3.0K Views
•
08:52 min
•
April 12th, 2021
DOI :
April 12th, 2021
•0:04
Introduction
0:37
Dimerization on Telomeres
1:11
Immunofluorescence (IF)
3:02
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)
4:14
Imaging
6:23
Results: Chemical Dimerization to Induce Chromatin-associated Condensates
8:06
Conclusion
Transcript
Dit protocol beschrijft het chemische dimerisatiesysteem om eiwitcondensaten op telomeren te induceren. Het kan gemakkelijk worden aangepast om condensaten op andere genomische loci te induceren en is geschikt voor het onderzoeken van de vorming en functie van chromatine-geassocieerde condensaten. Deze methode biedt temporele resolutie die nodig is voor levende celbeeldvorming en handhaaft fasescheiding in de populatie van cellen voor biochemische assays.
Los om te beginnen dimerizers op in DMSO bij 10 millimolar en bewaar ze in plastic microcentrifugebuizen bij min 80 graden Celsius voor langdurige opslag. Verdun een aliquot van 10 millimolair dimerizer in beeldmedium tot een voorraadconcentratie van 10 micromolair en bewaar deze bij min 20 graden Celsius. Wanneer ze klaar zijn voor gebruik, verdunnen dimerizers tot een uiteindelijke werkconcentratie van 100 nanomolair in groeimedium of beeldmedium.
Zaad 10 tot de vijfde cellen in 12 millimeter diameter cirkelvormige dekselglazen bedekt met Poly-D-Lysine in een zes-well plaat. Transfecteer vervolgens de cellen met de Halo-GFP-TRF1 en mCherry-eDHFR-SIM of mCherry-eDFR-SIM mutante plasmiden en wacht 24 tot 48 uur voordat u overgaat tot immunofluorescentie. Voeg de verdunde 100 nanomolaire dimerizers toe aan de cellen en incubeer ze in 37 graden Celsius gedurende vier tot vijf uur.
Na de incubatie fixeert u de cellen in PBS-oplossing met 4% formaldehyde en 0,1% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te permeabiliseren. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS. Wasdeksel glijdt twee keer met 50 microliter TBS-Tx en één keer met 50 microliter antilichaamverdunningsbuffer.
Incubeer elke afdekslip met 50 microliter primaire anti-PML, anti-SUMO-1 of anti-SUMO-2 en 3 antilichamen bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer 's nachts. Wasdeksel glijdt drie keer met antilichaamverdunningsbuffer om ongebonden primair antilichaam te verwijderen en incubeer vervolgens de cellen met secundair antilichaam gedurende één uur in een donkere doos bij kamertemperatuur. Na het beitsen glijdt de washoes drie keer uit met TBS-Tx.
Label dia's door twee microliter van één microgram per milliliter DAPI toe te voegen, draai vervolgens de hoesjes om en plaats ze op de DAPI-druppel. Aspirateer extra vocht uit de rand van de afdekslip. Sluit de glijbaan af met nagellak, laat hem drogen en spoel de bovenkant van de afdekslip af met water.
Plaats de dia's in de vriezer tot de beeldvorming. Zaai 10 tot de vijfde cellen op 12 millimeter ronde dekselglazen bedekt met Poly-D-Lysine in een zes-well plaat en transfecteer ze met Halo-TRF1 en mCherry-eDHFR-SIM of mCherry-eDHFR-SIM mutante plasmiden. Fixeer de cellen met 4% formaldehyde gedurende 10 minuten op kamertemperatuur en was ze vier keer met PBS.
Voor IF-FISH, kleur de cellen met primaire en secundaire antilichamen en refix ze met 4% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, was ze vervolgens vier keer met PBS en droger de afdeksels uit in een ethanolserie. Incubeer de afdekzeilslips met de 488 telomeer C-PNA-sonde in vijf microliter hybridisatieoplossing bij 75 graden Celsius gedurende vijf minuten en incubeer vervolgens de afdekslips 's nachts in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Was de afdekhoesjes drie keer met wasbuffer gedurende twee minuten per wasbeurt op kamertemperatuur en monteer ze met één microgram per milliliter DAPI in montagemedia voor beeldvorming.
Voor live beeldvorming monteert u de afdekkingsslips in magnetische kamers op een verwarmd podium in een omgevingskamer, waarbij de cellen in één milliliter beeldmedium worden gehandhaafd zonder fenolrood. Stel de microscoop en het omgevingscontroleapparaat in zoals beschreven in het teksthandschrift. Lokaliseer cellen met een helder GFP-signaal op de telomeren en diffuus mCherry-signaal in het cytosol.
