Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von US National Institutes of Health (1K22CA23763201 bis H.Z., GM118510 bis D.M.C.) und Charles E. Kaufman Foundation bis H.Z. Die Autoren danken Jason Tones für das Korrekturlesen des Manuskripts.

1. Herstellung transienter Zelllinien
<ol><li>Kultur U2OS Akzeptorzellen auf 22 x 22 mm Glasdeckschichten (für Live-Bildgebung) oder kreisförmigen Decklippen mit 12 mm Durchmesser (für IF oder FISH), die mit Poly-D-Lysin in 6-Well-Platte mit Wachstumsmedium (10% fetales Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung in DMEM) beschichtet sind, bis sie eine Konfluenz von 60-70% erreichen.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Wachstumsmedium vor der Transfektion durch ein 1 ml Transfektionsmedium (Wachstumsm...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. 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M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

Dieses Protokoll demonstrierte die Bildung und Auflösung von Kondensaten auf Telomeren mit einem chemischen Dimerisierungssystem. Die Kinetik der Phasentrennung und das durch die Tröpfchenfusion induzierte Telomerclustering werden mit Live-Bildgebung überwacht. Kondensatlokalisierung und -zusammensetzung werden mit DNA FISH und Protein IF bestimmt.
Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Die erste besteht darin, die Protein- und Dimerizerkonzentration zu bestimmen. Der Erfolg b...

