Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (1K22CA23763201 إلى H.Z. و GM118510 إلى D.M.C)ومؤسسة تشارلز كوفمان إلى H.Z. ويود المؤلفون أن يشكروا جيسون تونز على التدقيق في المخطوطة.

1. إنتاج خطوط الخلايا العابرة
<ol><li>ثقافة U2OS الخلايا المقبولة على 22 × 22 مم الزجاج coverslips (للتصوير الحي) أو 12 مم قطرها الأغطية الدائرية (لIF أو FISH) المغلفة بولي مد ليسين في لوحة 6-جيدا مع متوسط النمو (10٪ مصل البقر الجنين و 1٪ محلول البنسلين-ستريبتومايسين في DMEM) حتى تصل إلى 60-70٪ التقاء.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+in+the+nucleus.">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+DNA+repair+pathways+converge.">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li><li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination.">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

أظهر هذا البروتوكول تشكيل وانحلال المكثفات على التيلوميرات بنظام التعتيم الكيميائي. يتم رصد الحركية من فصل المرحلة والتيلومير الناجم عن الانصهار القطيرات التجمع مع التصوير الحي. يتم تحديد توطين المكثفات وتكوينها مع الحمض النووي السمك والبروتين IF.
هناك خطوتان حاسمتان في ه...

