Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health (1K22CA23763201 til H.Z., GM118510 til D.M.C.) og Charles E. Kaufman foundation til H.Z. Forfatterne vil gerne takke Jason Tones for korrekturlæsning af manuskriptet.

1. Produktion af forbigående cellelinjer
<ol><li>Kultur U2OS acceptor celler på 22 x 22 mm glas coverslips (til live imaging) eller 12 mm diameter cirkulære coverslips (for IF eller FISK) belagt med poly-D-lysin i 6-brønd plade med vækst medium (10% foster kvæg serum og 1% Penicillin-Streptomycin opløsning i DMEM), indtil de når 60-70% sammenløb.</li>
	<li>Udskift vækstmedium med 1 mL transfection medium (vækstmedium uden Penicillin-Streptomycin opløsning) før transfektion.</li>
	<li>For h...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+in+the+nucleus.">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+DNA+repair+pathways+converge.">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li><li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination.">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

Denne protokol demonstrerede dannelse og opløsning af kondensater på telomerer med et kemisk dimeriseringssystem. Kinetik af faseadskillelse og dråbefusionsinduceret telomereklynger overvåges med levende billeddannelse. Kondensat lokalisering og sammensætning bestemmes med DNA FISH og protein IF.
Der er to vigtige trin i denne protokol. Den første er at bestemme protein og dimerizer koncentration. Succesen med at fremkalde lokal faseadskillelse ved et genomisk græshoppe afhænger af sti...

