larvales posteriores, y que están involucrados en el establecimiento, por ejemplo, de comportamientos tan complejos como el comportamiento social o la toma de decisiones.

Research

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To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...