Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (1K22CA23763201 tot H.Z., GM118510 tot D.M.C.) en Charles E. Kaufman Foundation tot H.Z. De auteurs willen Jason Tones bedanken voor het proeflezen van het manuscript.

1. Productie van voorbijgaande cellijnen
<ol><li>Kweek U2OS-acceptorcellen op glazen coverslips van 22 x 22 mm (voor live beeldvorming) of cirkelvormige coverslips met een diameter van 12 mm (voor IF of FISH) bedekt met poly-D-lysine in een 6-putplaat met groeimedium (10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing in DMEM) totdat ze 60-70% confluency bereiken.</li>
	<li>Vervang groeimedium door 1 ml transfectiemedium (groeimedium zonder penicilline-streptomycine-oplossing) voorafgaan...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+in+the+nucleus.">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+DNA+repair+pathways+converge.">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li><li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination.">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

Dit protocol demonstreerde de vorming en oplossing van condensaten op telomeren met een chemisch dimerisatiesysteem. Kinetiek van fasescheiding en druppel-fusie-geïnduceerde telomeerclustering worden gemonitord met live beeldvorming. Condensaatlokalisatie en samenstelling worden bepaald met DNA FISH en eiwit IF.
Er zijn twee cruciale stappen in dit protocol. De eerste is om de eiwit- en dimerizerconcentratie te bepalen. Het succes bij het induceren van lokale fasescheiding op een genomische l...

Veel eiwitten en nucleïnezuren ondergaan vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) en assembleren zichzelf tot biomoleculaire condensaten om de biochemie in cellen te organiseren1,2. LLPS van chromatine-bindende eiwitten leidt tot de vorming van condensaten die geassocieerd zijn met specifieke genomische loci en betrokken zijn bij verschillende lokale chromatinefuncties3. LLPS van HP1-eiwit ligt bijvoorbeeld ten grondslag aan de vorming van heterochromatinedomeinen om het genoom te organiseren4,5,LLPS van transcriptiefactoren vormt transcriptiecentra om transcriptie te reguleren6, LLPS van ontluikende mRNA's en multi-sex kammen eiwit genereert histon locus lichamen om de transcriptie en verwerking van histon mRNA's te reguleren7.  Ondanks vele voorbeelden van chromatine-geassocieerde condensaten die worden ontdekt, blijven de onderliggende mechanismen van condensaatvorming, regulatie en functie echter slecht begrepen. In het bijzonder worden niet alle chromatine-geassocieerde condensaten gevormd door LLPS en zorgvuldige evaluaties van condensaatvorming in levende cellen zijn nog steeds nodig8,9. Het HP1-eiwit in de muis blijkt bijvoorbeeld slechts een zwak vermogen te hebben om vloeistofdruppels in levende cellen te vormen en heterochromatine foci gedragen zich als ingeklapte polymeerbolletjes10. Daarom zijn hulpmiddelen om de novo condensaten op chromatine in levende cellen te induceren wenselijk, met name die welke het gebruik van live imaging en biochemische assays mogelijk maken om de kinetiek van condensaatvorming, de fysische en chemische eigenschappen van de resulterende condensaten en de cellulaire gevolgen van condensaatvorming te volgen.
Dit protocol rapporteert een chemisch dimerisatiesysteem om eiwitcondensaten op chromatine11 te induceren(figuur 1A). De dimerizer bestaat uit twee gekoppelde eiwit-interagerende liganden: trimethoprim (TMP) en Halo ligand en kan eiwitten dimmeriseren die zijn gefuseerd met de cognate receptoren: Escherichia coli dihydrofolaat reductase (eDHFR) en een bacterieel alkyldehalogenase-enzym (Halo-enzym), respectievelijk12. De interactie tussen Halo-ligand en Halo-enzym is covalent, waardoor Halo-enzym als anker kan worden gebruikt door het samen te smelten met een chromatinebindend eiwit om een fasescheidend eiwit te rekruteren dat is gefuseerd met eDHFR tot chromatine. Na de initiële rekrutering passeert een verhoogde lokale concentratie van het fasescheidende eiwit de kritische concentratie die nodig is voor fasescheiding en nucleeert zo een condensaat aan het anker (figuur 1B). Door fluorescerende eiwitten (bijv. mCherry en eGFP) te fuseren met eDHFR en Halo, kunnen nucleatie en groei van condensaten in realtime worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Omdat de interactie tussen eDHFR en TMP niet-covalent is, kan overtollig vrij TMP worden toegevoegd om te concurreren met de dimeerizer voor eDHFR-binding. Dit zal dan het fasescheidingseiwit uit het anker vrijgeven en het chromatine-geassocieerde condensaat oplossen.