Mange proteiner og nukleinsyrer gennemgår væske væske væskefaseadskillelse (LLPS) og samler sig selv i biomolekyllære kondensater for at organisere biokemi i cellerne1,2. LLPS af kromatinbindende proteiner fører til dannelse af kondensater, der er forbundet med specifikke genomiske loci og er impliceret i forskellige lokale kromatinfunktioner3. For eksempel, LLPS af HP1 protein ligger til grund for dannelsen af heterochromatin domæner til at organisere genomet4,5, LLPS af transskription faktorer danner transskription centre til at regulere transskription6, LLPS af spirende mRNAs og multi-sex kamme protein genererer histone locus organer til at regulere transskription og behandling af histone mRNAs7.  På trods af mange eksempler på kromatin-associerede kondensater, der opdages, forbliver de underliggende mekanismer for kondensatdannelse, regulering og funktion dårligt forstået. Især dannes ikke alle kromatin-associerede kondensater gennem LLPS , og omhyggelige evalueringer af kondensatdannelse i levende celler er stadig nødvendige8,9. For eksempel er HP1-protein i musen vist sig kun at have en svag evne til at danne flydende dråber i levende celler og heterochromatin foci opfører sig som kollapset polymer globules10. Derfor er værktøjer til at fremkalde de novo kondensater på kromatin i levende celler ønskelige, især dem, der tillader brug af levende billeddannelse og biokemiske analyser til at overvåge kinetikken af kondensatdannelse, de fysiske og kemiske egenskaber af de resulterende kondensater og de cellulære konsekvenser af kondensatdannelse.
Denne protokol rapporterer et kemisk dimeriseringssystem til at fremkalde proteinkondenater på kromatin11 (Figur 1A). Dimerizeren består af to forbundne protein-interagerende ligands: trimethoprim (TMP) og Halo ligand og kan dimerisere proteiner smeltet til cognate receptorer: Escherichia coli dihydrofolat reduktase (eDHFR) og en bakteriel alkyldehalogenase enzym (Halo enzym), henholdsvis12. Samspillet mellem Halo ligand og Halo enzym er kovalent, så Halo enzym kan bruges som anker ved at smelte det til en kromatin-bindende protein til at rekruttere en fase-adskille protein smeltet til eDHFR til kromatin. Efter den første rekruttering passerer den øgede lokale koncentration af den fase, der adskiller protein, den kritiske koncentration, der er nødvendig for faseadskillelse, og nukleter således et kondensat ved ankeret (figur 1B). Ved at sammensmelte fluorescerende proteiner (f.eks. mCherry og eGFP) til eDHFR og Halo kan nukleation og vækst af kondensater visualiseres i realtid med fluorescensmikroskopi. Da samspillet mellem eDHFR og TMP er ikke-kovalent, kan overskydende gratis TMP tilføjes for at konkurrere med dimerizeren til eDHFR-binding. Dette vil derefter frigive faseadskillelsesproteinet fra ankeret og opløse det kromatin-tilknyttede kondensat.
Vi brugte dette værktøj til at fremkalde de novo promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ dannelse på telomerer i telomerase-negative kræftceller, der bruger en alternativ forlængelse af telomerer (ALT) vej til telomere vedligeholdelse13,14.  PML nukleare organer er membran-mindre rum involveret i mange nukleare processer15,16 og er entydigt lokaliseret til ALT telomerer til at danne APBs, for ALT telomere-associerede PML organer17,18. Telomerer klynge i APBs, formentlig at give reparation skabeloner til homology-rettet telomere DNA syntese i ALT19. Faktisk telomere DNA syntese er blevet påvist i APBs og APBs spiller afgørende roller i berige DNA reparation faktorer på telomerer20,21. De mekanismer, der lå til grund for APB-samling og telomereklynger i APB'er, var imidlertid ukendte. Da telomereproteiner i ALT-celler er unikt modificeret af små allestedsnærværende-lignende modifikator (SUMOs)22, indeholder mange APB-komponenter sumoylationssteder 22,23,24,25 og / eller SUMO-interagerende motiver (SIMMs)26,27 og SUMO-SIM-interaktioner driver faseadskillelse28, vi hypotese, at sumoylation på telomerer fører til berigelse af SUMO / SIM indeholdende proteiner og SUMO-SIM interaktioner mellem disse proteiner fører til faseadskillelse.  PML protein, som har tre sumoylation steder og en SIM-site, kan rekrutteres til sumoylated telomerer til at danne APBs og sammensmeltning af flydende APBs fører til telomerer klyngedannelse. For at teste denne hypotese brugte vi det kemiske dimeriseringssystem til at efterligne sumoylationsinduceret APB-formation ved at rekruttere SIM til telomerer (Figur 2A)11. GFP er smeltet sammen til Haloenzym til visualisering og til telomerebindende protein TRF1 for at forankre dimerizeren til telomerer. SIM er smeltet til eDHFR og mCherry. Kinetik af kondensatdannelse og dråbefusionsinduceret telomereklynger følges med levende cellebilleddannelse.  Faseadskillelse vendes ved at tilføje overskydende gratis TMP for at konkurrere med eDHFR-binding. Immunfluorescence (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH) anvendes til at bestemme kondensatsammensætning og telomerisk forening. Rekruttering af SIM beriger SUMO på telomerer, og de inducerede kondensater indeholder PML og er derfor APB'er. Rekruttering af en SIM mutant, der ikke kan interagere med SUMO ikke berige SUMO på telomerer eller fremkalde fase adskillelse, hvilket indikerer, at den grundlæggende drivkraft for APB kondens er SUMO-SIM interaktion. Enig med denne observation, polySUMO-polySIM polymerer, der smeltede til en TRF2 bindende faktor RAP1 kan også fremkalde APB dannelse29. Sammenlignet med polySUMO-polySIM fusionssystemet, hvor faseadskillelse forekommer, så længe der produceres nok proteiner, fremkalder den kemiske dimeriseringsmetode, der præsenteres her, faseadskillelse efter behov og giver dermed bedre tidsmæssig opløsning til at overvåge kinetik af faseadskillelse og telomereklyngningsproces. Derudover tillader dette kemiske dimeriseringssystem rekruttering af andre proteiner til at vurdere deres evne til at fremkalde faseadskillelse og telomereklynger. For eksempel kan et uordnet protein rekrutteret til telomerer også danne dråber og klynge telomerer uden at fremkalde APB dannelse, hvilket tyder telomere klyngedannelse er uafhængig af APB kemi og kun er afhængig af APB flydende ejendom11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

Kromatin-associerede kondensater er impliceret i mange nukleare processer, men de underliggende mekanismer forbliver undvigende. Denne protokol beskriver et kemisk induceret protein dimeriseringssystem til at skabe kondensater på telomerer. Den kemiske dimerizer består af to forbundne ligands, der hver især kan binde sig til et protein: Halo ligand til Halo-enzym og trimethoprim (TMP) til henholdsvis E. coli dihydrofolat reduktase (eDHFR). Fusion af Halo enzym til en telomere protein ankre dimerizers til telomerer gennem kovalent Halo ligand-enzym bindende. Binding af TMP til eDHFR rekrutterer eDHFR-smeltet fase, der adskiller proteiner til telomerer og fremkalder kondensatdannelse. Da TMP-eDHFR interaktion er ikke-kovalent, kan kondens vendes ved hjælp af overskydende gratis TMP til at konkurrere med dimerizeren til eDHFR-binding. Et eksempel på at fremkalde promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ dannelse på telomerer og bestemmelse kondensat vækst, opløsning, lokalisering og sammensætning er vist. Denne metode kan let tilpasses til at fremkalde kondensater på andre genomiske steder ved at smelte Halo til et protein, der direkte binder sig til den lokale kromatin eller til dCas9, der er målrettet mod det genomiske græshoppe med en guide RNA. Ved at tilbyde den tidsmæssige opløsning, der kræves til enkeltcellet levende billeddannelse, samtidig med at faseadskillelsen i en population af celler til biokemiske analyser opretholdes, er denne metode velegnet til sondering af både dannelsen og funktionen af kromatin-associerede kondensater.