تخضع العديد من البروتينات والأحماض النووية لفصل المرحلة السائلة السائلة (LLPS) والتجمع الذاتي في المكثفات الجزيئية الحيوية لتنظيم الكيمياء الحيوية في الخلايا1،2. LLPS من البروتينات الكروماتين ملزمة يؤدي إلى تشكيل المكثفات التي ترتبط مع loci الجينوم محددة وتورطت في مختلف وظائف الكروماتين المحلية3. على سبيل المثال، LLPS من بروتين HP1 يكمن وراء تشكيل مجالات heterochromatin لتنظيم الجينوم4،5، LLPS من عوامل النسخ تشكل مراكز النسخ لتنظيم النسخ6، LLPS من mRNAs الوليدة والبروتين أمشاط متعددة الجنس يولد أجسام مكان الهستون لتنظيم نسخ ومعالجة الهستون mRNAs7.  ومع ذلك ، على الرغم من اكتشاف العديد من الأمثلة على المكثفات المرتبطة بالكروماتين ، فإن الآليات الأساسية لتشكيل المكثفات وتنظيمها ووظيفتها لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. على وجه الخصوص، ليست كل المكثفات المرتبطة الكروماتين تتشكل من خلال LLPS والتقييمات الدقيقة لتشكيل المكثفات في الخلايا الحية لا تزال هناك حاجة8،9. على سبيل المثال، يظهر بروتين HP1 في الماوس أن لديها سوى قدرة ضعيفة على تشكيل قطرات السائل في الخلايا الحية وم بؤر heterochromatin تتصرف كما الكريات البوليمرالمنهارة 10. لذلك ، فإن الأدوات اللازمة لحث المكثفات دي نوفو على الكروماتين في الخلايا الحية مرغوبة ، خاصة تلك التي تسمح باستخدام التصوير الحي والمقايسات الكيميائية الحيوية لمراقبة حركية تكوين المكثفات ، والخصائص الفيزيائية والكيميائية للمكثفات الناتجة ، والعواقب الخلوية لتشكيل المكثفات.
هذا البروتوكول تقارير نظام التعتيم الكيميائية للحث على المكثفات البروتين على الكروماتين11 (الشكل 1A). ويتكون المخمل من اثنين من الليجاندات المرتبطة التفاعل البروتين: تريميثوبريم (TMP) وهالو ليغند ويمكن أن يقلل من البروتينات تنصهر في مستقبلات cognate: Escherichia القولونية ديهيدروفوليت اختزال (eDHFR) وانزيم البكتيرية الألكيلديهالوجيناز (هالو انزيم), على التوالي12. التفاعل بين هالو ليغاند وإنزيم هالو هو التكافؤ، مما يسمح أنزيم هالو لاستخدامها كمرساة عن طريق دمجه إلى بروتين الربط الكروماتين لتجنيد بروتين فصل المرحلة تنصهر إلى eDHFR إلى الكروماتين. بعد التوظيف الأولي، زيادة التركيز المحلي للمرحلة فصل البروتين يمر تركيز الحرجة اللازمة لفصل المرحلة، وبالتالي نواة المكثفات في مرساة(الشكل 1B). عن طريق دمج البروتينات الفلورية (مثل mCherry و eGFP) إلى eDHFR و Halo ، يمكن تصور نواة ونمو المكثفات في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الفلوري. لأن التفاعل بين eDHFR و TMP غير تساهمي، يمكن إضافة TMP الحرة الزائدة للتنافس مع جهاز التعتيم لربط eDHFR. هذا وسوف الافراج عن بروتين فصل المرحلة من مرساة وحل المكثفات المرتبطة الكروماتين.
استخدمنا هذه الأداة للحث على دي نوفو promyelocytic سرطان الدم (PML) تشكيل الجسم النووي على التيلوميرات في الخلايا السرطانية التيلوميراز السلبية التي تستخدم إطالة بديلة من التيلوميرات (ALT) مسار لصيانة التيلومير13,14.  الهيئات النووية PML هي مقصورات غشاء أقل المشاركة في العديد من العمليات النووية15،16 ومترجمة بشكل فريد إلى التيلوميرات ALT لتشكيل APBs ، لأجسام PML المرتبطة التيلومير ALT17،18. التيلوميرات الكتلة داخل APBs، ويفترض أن توفر قوالب إصلاح لتوليف الحمض النووي التيلومير الموجهة homology في ALT19. في الواقع، تم الكشف عن تخليق الحمض النووي التيلومير في APBs وAPBs تلعب أدوارا أساسية في إثراء عوامل إصلاح الحمض النووي على التيلوميرات20،21. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء تجميع APB وتتجمع التيلومير داخل APBs غير معروفة. منذ يتم تعديل بروتينات التيلومير في خلايا ALT بشكل فريد من قبل معدل صغير يشبه في كل مكان (SUMOs)22، تحتوي العديد من مكونات APB على مواقع السومويل 22و23و24و25 و / أو الزخارف التفاعل السومو (SIMs)26،27 والتفاعلات سومو سيم محرك مرحلة الفصل28، افترضنا أن السومويل على التيلوميرات يؤدي إلى إثراء سومو / سيم التي تحتوي على البروتينات و وتؤدي تفاعلات السومو-سيم بين تلك البروتينات إلى فصل المرحلة.  يمكن تجنيد بروتين PML ، الذي يحتوي على ثلاثة مواقع للسومويليشن وموقع SIM واحد ، إلى التيلوميرات السومويلات لتشكيل APBs ويؤدي تجمع APBs السائل إلى تجمع التيلوميرات. لاختبار هذه الفرضية، استخدمنا نظام التعتيم الكيميائي لمحاكاة تشكيل APB الناجم عن السومويل عن طريق تجنيد SIM إلى التيلوميرات (الشكل 2A)11. يتم دمج GFP إلى Haloenzyme للتصور وبروتين TRF1 الملزم للتيلومير لترسيخ جهاز التعتيم على التيلوميرات. يتم دمج SIM إلى eDHFR و mCherry. ويتبع الحركية من تشكيل المكثفات والتيلومير الناجم عن الانصهار القطيرات التجمع مع التصوير بالخلايا الحية.  يتم عكس فصل المرحلة بإضافة TMP مجانية زائدة للتنافس مع ربط eDHFR. تستخدم الفلورة المناعية (IF) والفلورة في التهجين الموقعي (FISH) لتحديد تكوين المكثفات وارتباط التلوميريك. تجنيد SIM يثري سومو على التيلوميرات والمكثفات المستحثة تحتوي على PML وبالتالي فهي APBs. إن تجنيد متحول SIM لا يمكنه التفاعل مع SUMO لا يثري SUMO على التيلوميرات أو يحفز فصل المرحلة ، مما يشير إلى أن القوة الدافعة الأساسية لتكثيف APB هي التفاعل بين SUMO و SIM. الاتفاق مع هذه الملاحظة، بوليسومو-بوليسيم البوليمرات التي تنصهر إلى عامل الربط TRF2 RAP1 يمكن أن تحفز أيضا تشكيل APB29. بالمقارنة مع نظام الانصهار polySUMO-polySIM حيث يحدث فصل المرحلة طالما يتم إنتاج ما يكفي من البروتينات، فإن نهج التعتيم الكيميائي المعروض هنا يحفز فصل المرحلة عند الطلب وبالتالي يوفر دقة زمنية أفضل لرصد حركية فصل المرحلة وعملية تجميع التيلومير. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح نظام التضويض الكيميائي هذا بتوظيف بروتينات أخرى لتقييم قدرتها على الحث على فصل الطور وتتجمع التيلومير. على سبيل المثال ، يمكن للبروتين المضطرب الذي يتم تجنيده في التيلوميرات أيضا تشكيل قطرات وتلوميرات عنقودية دون تحفيز تكوين APB ، مما يشير إلى أن تجمع التيلومير مستقل عن كيمياء APB ويعتمد فقط على الخاصية السائلة APB11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