We gebruikten deze tool om de novo promyelocytaire leukemie (PML) nucleaire lichaamsvorming op telomeren in telomerase-negatieve kankercellen te induceren die een alternatieve verlenging van telomeren (ALT) pathway gebruiken voor telomeeronderhoud13,14.  PML-nucleaire lichamen zijn membraanloze compartimenten die betrokken zijn bij veel nucleaire processen15,16 en zijn uniek gelokaliseerd voor ALT-telomeren om APBs te vormen, voor ALT-telomeer-geassocieerde PML-lichamen17,18. Telomeren clusteren binnen APB's, vermoedelijk om reparatiesjablonen te bieden voor homologie-gerichte telomeer-DNA-synthese in ALT19. Inderdaad, telomeer DNA-synthese is gedetecteerd in APBs en APBs spelen een essentiële rol bij het verrijken van DNA-reparatiefactoren op telomeren20,21. De mechanismen die ten grondslag liggen aan APB-assemblage en telomeerclustering binnen APB's waren echter onbekend. Aangezien telomeereiwitten in ALT-cellen uniek worden gemodificeerd door kleine ubiquitine-achtige modifier (SUMOs)22, bevatten veel APB-componenten sumillatieplaatsen 22,23,24,25 en / of SUMO-interacterende motieven (SIM's)26,27 en SUMO-SIM-interacties drijven fasescheiding28, we veronderstelden dat sumoyatie op telomeren leidt tot verrijking van SUMO / SIM-bevattende eiwitten en SUMO-SIM interacties tussen die eiwitten leiden tot fasescheiding.  PML-eiwit, dat drie sumoylation-sites en één SIM-site heeft, kan worden gerekruteerd om gecongloleerde telomeren te vormen om APBs te vormen en coalescentie van vloeibare APBs leidt tot clustering van telomeren. Om deze hypothese te testen, gebruikten we het chemische dimerisatiesysteem om sumillatie-geïnduceerde APB-formatie na te bootsen door SIM te rekruteren voor telomeren (Figuur 2A)11. GFP is gefuseerd met Halo-enzym voor visualisatie en met het telomeerbindende eiwit TRF1 om de dimerizer aan telomeren. SIM is gefuseerd met eDHFR en mCherry. Kinetiek van condensaatvorming en druppelfusie-geïnduceerde telomeerclustering worden gevolgd met live celbeeldvorming.  Fasescheiding wordt omgekeerd door overtollige vrije TMP toe te voegen om te concurreren met eDHFR-binding. Immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) worden gebruikt om de condensaatsamenstelling en telomerische associatie te bepalen. Recruiting SIM verrijkt SUMO op telomeren en de geïnduceerde condensaten bevatten PML en zijn daarom APBs. Het rekruteren van een SIM-mutant die niet kan interageren met SUMO verrijkt SUMO niet op telomeren of induceert geen fasescheiding, wat aangeeft dat de fundamentele drijvende kracht voor APB-condensatie SUMO-SIM-interactie is. In overeenstemming met deze observatie kunnen polySUMO-polySIM-polymeren die zijn gefuseerd tot een TRF2-bindingsfactor RAP1 ook APB-vorming29induceren. Vergeleken met het polySUMO-polySIM-fusiesysteem waarbij fasescheiding