Name: in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal
Uploaded: 2021-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

Özellikle timo Fritsch'e mükemmel hayvan bakımı için ve Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti ve Barbara Winter'a yardımsever destekleri için teşekkür ederiz. Köster laboratuvarının diğer tüm üyelerine de geri bildirimleri için minnettarız. Proje kısmen Alman Araştırma Vakfı (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (RWK'ya) ve Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projesi 01EW1520 to JCM) kabul edilmektedir.

Burada açıklanan tüm hayvan çalışmaları yasal düzenlemelere uygundur (AB Direktifi 2010/63). Balıkların bakımı ve elleçlenimi yerel yetkililer ve Technische Universität Braunschweig hayvan refahı temsilcisi tarafından onaylanmıştır.
1. Yapay serebro omurilik sıvısının (ACSF), düşük erime agarose ve keskin cam iğnelerin hazırlanması
<ol><li>Listelenen kimyasalları damıtılmış suda aşağıdaki konsantrasyonlarda eriterek ACSF'yi hazırlayın. 134 mM NaCl (58,4...

<ol>
	<li>Embryology. Zebrafish Development Available from: <a target="_blank" href="https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development">https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development</a> (2020)</li><li>Sassen, W. A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish.+Advances+in+Genomics+and+Genetics.">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics.</a> Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).</li><li>Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+stripes+as+a+model+for+vertebrate+colour+pattern+formation.">Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation.</a> Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).</li><li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+recognize+zebrafish+'affective'+behavior.">Time to recognize zebrafish 'affective' behavior.</a> Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS One. 6, 22991 (2011).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).</li><li>Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+disruption+in+zebrafish+(Danio+rerio)+larvae:+Different+molecular+response+patterns+lead+to+impaired+eye+development+and+visual+functions.">Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions.</a> Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).</li><li>White, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Burr, S. A., Leung, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curare+(d-Tubocurarine).">Curare (d-Tubocurarine).</a> Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).</li><li>Gesler, H. M., Hoppe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,6-bis(3-diethylaminopropoxy)+pyridazine+bismethiodide,+a+long-acting+neuromuscular+blocking+agent.">3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).</li><li>Furman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+tricaine+acts+preferentially+on+neural+voltage-gated+sodium+channels+and+fails+to+block+directly+evoked+muscle+contraction.">Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction.</a> PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).</li><li>Namikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neurodegenerative+spinocerebellar+ataxia+type+13+in+zebrafish+using+a+Purkinje+neuron+specific+tunable+coexpression+system.">Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system.</a> Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).</li><li>Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+models+of+synaptic+short+term+plasticity.">Theoretical models of synaptic short term plasticity.</a> Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Hobro, A., Smith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+context+dominates+output+from+purkinje+cell+functional+regions+during+reflexive+visuomotor+behaviours.">Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours.</a> eLife. 8, 42138 (2019).</li><li>Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+development+of+Purkinje+cell+excitability,+functional+cerebellar+circuit,+and+afferent+sensory+input+to+cerebellum+in+zebrafish.">Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish.</a> Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).</li><li>Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+cerebellar+Purkinje+cells+during+fictive+optomotor+behavior+in+larval+zebrafish.">Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).</li><li>Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+responses+of+Purkinje+neurons+and+roles+of+simple+spikes+during+associative+motor+learning+in+larval+zebrafish.">Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish.</a> eLife. 6, 22537 (2017).</li><li>Zehendner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate+hypoxia+followed+by+reoxygenation+results+in+blood-brain+barrier+breakdown+via+oxidative+stress-dependent+tight-junction+protein+disruption.">Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption.</a> PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).</li><li>Dhabhar, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short-term+stress+response+-+mother+nature's+mechanism+for+enhancing+protection+and+performance+under+conditions+of+threat,+challenge,+and+opportunity.">The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity.</a> Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).</li></ol>

Sunulan yöntem, beyin izolasyonuna veya zebra balığı larvalarının in vivo ortamlarında yüksek çözünürlüklü nöron görüntülerini kaydetmek için pigmentasyonu engelleyen farmasötiklerle tedavisine alternatif bir yaklaşım sağlar. Bu yöntemle kaydedilen görüntülerin kalitesi, ekilmiş beyinlerden gelen görüntülerle karşılaştırılabilir, ancak doğal koşullar altında.
Ayrıca, floresan yoğunluğunda bir kayıp önlenir, çünkü fiksatiflerle tedaviye ge...