Viele Proteine und Nukleinsäuren durchlaufen eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) und setzen sich selbst zu biomolekularen Kondensaten zusammen, um die Biochemie in den Zellen1,2zu organisieren. LLPS von Chromatin-bindenden Proteinen führt zur Bildung von Kondensaten, die mit spezifischen genomischen Loci assoziiert sind und an verschiedenen lokalen Chromatinfunktionen beteiligt sind3. Zum Beispiel liegt LLPS des HP1-Proteins der Bildung von Heterochromatindomänen zugrunde, um das Genom zu organisieren4,5, LLPS von Transkriptionsfaktoren bildet Transkriptionszentren zur Regulierung der Transkription6, LLPS von entstehenden mRNAs und multisexuellem Kämmprotein erzeugt Histon-Locus-Körper, um die Transkription und Verarbeitung von Histon-mRNAs zu regulieren7.  Trotz vieler Beispiele für chromatin-assoziierte Kondensate sind die zugrunde liegenden Mechanismen der Kondensatbildung, -regulierung und -funktion jedoch nach wie vor wenig verstanden. Insbesondere werden nicht alle Chromatin-assoziierten Kondensate durch LLPS gebildet und sorgfältige Auswertungen der Kondensatbildung in lebenden Zellen sind noch erforderlich8,9. Zum Beispiel wird gezeigt, dass HP1-Protein in der Maus nur eine schwache Fähigkeit hat, flüssige Tröpfchen in lebenden Zellen zu bilden, und Heterochromatinherde verhalten sich wie kollabierte Polymerkügelchen10. Daher sind Werkzeuge zur Induktion von De-novo-Kondensaten auf Chromatin in lebenden Zellen wünschenswert, insbesondere solche, die die Verwendung von Live-Imaging und biochemischen Assays ermöglichen, um die Kinetik der Kondensatbildung, die physikalischen und chemischen Eigenschaften der resultierenden Kondensate und die zellulären Folgen der Kondensatbildung zu überwachen.
Dieses Protokoll berichtet von einem chemischen Dimerisierungssystem, um Proteinkondensate auf Chromatin11 zu induzieren (Abbildung 1A). Der Dimerizer besteht aus zwei miteinander verbundenen protein-interagierenden Liganden: Trimethoprim (TMP) und Halo-Ligand und kann Proteine dimerisieren, die mit den verwandten Rezeptoren verschmolzen sind: Escherichia coli dihydrofolat-Reduktase (eDHFR) und ein bakterielles Alkyldehalogenase-Enzym (Halo-Enzym), jeweils12. Die Interaktion zwischen Halo-Ligand und Halo-Enzym ist kovalent, so dass das Halo-Enzym als Anker verwendet werden kann, indem es mit einem Chromatin-bindenden Protein verschmolzen wird, um ein phasenseparierendes Protein zu rekrutieren, das mit eDHFR zu Chromatin verschmolzen ist. Nach der anfänglichen Rekrutierung übergibt eine erhöhte lokale Konzentration des phasenseparierenden Proteins die für die Phasentrennung erforderliche kritische Konzentration und keimt somit ein Kondensat am Anker ein (Abbildung 1B). Durch die Verschmelzung fluoreszierender Proteine (z.B. mCherry und eGFP) zu eDHFR und Halo können Keimbildung und Wachstum von Kondensaten in Echtzeit mit Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Da die Interaktion zwischen eDHFR und TMP nicht kovalent ist, kann überschüssiges freies TMP hinzugefügt werden, um mit dem Dimerizer für die eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Dadurch wird dann das Phasentrennprotein aus dem Anker freisenden und das Chromatin-assoziierte Kondensat gelöst.
Wir haben dieses Werkzeug verwendet, um die De novo promyelozytäre Leukämie (PML) Kernkörperbildung auf Telomeren in Telomeren in Telomerase-negativen Krebszellen zu induzieren, die einen alternativen Verlängerungsweg der Telomere (ALT) für die Telomererhaltung verwenden13,14.  PML-Kernkörper sind membranlose Kompartimente, die an vielen Kernprozessen beteiligt sind15,16 und sind einzigartig auf ALT-Telomere lokalisiert, um APBs zu bilden, für ALT-Telomer-assoziierte PML-Körper17,18. Telomere clustern sich innerhalb von APBs, vermutlich um Reparaturvorlagen für die homologiegerichtete Telomer-DNA-Synthese in ALT19bereitzustellen. Tatsächlich wurde die Telomer-DNA-Synthese in APBs nachgewiesen und APBs spielen eine wesentliche Rolle bei der Anreicherung von DNA-Reparaturfaktoren auf Telomeren20,21. Die Mechanismen, die der APB-Assemblierung und dem Telomer-Clustering innerhalb von APBs zugrunde liegen, waren jedoch unbekannt. Da Telomerproteine in ALT-Zellen durch kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikatoren (SUMOs)22eindeutig modifiziert werden, viele APB-Komponenten Sumoylierungsstellen 22,23,24,25 und/oder SUMO-interagierende Motive (SIMs)26,27 und SUMO-SIM-Wechselwirkungen die Phasentrennung28antreiben, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Sumoylation auf Telomeren zur Anreicherung von SUMO/SIM-haltigen Proteinen führt und SUMO-SIM-Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen führen zur Phasentrennung.  PML-Protein, das drei Sumoylationsstellen und eine SIM-Stelle hat, kann zu sumoylierten Telomeren rekrutiert werden, um APBs zu bilden, und die Koaleszenz flüssiger APBs führt zu Telomerclustern. Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir das chemische Dimerisierungssystem, um die sumoylationsinduzierte APB-Bildung nachzuahmen, indem sim zu Telomeren rekrutiert wurde (Abbildung 2A)11. GFP wird zur Visualisierung mit Haloenzym und mit dem Telomer-bindenden Protein TRF1 verschmolzen, um den Dimerizer an Telomeren zu verankern. SIM ist mit eDHFR und mCherry verschmolzen. Die Kinetik der Kondensatbildung und die durch Tröpfchenfusion induzierte Telomerclusterung werden mit der Bildgebung von lebenden Zellen verfolgt.  Die Phasentrennung wird durch Zugabe von überschüssigem freiem TMP umgekehrt, um mit der eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) werden verwendet, um die Kondensatzusammensetzung und die telomerische Assoziation zu bestimmen. Recruiting SIM reichert SUMO auf Telomere an und die induzierten Kondensate enthalten PML und sind daher APBs. Die Rekrutierung einer SIM-Mutante, die nicht mit SUMO interagieren kann, reichert SUMO nicht an Telomeren an oder induziert keine Phasentrennung, was darauf hindeutet, dass die grundlegende treibende Kraft für die APB-Kondensation die SUMO-SIM-Interaktion ist. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung können PolySUMO-PolySIM-Polymere, die mit einem TRF2-Bindungsfaktor RAP1 verschmolzen sind, auch die APB-Bildung29induzieren. Im Vergleich zum polySUMO-polySIM-Fusionssystem, bei dem die Phasentrennung erfolgt, solange genügend Proteine produziert werden, induziert der hier vorgestellte chemische Dimerisierungsansatz die Phasentrennung bei Bedarf und bietet somit eine bessere zeitliche Auflösung, um die Kinetik der Phasentrennung und des Telomerclustering-Prozesses zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht dieses chemische Dimerisierungssystem die Rekrutierung anderer Proteine, um ihre Fähigkeit zur Induktion von Phasentrennung und Telomerclustering zu bewerten. Zum Beispiel kann ein ungeordnetes Protein, das zu Telomeren rekrutiert wird, auch Tröpfchen und Cluster-Telomere bilden, ohne die APB-Bildung zu induzieren, was darauf hindeutet, dass die Telomerclusterung unabhängig von der APB-Chemie ist und nur auf der APB-Flüssigkeitseigenschaft11beruht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