والمكثفات المرتبطة بالكروماتين متورطة في العديد من العمليات النووية، ولكن الآليات الأساسية لا تزال بعيدة المنال. يصف هذا البروتوكول نظام تضفير البروتين الناجم عن المواد الكيميائية لإنشاء المكثفات على التيلوميرات. ويتكون المخمل الكيميائي من اثنين من الليغندات المرتبطة التي يمكن أن يرتبط كل منها بالبروتين: هالو ليغند إلى هالو إنزيم وتريمثوبريم (TMP) إلى إعادة الاختزال الإشريكية القولونية (eDHFR)، على التوالي. الانصهار من إنزيم هالو إلى بروتين التيلومير المراسي ديميرز إلى التيلوميرات من خلال التعادل هالو ليغاند إنزيم ملزمة. ربط TMP إلى eDHFR المجندين eDHFR تنصهر المرحلة فصل البروتينات إلى التيلوميرات ويحفز تشكيل المكثفات. لأن TMP-eDHFR التفاعل غير التكافؤ، يمكن عكس التكثيف باستخدام TMP الحرة الزائدة للتنافس مع جهاز التعتيم لربط eDHFR. ويظهر مثال على تحفيز سرطان الدم النووي (PML) تشكيل الجسم النووي على التيلوميرات وتحديد نمو المكثفات، وانحلال، والتوطين وتكوينها. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للحث على المكثفات في مواقع الجينوم الأخرى عن طريق دمج هالو إلى بروتين يرتبط مباشرة بالكروماتين المحلي أو dCas9 الذي يستهدف الموضع الجينومي مع الحمض النووي الريبي الإرشادي. من خلال تقديم الدقة الزمنية المطلوبة للتصوير الحي للخلية الواحدة مع الحفاظ على فصل المرحلة في مجموعة من الخلايا لإجراء المقايسات الكيميائية الحيوية ، فإن هذه الطريقة مناسبة للتحقيق في كل من تكوين ووظيفة المكثفات المرتبطة بالكروماتين.

وتظهر الصور التمثيلية لتوطين السومو التي حددها التيلومير DNA FISH وبروتين السومو IF في الشكل 2. الخلايا مع تجنيد SIM أثرت SUMO1 و SUMO 2/3 على التيلوميرات مقارنة مع الخلايا مع تجنيد متحولة SIM. وهذا يشير إلى أن إثراء السومو الناجم عن تعتيم SIM على التيلوميرات يعتمد على تفاعلات SUMO-SIM.
<p class...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

يوضح هذا البروتوكول نظام تعتيم البروتين المستحث كيميائيا لإنشاء المكثفات على الكروماتين.  يتم إظهار تشكيل الجسم النووي لسرطان الدم البروميلوسيتيكي (PML) على التيلوميرات ذات الخافضات الكيميائية. يتم رصد نمو القطيرات وانحلالها وتوطينها وتكوينها من خلال تصوير الخلايا الحية والفلورة المناعية (IF) والفلورة في التهجين الموقعي (FISH).