Repræsentative billeder af telomerisk lokalisering af SUMO identificeret ved telomere DNA FISH og SUMO protein IF er vist i figur 2. Celler med SIM rekruttering beriget SUMO1 og SUMO 2 / 3 på telomerer i forhold til celler med SIM mutant rekruttering. Dette indikerer, at SIM dimerization-induceret SUMO berigelse på telomerer afhænger af SUMO-SIM interaktioner.
En repræsentativ tid bortfalder film af TRF1 og SIM efter dimerization er vist i Video 1</st...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

Denne protokol illustrerer et kemisk induceret protein dimerization system til at skabe kondensater på kromatin.  Dannelsen af promyelocytic leukæmi (PML) nukleare organ på telomerer med kemisk dimerizers er demonstreret. Dråbevækst, opløsning, lokalisering og sammensætning overvåges med levende cellebilleddannelse, immunofluorescence (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH).

Kemisk dimerisering-induceret protein kondensater på telomerer

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Denne protokol beskriver det kemiske dimeriseringssystem for at fremkalde proteinkondenater på telomerer. Det kan let tilpasses til at fremkalde kondensater på andre genomiske loci, og er velegnet til sondering dannelsen og funktionen af kromatin tilknyttede kondensater. Denne metode tilbyder tidsmæssig opløsning, der kræves til levende cellebilleddannelse og opretholder faseadskillelse i populationen af celler til biokemiske analyser.Til at begynde med opløses dimerizers i DMSO ved 10 millimolar og opbevar dem i plastmikrocentrifugerør ved minus 80 grader Celsius til langtidsopbevaring. Fortynd en aliquot på 10 millimolar dimerizer i billedbehandling medium til en bestand koncentration på 10 mikromolar og gemme det på minus 20 grader Celsius. Når du er klar til brug, fortyndes dimerizers til en endelig arbejdskoncentration på 100 nanomolar i vækstmedium eller billedmedie.Seed 10 til de femte celler i 12 millimeter diameter cirkulære dækglas belagt med Poly-D-Lysin i en seks-brønd plade. Transfect derefter cellerne med Halo-GFP-TRF1 og mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDFR-SIM mutant plasmids og vent i 24 til 48 timer, før du fortsætter med at immunofluorescence. Tilsæt de fortyndede 100 nanomolar dimerizers til cellerne og inkuber dem i 37 grader Celsius i fire til fem timer.Efter inkubationen skal cellerne i PBS-opløsning indeholdende 4% formaldehyd og 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur for at permeabilisere cellerne. Vask derefter cellerne tre gange med PBS. Vaskedækslet glider to gange med 50 mikroliter TBS-Tx og en gang med 50 mikroliter antistoffortyndingsbuffer.Inkuber hvert dæksel med 50 mikroliter af primær anti-PML, anti-SUMO-1 eller anti-SUMO-2 og 3 antistof ved fire grader Celsius i et befugtet kammer natten over. Vaskedækken glider tre gange med antistoffortyndingbuffer for at fjerne ubundet primært antistof og inkuberer derefter cellerne med sekundært antistof i en time i en mørk boks ved stuetemperatur. Efter farvning glider vaskedækslet tre gange med TBS-Tx.Label slides ved at tilføje to mikroliter af et mikrogram per milliliter DAPI, derefter flip dækslet glider over og placere dem på DAPI drop. Aspirere ekstra væske fra kanten af dækslet slip. Forsegl rutsjebanen med neglelak, lad den tørre, og skyl toppen af dækslet slip med vand.Placer diasene i fryseren, indtil de billeddannelser. Seed 10 til de femte celler på 12 millimeter cirkulære dækbriller belagt med Poly-D-Lysin i en seks-brønd plade og transfect dem med Halo-TRF1 og mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutant plasmids. Fix cellerne med 4% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og vask dem fire gange med PBS.For IF-FISH skal cellerne pletters med primære og sekundære antistoffer og anbringe dem med 4% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, derefter vaske dem fire gange med PBS og dehydrere dækslerne i en ethanolserie. Inkuber dækslet glider med 488 telomere C-PNA sonde i fem mikroliter af hybridisering opløsning ved 75 grader Celsius i fem minutter, derefter inkubere dækslet glider natten over i et befugtet kammer ved stuetemperatur. Vask dækslet glider tre gange med vaskebuffer i to minutter pr. vask ved stuetemperatur, og monter dem med et mikrogram pr. milliliter DAPI i monteringsmedier til billeddannelse.For levende billeddannelse, montere dækslet glider i magnetiske kamre på et opvarmet stadium i et miljøkammer, opretholde cellerne i en