Chromatin-assoziierte Kondensate sind an vielen Kernprozessen beteiligt, aber die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben schwer fassbar. Dieses Protokoll beschreibt ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem zur Herstellung von Kondensaten auf Telomeren. Der chemische Dimerizer besteht aus zwei verknüpften Liganden, die jeweils an ein Protein binden können: Halo-Ligand an Halo-Enzym und Trimethoprim (TMP) an E. coli dihydrofolat-Reduktase (eDHFR). Die Fusion des Halo-Enzyms zu einem Telomerprotein verankert Dimerizer an Telomeren durch kovalente Halo-Liganden-Enzymbindung. Die Bindung von TMP an eDHFR rekrutiert eDHFR-fusionierte Phasen, die Proteine an Telomere trennen und die Kondensatbildung induziert. Da die TMP-eDHFR-Wechselwirkung nicht kovalent ist, kann die Kondensation umgekehrt werden, indem überschüssiges freies TMP verwendet wird, um mit dem Dimerizer um die eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Ein Beispiel für die Induktion der Kernkörperbildung von promyelozytärer Leukämie (PML) auf Telomeren und die Bestimmung von Kondensatwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung wird gezeigt. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Kondensate an anderen genomischen Stellen zu induzieren, indem Halo zu einem Protein verschmiert wird, das direkt an das lokale Chromatin bindet, oder an dCas9, das mit einer Leit-RNA auf den genomischen Locus abzielt. Durch die Zeitauflösung, die für die Einzelzell-Live-Bildgebung erforderlich ist, während die Phasentrennung in einer Zellpopulation für biochemische Assays aufrechterhalten wird, eignet sich diese Methode sowohl für die Untersuchung der Bildung als auch der Funktion von Chromatin-assoziierten Kondensaten.

Repräsentative Bilder der telomeren Lokalisation von SUMO, identifiziert durch Telomer-DNA FISH und SUMO-Protein IF, sind in Abbildung 2 dargestellt. Zellen mit SIM-Rekrutierung angereichert SUMO1 und SUMO 2/3 auf Telomeren im Vergleich zu Zellen mit SIM-Mutanten-Rekrutierung. Dies deutet darauf hin, dass die SIM-Dimerisierungs-induzierte SUMO-Anreicherung an Telomeren von SUMO-SIM-Wechselwirkungen abhängt.
Ein repräsentativer Zeitrafferfilm von TRF1 und SIM na...

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Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

Dieses Protokoll veranschaulicht ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem, um Kondensate auf Chromatin zu erzeugen.  Die Bildung des Kernkörpers der promyelozytären Leukämie (PML) an Telomeren mit chemischen Dimerisatoren wird nachgewiesen. Tröpfchenwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung werden mit Lebendzellbildgebung, Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) überwacht.