المكثفات البروتينية الناجمة عن الديميرات الكيميائية على التيلوميرات

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

يصف هذا البروتوكول نظام التعتيم الكيميائي للحث على مكثفات البروتين على التيلوميرات. يمكن تكييفها بسهولة للحث على المكثفات على loci الجينوم الأخرى ، ومناسبة للتحقيق في تشكيل ووظيفة المكثفات المرتبطة الكروماتين. توفر هذه الطريقة الدقة الزمنية اللازمة لتصوير الخلايا الحية وتحافظ على فصل المرحلة في مجموعة الخلايا لإجراء المقاييس الكيميائية الحيوية.للبدء، حل الخافضات في DMSO في 10 ملليمولار وتخزينها في أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية في ناقص 80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. تمييع aliquot من 10 ملليمتر ملليمتر في متوسط التصوير إلى تركيز المخزون من 10 ميكرومولار وتخزينه في ناقص 20 درجة مئوية. عندما تكون جاهزة للاستخدام، تمييع الخافقات إلى تركيز العمل النهائي من 100 نانومولار في متوسط النمو أو وسيلة التصوير.البذور 10 إلى الخلايا الخامسة في نظارات غطاء دائري قطرها 12 ملليمتر المغلفة بولي مد ليسين في لوحة من ستة آبار. ثم قم بإعادة إصابة الخلايا بلازميدات هالو-GFP-TRF1 و mCherry-eDHFR-SIM أو mCherry-eDFR-SIM المتحولة وانتظر لمدة 24 إلى 48 ساعة قبل الشروع في الفلورسينسية المناعية. أضف 100 جهاز ديميرلار نانومولار مخفف إلى الخلايا واحتضنها في 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى خمس ساعات.بعد الحضانة، قم بإصلاح الخلايا في محلول PBS الذي يحتوي على 4٪ فورمالديهايد و0.1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيرمابيليز الخلايا. ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. ينزلق غطاء الغسيل مرتين مع 50 ميكرولتر من TBS-Tx ومرة واحدة مع 50 ميكرولتر من العازلة لتخفيف الأجسام المضادة.احتضان كل زلة غطاء مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة PML الأولية، المضادة للسومو-1، أو المضادة سومو-2 و 3 الأجسام المضادة في أربع درجات مئوية في غرفة رطبة بين عشية وضحاها. ينزلق غطاء الغسيل ثلاث مرات مع عازل تخفيف الأجسام المضادة لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المقيدة ، ثم احتضان الخلايا بأجسام مضادة ثانوية لمدة ساعة واحدة في صندوق مظلم في درجة حرارة الغرفة. بعد تلطيخ، يغسل الغطاء ينزلق ثلاث مرات مع TBS-TX.الشرائح التسمية عن طريق إضافة اثنين من ميكرولتر واحد ميكروغرام لكل ملليلتر DAPI، ثم الوجه الغطاء ينزلق أكثر ووضعها على إسقاط DAPI. يستنشق السوائل الزائدة من حافة زلة الغطاء. ختم الشريحة مع طلاء الأظافر، والسماح لها لتجف، وشطف الجزء العلوي من زلة الغطاء بالماء.ضع الشرائح في الثلاجة حتى التصوير. البذور 10 إلى الخلايا الخامسة على نظارات تغطية دائرية 12 ملليمتر المغلفة بولي-D-Lysine في لوحة من ستة آبار وtransfect لهم مع هالو-TRF1 و mCherry-eDHFR-SIM أو mCherry-eDHFR-SIM plasmids متحولة. إصلاح الخلايا مع 4٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسلها أربع مرات مع برنامج تلفزيوني.لIF-FISH، وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية وإعادة تثبيتها مع 4٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم غسلها أربع مرات مع برنامج تلفزيوني وتجفيف زلات الغطاء في سلسلة الإيثانول. احتضان زلات الغطاء مع 488 التيلومير C-PNA التحقيق في خمسة ميكرولتر من محلول التهجين في 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم احتضان الغطاء ينزلق بين عشية وضحاها في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. يغسل الغطاء ثلاث مرات مع عازلة غسل لمدة دقيقتين لكل غسل في درجة حرارة الغرفة وجبل لهم مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر DAPI في وسائل الإعلام المتصاعدة للتصوير.للتصوير الحي، قم بتركيب الغطاء في غرف مغناطيسية على مرحلة ساخنة في غرفة بيئية، مع الحفاظ على الخلايا في ملليلتر واحد من وسيط التصوير دون اللون الأحمر الفينول. إعداد المجهر وجهاز مراقبة البيئة كما هو موضح في المخطوطة النصية. تحديد موقع الخلايا مع إشارة GFP مشرق على التيلوميرات ونشر إشارة mCherry في السيتوسول.