plaatsvindt zolang er voldoende eiwitten worden geproduceerd, induceert de chemische dimerisatiebenadering die hier wordt gepresenteerd fasescheiding op aanvraag en biedt dus een betere temporele resolutie om de kinetiek van fasescheiding en telomeerclusteringsproces te bewaken. Bovendien maakt dit chemische dimerisatiesysteem de rekrutering van andere eiwitten mogelijk om hun vermogen te beoordelen om fasescheiding en telomeerclustering te induceren. Een ongeorded eiwit dat wordt gerekruteerd voor telomeren kan bijvoorbeeld ook druppels en clustertelomeren vormen zonder APB-vorming te induceren, wat suggereert dat telomeerclustering onafhankelijk is van APB-chemie en alleen afhankelijk is van APB vloeibare eigenschap11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

Chromatine-geassocieerde condensaten zijn betrokken bij veel nucleaire processen, maar de onderliggende mechanismen blijven ongrijpbaar. Dit protocol beschrijft een chemisch geïnduceerd eiwitdimerisatiesysteem om condensaten op telomeren te creëren. De chemische dimerizer bestaat uit twee gekoppelde liganden die elk kunnen binden aan een eiwit: Halo ligand aan Halo-enzym en trimethoprim (TMP) aan E. coli dihydrofolaat reductase (eDHFR), respectievelijk. Fusie van Halo-enzym tot een telomeereiwit verankert dimerizers aan telomeren door covalente Halo-ligand-enzymbinding. Binding van TMP aan eDHFR rekruteert eDHFR-gefuseerde fasescheidende eiwitten aan telomeren en induceert condensaatvorming. Omdat de interactie tussen TMP en eDHFR niet-covalent is, kan condensatie worden omgekeerd door overtollige vrije TMP te gebruiken om te concurreren met de dimerizer voor eDHFR-binding. Een voorbeeld van het induceren van promyelocytaire leukemie (PML) nucleaire lichaamsvorming op telomeren en het bepalen van condensaatgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling wordt getoond. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om condensaten op andere genomische locaties te induceren door Halo te fuseren met een eiwit dat direct bindt aan het lokale chromatine of aan dCas9 dat is gericht op de genomische locus met een gids-RNA. Door de temporele resolutie te bieden die nodig is voor live beeldvorming met één cel met behoud van fasescheiding in een populatie van cellen voor biochemische assays, is deze methode geschikt voor het onderzoeken van zowel de vorming als de functie van chromatine-geassocieerde condensaten.

Representatieve beelden van telomerische lokalisatie van SUMO geïdentificeerd door telomeer DNA FISH en SUMO-eiwit IF zijn weergegeven in figuur 2. Cellen met SIM-rekrutering verrijkten SUMO1 en SUMO 2/3 op telomeren in vergelijking met cellen met SIM-mutantenrekrutering. Dit geeft aan dat SIM-dimerisatie-geïnduceerde SUMO-verrijking op telomeren afhankelijk is van SUMO-SIM-interacties.