Son yıllarda, zebra balığı (Danio rerio) embriyonik ve larva gelişimsel çalışmalar için en popüler omurgalı model organizmalardan biri olarak evrimleşmiştir. Zebra balığı dişilerinin büyük doğurganlığı, embriyonun hızlı ex utero gelişimi ve erken embriyonik gelişim aşamalarında şeffaflığı ile birleştiğinde, zebra balığını gelişimsel soruları ele almak için güçlü bir model organizma haline getiren sadece birkaç temel faktördür1. Moleküler genetik teknolojilerdeki gelişmeler, yüksek çözünürlüklü in vivo görüntüleme çalışmaları ile birlikte, gelişimsel süreçlerin altında kalan hücre biyolojik mekanizmalarının ele alınmasına izin verilir2. Özellikle, nöronal farklılaşma, fizyoloji, bağlantı ve işlev alanında zebra balığı, moleküler dinamiklerin, beyin fonksiyonlarının ve organizma davranışlarının benzeri görülmemiş ayrıntılarla etkileşimine ışık tutmaktadır.
Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu, sinir sistemi dokusunun şeffaflığı giderek kaybolduğundan, gelişimin ilk haftasında embriyonik ve erken larva aşamaları ile sınırlıdır. Bu aşamalarda, kafatası farklılaşması ve pigmentasyon ile korunan yüksek çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımları ile beyin dokusunun erişimi engellenir3.
Bu nedenle, nöronal farklılaşma, olgunlaşma ve nöronal bağlantının iyileştirilmesi veya sinaptik ölçekleme gibi plastisite ile ilgili temel soruların incelenmesi zordur. Bu hücresel süreçler, örneğin sosyal davranış, karar verme veya motivasyona dayalı davranış gibi hücresel mekanizmaları tanımlamak için önemlidir, zebra balığının birkaç haftalık larvalar üzerinde yaptığı araştırmaların son zamanlarda davranışsal çalışmalara dayanan temel bulgulara katkıda bulunduğu alanlar4.
Zebra balığı larvalarında pigmentasyonu birkaç hafta boyunca inhibe etmek için farmakolojik yaklaşımlar zar zor uygulanabilir veya hatta zararlı etkilere neden olabilir5,6,7,8. Casper9 veya kristal10gibi spesifik pigmentasyon kusurlarına sahip çift veya üçlü mutant suşları, çok değerli araçlar haline gelmiştir, ancak üremede zahmetlidir, az sayıda yavru sağlar ve aşırı akraba evliliği nedeniyle genetik malformasyonların birikmesi tehlikesi oluşturur.
Burada, herhangi bir zebra balığı türü için geçerli olan alternatif olarak minimal bir invaziv prosedür sağlanır. Bu prosedür, canlı ve uyanık zebra balığı larvalarında nöronal aktiviteyi kaydetmek için elektrofizyolojik çalışmalardan uyarlanmıştır. Teleostlarda, deri ve yumuşak kafatası kıkırdağı, beyin vaskülatıyla sıkıca iç içe olmadıkları için bu katmanların mikro soyulmasıyla dikkatlice çıkarılabilir. Bu, nöronlar ve aksonal yollar içeren beyin dokusunun hasar görmeden açığa çıkıp sinaptik yapılar ve moleküler içerikleri de dahil olmak üzere nöronal morfolojinin kaydedillenmesine izin verir, bu da Ca2+ geçicileri veya hücre içi taşıma olayları gibi fizyolojik değişikliklerin birkaç saate kadar gözlemini içerir. Ayrıca, tanımlayıcı nitelemelerin ötesinde, beyin dokusuna doğrudan erişim, nörofarmakolojik madde yönetimi ve optogenetik yaklaşımlar yoluyla olgun nöronal fonksiyonların sorgulanmasını sağlar. Bu nedenle, bu beyin maruziyet stratejisi kullanılarak yavru zebra balığı beyninde gerçek yapı fonksiyon ilişkileri ortaya çıkarılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A119.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Tubocurare</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2379-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 1</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary type 2</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip</td>
			<td>deltalab</td>
			<td>D102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fischer)</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>26764298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-Agarose</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>8050.55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (Hexahydrate)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC9000 GTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 1</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>Model PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-Puller type 2</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur-Pipettes 3ml</td>
			<td>A.Hartenstein</td>
			<td>20170718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Normapur</td>
			<td>28244262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>WB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm petri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821473001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of fully active brain tissue in awake zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal

Beyin gelişimi ve olgunlaşma sırasında meydana gelen kısa ömürlü değişiklikleri anlamak, hücresel ve hücre altı çözünürlükte uzay ve zamanda ayrıntılı yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerektirir. Moleküler ve görüntüleme teknolojilerindeki gelişmeler, şeffaf zebra balığı embriyosunda beyin gelişiminin hücresel ve moleküler mekanizmaları hakkında çok sayıda ayrıntılı içgörü elde etmemizi sağladı. Son zamanlarda, döllenmeden birkaç hafta sonra daha sonraki larva aşamalarında meydana gelen nöronal bağlantının iyileştirilmesi süreçleri, örneğin sosyal davranış, karar verme veya motivasyon odaklı davranışların kontrolü, araştırma odağına taşınmıştır. Bu aşamalarda, zebra balığı derisinin pigmentasyonu beyin dokusuna ışık penetrasyonunu engeller ve embriyonik aşamalar için çözümler, örneğin pigmentasyonun farmakolojik inhibisyonu artık mümkün değildir.
Bu nedenle, uyanık zebra balıklarının beynine mikroskopi erişimi için elektrofizyolojik yaklaşımlardan elde edilen minimal invaziv bir cerrahi çözüm sağlanır. Teleostlarda, cilt ve yumuşak kafatası kıkırdağı, bu katmanların mikro soyulmasıyla, alttaki nöronların ve aksonal yolların hasar görmeden açığa çıkarılmasıyla dikkatlice çıkarılabilir. Bu, sinaptik yapılar ve moleküler içerikleri de dahil olmak üzere nöronal morfolojinin kaydedilip Ca2+ geçici veya hücre içi taşıma olayları gibi fizyolojik değişikliklerin gözlemlenmesine izin verir. Ayrıca bu süreçlerin farmakolojik inhibisyon veya optogenetik manipülasyon ile sorgulanması mümkündür. Bu beyin maruziyeti yaklaşımı, nöronlardaki yapısal ve fizyolojik değişikliklerin yanı sıra bu olayların canlı beyin dokusunda dakika veya saat aralığında korelasyonu ve birbirine bağımlılıkları hakkında bilgi sağlar. Teknik, şimdiye kadar test edilen en son gelişim aşaması olan döllenmeden 30 güne kadar zebra balığı larvalarının in vivo beyin görüntülemesi için uygundur. Bu nedenle, sinaptik arıtma ve ölçekleme, aksonal ve dendritik taşıma, sitoskeletal kargonun sinaptik hedeflemesi veya yerel aktiviteye bağımlı ifade gibi önemli sorulara erişim sağlar. Bu nedenle, bu montaj ve görüntüleme yaklaşımı için geniş bir kullanım beklenebilir.

Şekil 3A,C transgenik çizginin 14 dpf larvasını göster Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] Kafatası hala sağlamken. Kaplama derisindeki pigment hücreleri başın her yerine dağılmıştır ve ilgi çekici bölgedeki floresan sinyaline müdahale etmektedir (burada, beyincik). Bu durumdaki larva ile beynin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek mümkün değildir. ?...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal at JoVE.com