milliliter billeddannelse medium uden phenol rød. Opsætning af mikroskop- og miljøkontrolapparatet som beskrevet i tekstmanuskriptet. Find celler med et lyst GFP-signal på telomererne og diffusivt mCherry-signal i cytosolen.Find omkring 20 celler, udenad hver position med XYZ-oplysningerne, og konfigurer parametre for time-lapse-billeddannelse. Brug 0,5 mikrometerafstand til i alt otte mikrometer i Z og fem minutters tidsinterval i to til fire timer for både GFP- og mCherry-kanaler. Brug 30 % af 594 nanometer og 50 % af 488 nanometereffektintensitet med eksponeringstider på 200 millisekunder og en kameraforøgelse på 300.Start billeddannelse og tage én gang loop som pre-dimerization. Sæt derefter billeddannelsen på pause, tilføj 0,5 milliliter billedmedier, der indeholder 15 mikroliter af 10 mikromolar dimerizer til billedbehandlingskammeret, idet du sørger for ikke at røre scenen og genoptage billeddannelse. Når du er klar til at vende dimerisering, pause billeddannelse og tilføje 0,5 milliliter billedbehandling medier, der indeholder to mikroliter af 100 millimolar lager TMP til billedbehandling kammer.Fortsæt med at billeddanne cellerne i en til to timer. For fast billeddannelse skal du bruge den samme mikroskopopsætning som live imaging, men uden sceneopvarmning. Find omkring 30 til 50 celler med det røde signal til at vælge for transfected celler.Indshent billeder med 0,3 mikrometerafstand for i alt otte mikrometer i Z.Use 80% af 647 nanometer, 80% af 561 nanometer og 70% af 488 nanometer effektintensitet, med eksponeringstider på 600 millisekunder og en kameragevinst på 300. Telomerisk lokalisering af SUMO blev identificeret ved hjælp af telomere DNA FISH og SUMO protein immunofluorescence. Celler med SIM rekruttering beriget SUMO-1 og SUMO-2 og 3 i forhold til celler med SIM mutant rekruttering, hvilket indikerer, at SIM dimerization induceret SUMO berigelse på telomerer afhænger af SUMO-SIM interaktioner.En time-lapse film af TRF-1 og SIM efter dimerization vises her. SIM blev med succes rekrutteret til telomerer, og både SIM og TRF-1 foci blev større og lysere, som forudsagt for flydende dråbedannelse og vækst. Derudover blev fusion af TRF-1 foci observeret, hvilket førte til telomere klyngedannelse, som vist i det reducerede telomeretal og øget telomereintensitet over tid.I modsætning hertil blev SIM mutant rekrutteret til telomerer efter dimerization, men ikke fremkalde nogen dråbedannelse eller telomere klyngedannelse, hvilket indikerer, at fase adskillelse og telomere klyngedannelse er drevet af SUMO-SIM interaktioner. Tilbageførsel af faseadskillelse og telomereklynger blev observeret efter tilsætning af overskydende gratis TMP. Telomeretallet steg, og telomerintensiteten faldt over tid.Repræsentative billeder af APBs identificeret ved telomere DNA FISH og PML protein IF er vist her. Celler med SIM rekrutteret har flere APBs end celler med SIM mutant rekrutteret, tyder dimerization induceret kondensater er faktisk APBs. Når du udfører denne protokol, må du ikke udsætte lysfølsomme dimerizers for lys.Arbejd i et mørkt rum med en lampe, der udsender rødt lys og wrap celler med aluminiumsfolie under inkubation. Efter denne procedure kan nærhedsmærkning bruges til at generere en omfattende liste over komponenter i det inducerede kondensat. Live imaging kan bruges til at følge dynamikken i komponenter i kondensatet.Disse metoder kan hjælpe med at bestemme rollerne for styring af kondensatsammensætningskontrol.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Visualisering af Mitokondriel Respiratorisk funktion ved hjælp af cytochrom C Oxidase / succinat dehydrogenase (COX / SDH) Dobbelt-mærkning Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein VISDOM: A Workbench for<em&gt; I silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design af biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisk kodede Molecular Probes at studere G-protein-koblede receptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Høj overførselshastighed Screening for Protein-baserede arv i S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Kombinere kemisk Cross-linking og massespektrometri af intakt proteinkomplekser at studere arkitektur af multi subunit Protein forsamlinger

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantificering af lokationsspecifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometrisk ved hjælp af Data-uafhængig erhvervelse massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...