العثور على حوالي 20 خلية، وحفظ كل موقف مع معلومات XYZ، وإعداد المعلمات للتصوير الفاصل الزمني. استخدم تباعد 0.5 ميكرومتر لما مجموعه ثمانية ميكرومترات في Z وفترة زمنية مدتها خمس دقائق لمدة ساعتين إلى أربع ساعات لكل من قنوات GFP و mCherry. استخدام 30٪ من 594 نانومتر و 50٪ من كثافة الطاقة نانومتر 488، مع أوقات التعرض من 200 مللي ثانية وكسب الكاميرا من 300.بدء التصوير واتخاذ حلقة زمنية واحدة كما قبل التعتيم. ثم وقف التصوير مؤقتا، إضافة 0.5 ملليلتر من وسائل الإعلام التصوير التي تحتوي على 15 ميكرولتر من 10 ميكرومولار ديميريزر إلى غرفة التصوير، مع الحرص على عدم لمس المرحلة، واستئناف التصوير. عندما تكون جاهزة لعكس التعتيم، وقفة التصوير وإضافة 0.5 ملليلتر من وسائط التصوير التي تحتوي على اثنين من ميكرولتر من 100 ملليمولار TMP الأسهم إلى غرفة التصوير.استمر في تصوير الخلايا لمدة ساعة إلى ساعتين. للتصوير الثابت، استخدم إعداد المجهر نفسه مثل التصوير الحي، ولكن بدون تسخين المرحلة. حدد موقع حوالي 30 إلى 50 خلية مع الإشارة الحمراء لتحديد الخلايا المصابة.الحصول على الصور مع تباعد 0.3 ميكرومتر لما مجموعه ثمانية ميكرومتر في Z.Use 80٪ من 647 نانومتر، 80٪ من 561 نانومتر، و 70٪ من كثافة الطاقة نانومتر 488، مع أوقات التعرض من 600 مللي ثانية وكسب الكاميرا من 300. تم تحديد توطين السومو بالتلوميريك باستخدام حمض التيلومير DNA FISH والفلورة المناعية لبروتين سومو. الخلايا مع SIM تجنيد المخصب SUMO-1 و SUMO-2 و 3 مقارنة مع الخلايا مع تجنيد متحولة SIM، مما يشير إلى أن SIM التعتيم الناجم عن إثراء السومو على التيلوميرات يعتمد على التفاعلات بين السومو SIM.يتم عرض فيلم الفاصل الزمني من TRF-1 وSIM بعد التعتيم هنا. تم توظيف SIM بنجاح إلى التيلوميرات ، وأصبح كل من SIM و TRF-1 بؤر أكبر وأكثر إشراقا ، كما هو متوقع لتشكيل قطرة السائل والنمو. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ انصهار بؤر TRF-1، مما أدى إلى تجمع التيلومير، كما هو مبين في انخفاض عدد التيلومير وزيادة كثافة التيلومير مع مرور الوقت.وعلى النقيض من ذلك، تم تجنيد متحولة SIM إلى التيلوميرات بعد التعتيم، ولكنها لم تحفز أي تشكيل قطرة أو تجمع التيلومير، مما يشير إلى أن فصل المرحلة وتتجمع التيلومير مدفوع بتفاعلات SUMO-SIM. ولوحظ عكس فصل المرحلة وتتجمع التيلومير بعد إضافة فائض TMP الحرة. ارتفع عدد التيلومير وانخفضت كثافة التيلومير مع مرور الوقت.يتم عرض الصور التمثيلية ل APBs التي تم تحديدها بواسطة التيلومير DNA FISH وبروتين PML إذا هنا. الخلايا مع SIM تجنيدها لديها APBs أكثر من الخلايا مع متحولة SIM تجنيدها، مما يشير إلى المكثفات الناجمة عن التعتيم هي في الواقع APBs. عند تنفيذ هذا البروتوكول، لا تعرض أجهزة التعتيم الحساسة للضوء للضوء.العمل في غرفة مظلمة مع مصباح التي تنبعث منها الضوء الأحمر والتفاف الخلايا مع رقائق الألومنيوم أثناء الحضانة. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام وضع العلامات عن قرب لإنشاء قائمة شاملة من المكونات في المكثفات المستحثة. يمكن استخدام التصوير الحي لمتابعة ديناميكيات المكونات في المكثفات.يمكن أن تساعد هذه الطرق في تحديد أدوار التحكم في تكوين المكثفات.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

تصور وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام السيتوكروم C أوكسيديز / سكسينات نازعة (كوكس / SDH) مزدوجة وضع العلامات الكيمياء النسيجية

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

الحكمة البروتين: A منضدة لل<em&gt; في السيليكون</em&gt;<em&gt; دي نوفو</em&gt; تصميم الجزيئات الحيوية

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

الفرز الفائق للإرث القائم على البروتين في سيريفيسيا س.

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

الجمع بين المواد الكيميائية العابرة للربط والطيف الكتلي لمجمعات البروتين سليمة لدراسة الهندسة المعمارية لتجميعات فرعية متعددة البروتين

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...