Chemische Dimerisierungsinduzierte Proteinkondensate auf Telomeren

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Dieses Protokoll beschreibt das chemische Dimerisierungssystem, um Proteinkondensate auf Telomeren zu induzieren. Es kann leicht angepasst werden, um Kondensate an anderen genomischen Loci zu induzieren, und eignet sich zur Untersuchung der Bildung und Funktion von Chromatin-assoziierten Kondensaten. Diese Methode bietet eine zeitliche Auflösung, die für die Bildgebung lebender Zellen erforderlich ist, und hält die Phasentrennung in der Zellpopulation für biochemische Assays aufrecht.Zunächst werden Dimerisatoren in DMSO bei 10 Millimolar gelöst und in Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff bei minus 80 Grad Celsius zur Langzeitlagerung gelagert. Verdünnen Sie ein Aliquot von 10 Millimolar-Dimerizer im Bildmedium auf eine Stammkonzentration von 10 Mikromolaren und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Wenn sie gebrauchsfertig sind, verdünnen Sie Dimerisatoren auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 100 Nanomolar in Wachstumsmedium oder Bildgebungsmedium.Säen Sie 10 bis die fünften Zellen in kreisförmigen Deckgläsern mit 12 Millimeter Durchmesser, die mit Poly-D-Lysin in einer Sechs-Well-Platte beschichtet sind. Transfizieren Sie dann die Zellen mit den Halo-GFP-TRF1 und mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDFR-SIM mutierten Plasmiden und warten Sie 24 bis 48 Stunden, bevor Sie mit der Immunfluoreszenz fortfahren. Die verdünnten 100 nanomolaren Dimerizer in die Zellen geben und bei 37 Grad Celsius vier bis fünf Stunden lang inkubieren.Nach der Inkubation die Zellen in PBS-Lösung mit 4% Formaldehyd und 0,1% Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren, um die Zellen zu permeabilisieren. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Waschbezug rutscht zweimal mit 50 Mikrolitern TBS-Tx und einmal mit 50 Mikrolitern Antikörperverdünnungspuffer.Inkubieren Sie jeden Deckzettel mit 50 Mikrolitern primärer Anti-PML-, Anti-SUMO-1- oder Anti-SUMO-2- und 3-Antikörper bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer über Nacht. Der Waschdeckel rutscht dreimal mit einem Antikörperverdünnungspuffer, um ungebundene primäre Antikörper zu entfernen, und inkubiert die Zellen dann mit sekundären Antikörpern für eine Stunde in einer dunklen Box bei Raumtemperatur. Nach dem Färben rutscht der Waschdeckel dreimal mit TBS-Tx.Beschriften Sie dias, indem Sie zwei Mikroliter von einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI hinzufügen, dann die Cover-Slips umdrehen und auf den DAPI-Drop legen. Saugen Sie zusätzliche Flüssigkeit vom Rand des Deckelschlupfes ab. Versiegeln Sie den Schlitten mit Nagellack, lassen Sie ihn trocknen und spülen Sie die Oberseite des Deckzettels mit Wasser ab.Legen Sie die Dias bis zur Bildgebung in den Gefrierschrank. Samen Sie 10 bis die fünften Zellen auf 12 Millimeter kreisförmigen Deckgläsern, die mit Poly-D-Lysin in einer Sechs-Well-Platte beschichtet sind, und transfizieren Sie sie mit Halo-TRF1 und mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDHFR-SIM mutierten Plasmiden. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie sie viermal mit PBS.Für IF-FISH färben Sie die Zellen mit primären und sekundären Antikörpern und fixieren Sie sie mit 4% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur, waschen Sie sie dann viermal mit PBS und dehydrieren Sie die Deckzettel in einer Ethanol-Serie. Inkubieren Sie die Deckzettel mit der 488 Telomer C-PNA-Sonde in fünf Mikrolitern Hybridisierungslösung bei 75 Grad Celsius für fünf Minuten und inkubieren Sie die Abdeckungsrutsche über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Bezug dreimal mit Waschpuffer für zwei Minuten pro Waschgang bei Raumtemperatur und montieren Sie ihn mit einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI in Montagemedien für die Bildgebung.Für die Live-Bildgebung montieren Sie die Abdeckungsrutsche in magnetischen Kammern auf einer beheizten Bühne in einer Umweltkammer und halten die Zellen in einem Milliliter Bildmedium ohne Phenolrot. Stellen Sie das Mikroskop und die Umgebungskontrollvorrichtung wie im Textmanuskript beschrieben auf. Lokalisieren Sie Zellen mit einem hellen GFP-Signal auf den Telomeren und einem diffusiven mCherry-Signal im Zytosol.Finden Sie etwa 20 Zellen, merken Sie sich jede Position mit den XYZ-Informationen und richten Sie Parameter für die Zeitraffer-Bildgebung ein. Verwenden Sie einen Abstand von 0,5 Mikrometern für insgesamt acht