Een representatieve timelapse film van TRF1 en SIM na dimerisatie wordt geto...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

Dit protocol illustreert een chemisch geïnduceerd eiwitdimeerisatiesysteem om condensaten op chromatine te maken.  De vorming van promyelocytaire leukemie (PML) nucleair lichaam op telomeren met chemische dimerizers is aangetoond. Druppelgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling worden gemonitord met live cell imaging, immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Chemische dimerisatie-geïnduceerde eiwitcondensaten op telomeren

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Dit protocol beschrijft het chemische dimerisatiesysteem om eiwitcondensaten op telomeren te induceren. Het kan gemakkelijk worden aangepast om condensaten op andere genomische loci te induceren en is geschikt voor het onderzoeken van de vorming en functie van chromatine-geassocieerde condensaten. Deze methode biedt temporele resolutie die nodig is voor levende celbeeldvorming en handhaaft fasescheiding in de populatie van cellen voor biochemische assays.Los om te beginnen dimerizers op in DMSO bij 10 millimolar en bewaar ze in plastic microcentrifugebuizen bij min 80 graden Celsius voor langdurige opslag. Verdun een aliquot van 10 millimolair dimerizer in beeldmedium tot een voorraadconcentratie van 10 micromolair en bewaar deze bij min 20 graden Celsius. Wanneer ze klaar zijn voor gebruik, verdunnen dimerizers tot een uiteindelijke werkconcentratie van 100 nanomolair in groeimedium of beeldmedium.Zaad 10 tot de vijfde cellen in 12 millimeter diameter cirkelvormige dekselglazen bedekt met Poly-D-Lysine in een zes-well plaat. Transfecteer vervolgens de cellen met de Halo-GFP-TRF1 en mCherry-eDHFR-SIM of mCherry-eDFR-SIM mutante plasmiden en wacht 24 tot 48 uur voordat u overgaat tot immunofluorescentie. Voeg de verdunde 100 nanomolaire dimerizers toe aan de cellen en incubeer ze in 37 graden Celsius gedurende vier tot vijf uur.Na de incubatie fixeert u de cellen in PBS-oplossing met 4% formaldehyde en 0,1% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te permeabiliseren. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS. Wasdeksel glijdt twee keer met 50 microliter TBS-Tx en één keer met 50 microliter antilichaamverdunningsbuffer.Incubeer elke afdekslip met 50 microliter primaire anti-PML, anti-SUMO-1 of anti-SUMO-2 en 3 antilichamen bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer 's nachts. Wasdeksel glijdt drie keer met antilichaamverdunningsbuffer om ongebonden primair antilichaam te verwijderen en incubeer vervolgens de cellen met secundair antilichaam gedurende één uur in een donkere doos bij kamertemperatuur. Na het beitsen glijdt de washoes drie keer uit met TBS-Tx.Label dia's door twee microliter van één microgram per milliliter DAPI toe te voegen, draai vervolgens de hoesjes om en plaats ze op de DAPI-druppel. Aspirateer extra vocht uit de rand van de afdekslip. Sluit de glijbaan af met nagellak, laat hem drogen en spoel de bovenkant van de afdekslip af met water.Plaats de dia's in de vriezer tot de beeldvorming. Zaai 10 tot de vijfde cellen op 12 millimeter ronde dekselglazen bedekt met Poly-D-Lysine in een zes-well plaat en transfecteer ze met Halo-TRF1 en mCherry-eDHFR-SIM of mCherry-eDHFR-SIM mutante plasmiden. Fixeer de cellen met 4% formaldehyde gedurende 10 minuten op kamertemperatuur en was ze vier keer met PBS.Voor IF-FISH, kleur de cellen met primaire en secundaire antilichamen en refix ze met 4% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, was ze vervolgens vier keer met PBS en droger de afdeksels uit in een ethanolserie. Incubeer de afdekzeilslips met de 488 telomeer C-PNA-sonde in vijf microliter hybridisatieoplossing bij 75 graden Celsius gedurende vijf minuten en incubeer vervolgens de afdekslips 's nachts in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Was de afdekhoesjes drie keer met wasbuffer gedurende twee minuten per wasbeurt op kamertemperatuur en monteer ze met één microgram per milliliter DAPI in montagemedia voor beeldvorming.Voor live beeldvorming monteert u de afdekkingsslips in magnetische kamers op een verwarmd podium in een omgevingskamer, waarbij de cellen in één milliliter beeldmedium worden gehandhaafd zonder fenolrood. Stel de microscoop en het omgevingscontroleapparaat in zoals beschreven in het teksthandschrift. Lokaliseer cellen met een helder GFP-signaal op de telomeren en diffuus mCherry-signaal in het cytosol.Zoek ongeveer 20 cellen, onthoud elke positie met de XYZ-informatie en stel parameters in voor time-lapse-beeldvorming. Gebruik een afstand van 0,5 micrometer voor een totaal van acht micrometer in Z en een tijdsinterval van vijf minuten gedurende twee tot vier uur voor zowel GFP- als mCherry-kanalen. Gebruik 30% van 594 nanometer en 50% van 488 nanometer vermogensintensiteit, met belichtingstijden van 200 milliseconden en een camerawinst van 300.Begin met het afbeelden en neem één tijdlus als voordimeerisatie. Pauzeer vervolgens de beeldvorming, voeg 0,5 milliliter beeldmedia met 15 microliter van 10 micromolaire dimerizer toe aan de beeldvormingskamer, zorg ervoor dat u het podium niet aanraakt en hervat de beeldvorming. Wanneer u klaar bent om dimerisatie om te keren, pauzeert u de beeldvorming en voegt u 0,5 milliliter beeldmedia met twee microliter van 100 millimolar stock TMP toe aan de beeldvormingskamer.Ga door met het in beeld brengen van de cellen gedurende één tot twee uur. Gebruik voor vaste beeldvorming dezelfde microscoopopstelling als live beeldvorming, maar zonder de podiumverwarming. Zoek ongeveer 30 tot 50 cellen met het rode signaal om te selecteren voor getransfecteerde cellen.Verkrijg beelden met een afstand van 0,3 micrometer voor een totaal van acht micrometer in Z.Gebruik 80% van 647 nanometer, 80% van 561 nanometer en 70% van 488 nanometer vermogensintensiteit, met belichtingstijden van 600 milliseconden en een camerawinst van 300. Telomerische lokalisatie van SUMO werd geïdentificeerd met behulp van telomeer DNA FISH en SUMO-eiwitimmunofluorescentie. Cellen met SIM-rekrutering verrijkten SUMO-1 en SUMO-2 en 3 in vergelijking met cellen met SIM-mutantrekrutering, wat aangeeft dat SIM-dimerisatie SUMO-verrijking op telomeren veroorzaakte, afhankelijk is van SUMO-SIM-interacties.Een time-lapse film van TRF-1 en SIM na dimerisatie wordt hier getoond. SIM werd met succes gerekruteerd voor telomeren en zowel SIM- als TRF-1-foci werden groter en helderder, zoals voorspeld voor de vorming en groei van vloeibare druppels. Bovendien werd fusie van TRF-1-foci waargenomen, wat leidde tot telomeerclustering, zoals blijkt uit het verminderde aantal telomeren en de verhoogde telomeerintensiteit in de loop van de tijd.Sim-mutant daarentegen werd na dimerisatie gerekruteerd naar telomeren, maar induceerde geen druppelvorming of telomeerclustering, wat aangeeft dat fasescheiding en telomeerclustering worden aangedreven door SUMO-SIM-interacties. De omkering van fasescheiding en telomeerclustering werd waargenomen na toevoeging van overtollig vrij TMP. Het aantal teloeren nam toe en de intensiteit van de telomeer nam in de loop van de tijd af.Representatieve afbeeldingen van APBs geïdentificeerd door telomeer DNA FISH en PML-eiwit IF worden hier getoond. Cellen met SIM gerekruteerd hebben meer APBs dan cellen met SIM-mutant gerekruteerd, wat suggereert dat dimerisatie-geïnduceerde condensaten inderdaad APBs zijn. Stel bij het uitvoeren van dit protocol geen lichtgevoelige dimerizers bloot aan licht.Werk in een donkere kamer met een lamp die rood licht uitstraalt en wikkel cellen met aluminiumfolie tijdens de incubatie. Volgens deze procedure kan nabijheidsetikettering worden gebruikt om een uitgebreide lijst met componenten in het geïnduceerde condensaat te genereren. Live imaging kan worden gebruikt om de dynamiek van componenten in het condensaat te volgen.Deze methoden kunnen helpen bij het bepalen van de rol van het regelen van condensaatsamenstellingscontrole.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Visualisatie van Mitochondriale respiratoire functie met behulp van cytochroom C Oxidase / succinaat dehydrogenase (COX / SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Proteïne WIJSHEID: Een Workbench voor<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Ontwerp van biomoleculen

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...