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Bu yöntem, Zebra balığı beyninin daha sonraki larva aşamalarında görselleştirilmesine izin vererek nöronal mimarinin daha önce mümkün olmayan son derece ayrıntılı bir şekilde in vivo olarak gözlemlenmesine izin verir. Daha sonra larva gelişimi sırasında ortaya çıkan ve beynin net görüntülemesini engelleyen pigment hücreleri, basitçe çıkarıldığı için bu yöntemde sorun oluşturmaz. Yöntemle, beynin larva gelişimi sırasında daha sonraki aşamalarda meydana gelen süreçleri, sinaptik plastisiteyi etkileyen süreçleri, nöronların dejenerasyonunu veya yenilenmelerini incelemek mümkün olmalıdır.Deneye başlamadan önce cam kılcal damarlardan keskin, ince, cam iğneler hazırlamak için bir mikropipette puller kullanın. Daha sonra, larvaları uygun çözeltiyi içeren 90 milimetre çapında bir Petri kabına toplamak için plastik bir Pasteur pipet kullanın. Seçilen larvayı ACSF içeren 35 milimetre çapında bir Petri kabına aktarın ve Petri kabı kapağına 24 ila 24 milimetrelik kare, cam bir kapak kayması yerleştirin.Daha sonra deney için gereken ACSF hacmini karbojen ile oksijenlenme için uygun bir phial içine aliquot. Larvaları gömmek için, uyuşturulmuş larvayı stereomikroskop altında bir montaj odasına aktarmak için bir Pasteur pipet kullanın. Herhangi bir larva hala hareket edebiliyorsa, balıklar tamamen hareket edemeyene kadar deney için balıkları kullanmayın.Larva hareketsiz olduğunda, fazla ortamı dikkatlice çıkarın ve hemen larvaya en az bir mililitre düşük erime agaroz ekleyin. Zebra balığını sırt bölgesi agaroz yüzeyine mümkün olduğunca yakın olacak şekilde yönlendirin. Larva ters bir mikroskop kullanılarak görüntülenecekse, katılaştıktan sonra larvayı içeren agazozları küçük bir küboid bloğuna kırpın.Beyni görüntüleme için ortaya çıkarmak için, ilgi çekici beyin bölgesi üzerindeki fazla agaroseyu gerektiği gibi kesin ve dokuya çok derinlemesine nüfuz etmeden ilgi alanına yakın, ancak üzerinde olmayan ciltten küçük bir kesi yapmak için cam bir iğne kullanın. İğneyi cilt yüzeyinin hemen altında zar zor hareket ettirerek, ilgi alanı üzerindeki cilt çıkarılıncaya veya kenara itilene kadar ilgi alanı çevresinde çok küçük kesikler yapmaya devam edin. Doku tüm embriyolardan çıkarıldığında, ters bir mikroskobun daha önce hazırlanmış görüntüleme odasına küçük bir damla düşük erime agaz ekleyin ve küboid agarose bloğunu görüntüleme odasındaki agarose damlasına 180 derece çevirmek için küçük bir spatula kullanın.Agarose katılaştığında, görüntüleme odasını taze ACSF ile doldurun ve larvaları görüntülemeye başlayın. Burada, kafatası hala sağlam olan 14 günlük döllenme sonrası transgenik larva gözlemlenebilir. Gösterildiği gibi, kaplama derisi içindeki pigment hücreleri başın her yerine dağıtılır ve ilgi çekici bölgedeki floresan sinyaline müdahale eder.Açık kafatası ameliyatından sonra, ayrıntılı yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ilgi alanına serbestçe erişilebilir hale gelir. Deri, kafatası ve kan beyin bariyeri, bu beyin hücrelerinde sadece açık kafatası ameliyatından sonra gözlenen sağlam nükleer boya lekelemesinde gösterildiği gibi, maddelerin beyne nüfuz etmesine de engel olur. Bu avantajlar döllenme sonrası 30 günde de gözlenir.Kırmızı floresan proteinin ekspresyonu nedeniyle floresan beyin damarı içeren transgenik balıklarda, mCherry, endotel hücrelerinde, görüntü yığınının derinlik değerlerinde renk kodlaması, beynin içinde yaklaşık 250 mikrona kadar derinden gömülü olan kan damarlarının bile hala açıkça görülebildiği ve izlenebilir olduğunu göstermektedir. Bu işlemi yaparken her zaman bunun yaşayan bir hayvanda bir ameliyat olduğunu unutmayın. Bu nedenle, saygı ve odaklanmış bir zihin gerektirir.Bu işlemden sonra, gübreleme sonrası yedi günden daha eski larvalarda sinaptik yapılar, fizyolojik ve hücre içi taşıma olayları da dahil olmak üzere nöronal morfolojinin kaydı yapılabilir. Bu teknikle, beyinde daha sonraki larva aşamalarında meydana gelen ve örneğin sosyal davranış veya karar verme gibi karmaşık davranışların oluşturulmasında rol oynayan hücresel süreçleri de incelemeye izin veren bir yaklaşım sağlamayı umuyoruz.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Histolojik Analiz Domuz MSS Pozlama: Decapitation, Kafatası Açılış İçin El Kitabı ve Beyin Kaldırma

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Doğal Polifenol Curcumin Kullanarak Beyin Dokusunda Amiloid Plakların Etiketlenmesi ve Görüntülenmesi

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...