Mikrometer in Z und ein Fünf-Minuten-Zeitintervall für zwei bis vier Stunden für GFP- und mCherry-Kanäle. Verwenden Sie 30% von 594 Nanometern und 50% von 488 Nanometern Leistungsintensität, mit Belichtungszeiten von 200 Millisekunden und einer Kameraverstärkung von 300.Beginnen Sie mit der Bildgebung und nehmen Sie eine Zeitschleife als Vordimerisierung. Dann die Bildgebung pausieren, 0,5 Milliliter Bildgebungsmedien mit 15 Mikrolitern 10 Mikromolardimerizer in die Bildgebungskammer geben, achten Sie darauf, die Bühne nicht zu berühren, und setzen Sie die Bildgebung fort. Wenn Sie bereit sind, die Dimerisierung umzukehren, pausieren Sie die Bildgebung und fügen Sie der Bildgebungskammer 0,5 Milliliter Bildmedien mit zwei Mikrolitern 100 Millimolar-TMP hinzu.Fahren Sie mit der Bildgebung der Zellen für ein bis zwei Stunden fort. Verwenden Sie für die feste Bildgebung das gleiche Mikroskop-Setup wie bei der Live-Bildgebung, jedoch ohne Die Bühnenheizung. Suchen Sie etwa 30 bis 50 Zellen mit dem roten Signal, um für transfizierte Zellen auszuwählen.Erfassen Sie Bilder mit einem Abstand von 0,3 Mikrometern für insgesamt acht Mikrometer in Z. Verwenden Sie 80% von 647 Nanometern, 80% von 561 Nanometern und 70% von 488 Nanometern Leistungsintensität mit Belichtungszeiten von 600 Millisekunden und einer Kameraverstärkung von 300. Die telomere Lokalisation von SUMO wurde mit Telomer-DNA-FISH und SUMO-Protein-Immunfluoreszenz identifiziert. Zellen mit SIM-Rekrutierung angereichert SUMO-1 und SUMO-2 und 3 im Vergleich zu Zellen mit SIM-Mutanten-Rekrutierung, was darauf hindeutet, dass sim-dimerisierung induzierte SUMO-Anreicherung an Telomeren von SUMO-SIM-Interaktionen abhängt.Ein Zeitrafferfilm von TRF-1 und SIM nach Dimerisierung wird hier gezeigt. SIM wurde erfolgreich für Telomere rekrutiert, und sowohl SIM- als auch TRF-1-Herde wurden größer und heller, wie für die Bildung und das Wachstum von Flüssigkeitströpfchen vorhergesagt. Darüber hinaus wurde eine Fusion von TRF-1-Herden beobachtet, die zu einer Telomerclusterung führte, wie die reduzierte Telomerzahl und die erhöhte Telomerintensität im Laufe der Zeit zeigen.Im Gegensatz dazu wurde die SIM-Mutante nach der Dimerisierung zu Telomeren rekrutiert, induzierte jedoch keine Tröpfchenbildung oder Telomerclustering, was darauf hindeutet, dass Phasentrennung und Telomerclustering durch SUMO-SIM-Interaktionen angetrieben werden. Die Umkehrung der Phasentrennung und des Telomerclusterings wurde nach Zugabe von überschüssigem freiem TMP beobachtet. Die Telomerzahl nahm zu und die Telomerintensität nahm im Laufe der Zeit ab.Repräsentative Bilder von APBs, die durch Telomer-DNA FISH und PML-Protein IF identifiziert wurden, sind hier dargestellt. Zellen mit rekrutierter SIM haben mehr APBs als Zellen mit rekrutierter SIM-Mutante, was darauf hindeutet, dass Dimerisierungs-induzierte Kondensate tatsächlich APBs sind. Setzen Sie bei der Durchführung dieses Protokolls keine lichtempfindlichen Dimerizer Licht aus.Arbeiten Sie in einem dunklen Raum mit einer Lampe, die rotes Licht ausstrahlt und wickeln Sie Zellen während der Inkubation mit Aluminiumfolie. Nach diesem Verfahren kann mit der Proximity-Markierung eine umfassende Liste der Komponenten im induzierten Kondensat erstellt werden. Live-Imaging kann verwendet werden, um die Dynamik von Komponenten im Kondensat zu verfolgen.Diese Methoden können helfen, die Rolle der Steuerung der Kondensatzusammensetzung zu bestimmen.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

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In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

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Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Funktion mit Cytochrom C Oxidase / Succinat-Dehydrogenase (COX / SDH) Double-Kennzeichnung Histochemie

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

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Protein WISDOM: A Workbench für<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Aufbau von Biomolekülen

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

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To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

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The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

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Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

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Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...