Zoek ongeveer 20 cellen, onthoud elke positie met de XYZ-informatie en stel parameters in voor time-lapse-beeldvorming. Gebruik een afstand van 0,5 micrometer voor een totaal van acht micrometer in Z en een tijdsinterval van vijf minuten gedurende twee tot vier uur voor zowel GFP- als mCherry-kanalen. Gebruik 30% van 594 nanometer en 50% van 488 nanometer vermogensintensiteit, met belichtingstijden van 200 milliseconden en een camerawinst van 300.
Begin met het afbeelden en neem één tijdlus als voordimeerisatie. Pauzeer vervolgens de beeldvorming, voeg 0,5 milliliter beeldmedia met 15 microliter van 10 micromolaire dimerizer toe aan de beeldvormingskamer, zorg ervoor dat u het podium niet aanraakt en hervat de beeldvorming. Wanneer u klaar bent om dimerisatie om te keren, pauzeert u de beeldvorming en voegt u 0,5 milliliter beeldmedia met twee microliter van 100 millimolar stock TMP toe aan de beeldvormingskamer.
Ga door met het in beeld brengen van de cellen gedurende één tot twee uur. Gebruik voor vaste beeldvorming dezelfde microscoopopstelling als live beeldvorming, maar zonder de podiumverwarming. Zoek ongeveer 30 tot 50 cellen met het rode signaal om te selecteren voor getransfecteerde cellen.
Verkrijg beelden met een afstand van 0,3 micrometer voor een totaal van acht micrometer in Z.Gebruik 80% van 647 nanometer, 80% van 561 nanometer en 70% van 488 nanometer vermogensintensiteit, met belichtingstijden van 600 milliseconden en een camerawinst van 300. Telomerische lokalisatie van SUMO werd geïdentificeerd met behulp van telomeer DNA FISH en SUMO-eiwitimmunofluorescentie. Cellen met SIM-rekrutering verrijkten SUMO-1 en SUMO-2 en 3 in vergelijking met cellen met SIM-mutantrekrutering, wat aangeeft dat SIM-dimerisatie SUMO-verrijking op telomeren veroorzaakte, afhankelijk is van SUMO-SIM-interacties.
Een time-lapse film van TRF-1 en SIM na dimerisatie wordt hier getoond. SIM werd met succes gerekruteerd voor telomeren en zowel SIM- als TRF-1-foci werden groter en helderder, zoals voorspeld voor de vorming en groei van vloeibare druppels. Bovendien werd fusie van TRF-1-foci waargenomen, wat leidde tot telomeerclustering, zoals blijkt uit het verminderde aantal telomeren en de verhoogde telomeerintensiteit in de loop van de tijd.
Sim-mutant daarentegen werd na dimerisatie gerekruteerd naar telomeren, maar induceerde geen druppelvorming of telomeerclustering, wat aangeeft dat fasescheiding en telomeerclustering worden aangedreven door SUMO-SIM-interacties. De omkering van fasescheiding en telomeerclustering werd waargenomen na toevoeging van overtollig vrij TMP. Het aantal teloeren nam toe en de intensiteit van de telomeer nam in de loop van de tijd af.
Representatieve afbeeldingen van APBs geïdentificeerd door telomeer DNA FISH en PML-eiwit IF worden hier getoond. Cellen met SIM gerekruteerd hebben meer APBs dan cellen met SIM-mutant gerekruteerd, wat suggereert dat dimerisatie-geïnduceerde condensaten inderdaad APBs zijn. Stel bij het uitvoeren van dit protocol geen lichtgevoelige dimerizers bloot aan licht.
Werk in een donkere kamer met een lamp die rood licht uitstraalt en wikkel cellen met aluminiumfolie tijdens de incubatie. Volgens deze procedure kan nabijheidsetikettering worden gebruikt om een uitgebreide lijst met componenten in het geïnduceerde condensaat te genereren. Live imaging kan worden gebruikt om de dynamiek van componenten in het condensaat te volgen.
Deze methoden kunnen helpen bij het bepalen van de rol van het regelen van condensaatsamenstellingscontrole.
Dit protocol illustreert een chemisch geïnduceerd eiwitdimeerisatiesysteem om condensaten op chromatine te maken. De vorming van promyelocytaire leukemie (PML) nucleair lichaam op telomeren met chemische dimerizers is aangetoond. Druppelgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling worden gemonitord met live cell imaging, immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved