Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (1K22CA23763201 ל H.Z., GM118510 עד D.M.C.) וקרן צ'ארלס א. קאופמן ל- H.Z. המחברים רוצים להודות לג'ייסון טונס על הגהת כתב היד.

1. ייצור קווי תאים ארעיים
<ol><li>תאי קבלה של U2OS על כיסויי זכוכית בקוטר 22 x 22 מ"מ (להדמיה חיה) או כיסויים עגולים בקוטר 12 מ"מ (עבור IF או FISH) מצופים בפולי-D-ליצין בצלחת 6-well עם מדיום צמיחה (10% סרום בקר עוברי ופתרון 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב- DMEM) עד שהם מגיעים להשפעה של 60-70%.</li>
	<li>החלף את מדיום הצמ?...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+in+the+nucleus.">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+DNA+repair+pathways+converge.">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li><li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination.">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

פרוטוקול זה הדגים היווצרות ופירוק של עיבויים בטלומרים עם מערכת עמעום כימית. קינטיקה של הפרדת פאזה ואשכול טלומר המושרה על ידי טיפה-היתוך מנוטרים באמצעות הדמיה חיה. לוקליזציה מרוכזת והרכב נקבעים עם דג DNA וחלבון IF.
קיימים שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא לקבוע חלבון ?...

חלבונים וחומצות גרעין רבים עוברים הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) ומרכיבים את עצמם לתוך עיבויים ביומולקולריים כדי לארגן ביוכימיה בתאים1,2. LLPS של חלבונים מחייב כרומטין מוביל להיווצרות של עיבויים הקשורים loci גנומי ספציפי והם מעורבים פונקציות כרומטין מקומיות שונות3. לדוגמה, LLPS של חלבון HP1 עומד בבסיס היווצרות של תחומים הטרוכרומטינים כדי לארגן את הגנום4,5, LLPS של גורמי שעתוק יוצר מרכזי שעתוק כדי לווסת את שעתוק6, LLPS של mRNAs המתהווה וחלבון מסרקים מרובי מיניים מייצר גופי לוקוס histone כדי לווסת את שעתוק ועיבוד של histone mRNAs7.  עם זאת, למרות דוגמאות רבות של עיבוי הקשורים כרומטין מתגלה, המנגנונים הבסיסיים של היווצרות עיבוי, רגולציה ותפקוד להישאר מובן היטב. בפרט, לא כל עיבוי הקשורים כרומטין נוצרים באמצעות LLPS והערכות זהירה של היווצרות עיבוי בתאים חיים עדיין נדרשים8,9. לדוגמה, חלבון HP1 בעכבר מוצג כבעל יכולת חלשה בלבד ליצור טיפות נוזליות בתאים חיים ומוקדי הטרוכרומטין מתנהגים כמו כדוריות פולימר שקרסו10. לכן, כלים כדי לגרום de novo עיבויים על כרומטין בתאים חיים רצויים, במיוחד אלה המאפשרים שימוש בהדמיה חיה וביקורת ביוכימית כדי לפקח על הקינטיקה של היווצרות עיבוי, התכונות הפיזיות והכימיות של העיבויים המתקבלים, ואת ההשלכות התאיות של היווצרות עיבוי.
פרוטוקול זה מדווח על מערכת עמעום כימית כדי לגרום לעיבוי חלבון בכרומטין11 (איור 1A). הדימרייזר מורכב משני ליגנדים מקושרים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים: טרימתופרים (TMP) וליגנד Halo ויכול לעמעם חלבונים המותכים לקולטני הקוגניט: Escherichia coli dihydrofolate reductase (eDHFR) ואנזים אלקילדהלוגנאז חיידקי (אנזים Halo), בהתאמה12. האינטראקציה בין האנזים Halo ligand ואנזים Halo היא קוולנטית, ומאפשרת אנזים Halo לשמש עוגן על ידי היתוך אותו לחלבון מחייב כרומטין כדי לגייס חלבון הפרדת פאזה הותך eDHFR לכרומטין. לאחר הגיוס הראשוני, ריכוז מקומי מוגבר של השלב המפריד חלבון עובר את הריכוז הקריטי הדרוש להפרדת פאזה ובכך מגרגר עיבוי בעוגן (איור 1B). על ידי היתוך חלבונים פלואורסצנטיים (למשל mCherry ו- eGFP) ל- eDHFR והילה, ניתן לדמיין התגרענות וצמיחה של עיבויים בזמן אמת עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. מכיוון שהאינטראקציה בין eDHFR ל- TMP אינה קוולנטית, ניתן להוסיף TMP ללא עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. לאחר מכן זה ישחרר את חלבון הפרדת הפאזה מהעוגן ולהמיס את העיבוי הקשור לכרומטין.
השתמשנו בכלי זה כדי לגרום להיווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית דה נובו (PML) בטלומרים בתאי סרטן שליליים טלומראז המשתמשים בהארכה חלופית של מסלול הטלומרים (ALT) לתחזוקת הטלומר13,14.  גופים גרעיניים PML הם תאים ללא ממברנה המעורבים בתהליכים גרעיניים רבים15,16 והם מקומיים באופן ייחודי טלומר ALT כדי ליצור APBs, עבור גופי PML הקשורים טלומר ALT17,18. אשכול טלומרים בתוך APBs, ככל הנראה כדי לספק תבניות תיקון עבור סינתזת DNA טלומר מונחה הומולוגיה ב ALT19. ואכן, סינתזת DNA טלומר זוהתה APBs ו APBs לשחק תפקידים חיוניים העשרת גורמי תיקון DNA בטלומרים20,21. עם זאת, המנגנונים שבביד הרכבת APB ואשכול הטלומר בתוך APBs לא היו ידועים. מאז חלבוני טלומר בתאי ALT משתנים באופן ייחודי על ידי מחליף קטן דמוי אוביקוויטין (SUMOs)22, רכיבי APB רבים מכילים אתרי סומוילציה 22,23,24,25 ו / או מוטיבים אינטראקציה SUMO (SIMs)26,27 ואינטראקציות SUMO-SIM כונן הפרדת שלב28, שיערנו כי סומוילציה על טלומרים מוביל להעשרה של SUMO / SIM המכיל חלבונים ו אינטראקציות SUMO-SIM בין חלבונים אלה מובילות להפרדת פאזה.  חלבון PML, שיש לו שלושה אתרי סומוילציה ואתר SIM אחד, ניתן לגייס טלומרים סומויליים כדי ליצור APBs והתמזגות של APBs נוזלי מוביל להתקבצות טלומרים. כדי לבחון השערה זו, השתמשנו במערכת הדממה הכימית כדי לחקות היווצרות APB הנגרמת על ידי סומוילציה על ידי גיוס SIM לטלומרים (איור 2A)11. GFP מותך Haloenzyme להדמיה ולחלבון טלומר מחייב TRF1 כדי לעגן את הדמיר לטלומרים. ה-SIM מותך ל-eDHFR ול-mCherry. קינטיקה של היווצרות עיבוי ו clustersion טיפה המושרה טלומר קיבוץ הם אחריו עם הדמיה תא חי.  הפרדת הפאזה הפוכה על-ידי הוספת TMP חינם עודף כדי להתחרות בכריכה של eDHFR. אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH) משמשים לקביעת הרכב עיבוי ואיגוד טלומרי. גיוס SIM מעשיר את SUMO בטלומרים והמרוכזים המושרים מכילים PML ולכן הם APBs. גיוס מוטציה SIM שאינה יכולה לקיים אינטראקציה עם SUMO אינה מעשירה את SUMO בטלומרים או גורמת להפרדת פאזה, מה שמצביע על כך שהכוח המניע הבסיסי ל עיבוי APB הוא אינטראקציית SUMO-SIM. מסכים עם תצפית זו, פוליסומו-פוליסים פולימרים שהתמזגו לגורם מחייב TRF2 RAP1 יכול גם לגרום להיווצרות APB29. בהשוואה למערכת ההיתוך polySUMO-polySIM שבה הפרדת פאזה מתרחשת כל עוד מיוצרים מספיק חלבונים, גישת הדמיזציה הכימית המוצגת כאן גורמת להפרדת פאזה על פי דרישה ובכך מציעה רזולוציה זמנית טובה יותר לניטור הקינטיקה של הפרדת פאזה ותהליך קיבוץ הטלומר. בנוסף, מערכת עמעום כימית זו מאפשרת גיוס חלבונים אחרים כדי להעריך את יכולתם בגרימת הפרדת פאזה ואשכולות טלומר. לדוגמה, חלבון מופרע המגויס לטלומרים יכול גם ליצור טיפות וטלומרים מקבצי מבלי לגרום להיווצרות APB, דבר המצביע על קיבוץ טלומר שאינו תלוי בכימיה של APB ונשען רק על נכס נוזלי APB11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

עיבויים הקשורים לכרומטין מעורבים בתהליכים גרעיניים רבים, אך המנגנונים הבסיסיים נותרים חמקמקים. פרוטוקול זה מתאר מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים בטלומרים. הדימרייזר הכימי מורכב משני ליגנדים מקושרים שיכולים להיקשר כל אחד לחלבון: ליגנד Halo ל-Halo-enzyme וטימופרים (TMP) ל-E. coli dihydrofolate reductase (eDHFR), בהתאמה. היתוך של אנזים Halo לחלבון טלומר מעגן דימריזרים לטלומרים באמצעות כריכת אנזים הילה ליגנד קוולנטית. כריכה של TMP ל- eDHFR מגייסת שלב מותך eDHFR המפריד חלבונים לטלומרים ודורשת היווצרות עיבוי. מכיוון שאינטראקציית TMP-eDHFR אינה קוולנטית, ניתן להפוך עיבוי באמצעות TMP חינם עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. דוגמה של גרימת היווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) בטלומרים וקביעת צמיחה עיבוי, פירוק, לוקליזציה והרכב מוצגת. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לגרום עיבוי במקומות גנומיים אחרים על ידי היתוך Halo לחלבון שנקשר ישירות לכרומטין המקומי או dCas9 כי הוא ממוקד לוקוס גנומי עם RNA מדריך. על ידי הצעת הרזולוציה הזמנית הנדרשת להדמיה חיה של תא יחיד תוך שמירה על הפרדת פאזה באוכלוסיית תאים לבדיקות ביוכימיות, שיטה זו מתאימה לבדיקת היווצרות ותפקוד של עיבויים הקשורים לכרומטין.

תמונות מייצגות של לוקליזציה טלומרית של SUMO שזוהתה על ידי דגי DNA טלומר וחלבון SUMO IF מוצגות באיור 2. תאים עם גיוס SIM העשירו את SUMO1 ו- SUMO 2/3 בטלומרים בהשוואה לתאים עם גיוס מוטציות SIM. הדבר מצביע על כך שהעשרת SUMO הנגרמת על-ידי DIMERIZATION בתחום הטלומרים תלויה באינטראקציות SUMO-SIM.
<p class="jove_cont...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

פרוטוקול זה ממחיש מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים על כרומטין.  היווצרות של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) גוף גרעיני על טלומרים עם דימריזרים כימיים הוא הודגם. צמיחה טיפה, פירוק, לוקליזציה והרכב מנוטרים עם הדמיית תאים חיים, אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).

חלבון המושרה בדמריזציה כימית מתנדם בטלומרים

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

פרוטוקול זה מתאר את מערכת הדממה הכימית כדי לגרום לעיבוי חלבונים בטלומרים. זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לגרום עיבויים על loci גנומי אחרים, והוא מתאים לבדיקת היווצרות ותפקוד של מעבים הקשורים כרומטין. שיטה זו מציעה רזולוציה זמנית הנדרשת להדמיית תאים חיים ושומרת על הפרדת פאזה באוכלוסיית התאים לבדיקות ביוכימיות.כדי להתחיל, להמיס dimerizers ב- DMSO ב 10 מילימולר ולאחסן אותם בצינורות microcentrifuge פלסטיק במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לדלל aliquot של 10 מילימולר דימרייזר בהדמיה בינונית לריכוז מלאי של 10 micromolar ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. כאשר מוכן לשימוש, לדלל dimerizers לריכוז עבודה סופי של 100 nanomolar במדיום צמיחה או מדיום הדמיה.זרע 10 עד התאים החמישיים במשקפי כיסוי עגולים בקוטר 12 מ"מ מצופים בפולי-D-ליסין בצלחת של שש בארות. לאחר מכן להעביר את התאים עם Halo-GFP-TRF1 ו mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDFR-SIM מוטציה plasmids ולחכות 24 עד 48 שעות לפני שתמשיך immunofluorescence. מוסיפים את 100 הדימרימרים הננומולרים מדוללים לתאים ודגר אותם ב-37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד חמש שעות.לאחר הדגירה, תקן את התאים בתמיסת PBS המכילה 4%פורמלדהיד ו- 0.1%טריטון X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל לתאים. ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. כיסוי לשטוף מחליק פעמיים עם 50 microliters של TBS-Tx ופעם אחת עם 50 microliters של חוצץ דילול נוגדנים.לדגור כל פיסת כיסוי עם 50 microliters של אנטי PML ראשוני, אנטי SUMO-1, או נוגדן נגד SUMO-2 ו 3 בארבע מעלות צלזיוס בתא לח בן לילה. כיסוי לשטוף מחליק שלוש פעמים עם חוצץ דילול נוגדנים כדי להסיר נוגדן ראשי מאוגד, ולאחר מכן לדגור על התאים עם נוגדן משני במשך שעה אחת בקופסה כהה בטמפרטורת החדר. לאחר הכתם, לשטוף כיסוי מחליק שלוש פעמים עם TBS-Tx.סמן שקופיות תווית על-ידי הוספת שני מיקרוליטרים של מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI, ולאחר מכן הפוך את פתקי הכיסוי והנח אותם על טיפת DAPI. שאפו נוזל נוסף מקצה החלקה. לאטום את המגלשה עם לק, לאפשר לו להתייבש, ולשטוף את החלק העליון של כיסוי להחליק עם מים.מניחים את השקופיות במקפיא עד להדמיה. זרע 10 לתאים החמישיים על משקפי כיסוי עגולים 12 מ"מ מצופים פולי-D-ליסין בצלחת שש באר ולהעביר אותם עם Halo-TRF1 ו mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDHFR-SIM מוטציה plasmids. תקן את התאים עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף אותם ארבע פעמים עם PBS.עבור IF-FISH, להכתים את התאים עם נוגדנים ראשוניים ומשניים refix אותם עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף אותם ארבע פעמים עם PBS ולייבש את כיסוי החלקות בסדרת אתנול. לדגור על פתקי הכיסוי עם 488 טלומר C-PNA בדיקה בחמישה microliters של פתרון הכלאה ב 75 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן לדגור את כיסוי מחליק לילה בתא לח בטמפרטורת החדר. לשטוף את כיסוי מחליק שלוש פעמים עם חוצץ לשטוף במשך שתי דקות לכל לשטוף בטמפרטורת החדר ולהרכיב אותם עם מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI במדיה הרכבה להדמיה.להדמיה חיה, הר את החלקות הכיסוי בתאים מגנטיים על במה מחוממת בתא סביבתי, שמירה על התאים במיליליטר אחד של מדיום הדמיה ללא פנול אדום. הגדר את מנגנון המיקרוסקופ והבקרה הסביבתית כמתואר בכתב היד של הטקסט. אתר תאים עם אות GFP בהיר על הטלומרים ואות mCherry מפוזר בציטוסול.מצא כ-20 תאים, שינון כל מיקום עם מידע XYZ והגדר פרמטרים להדמיה של זמן-זמן. השתמש בריווח של 0.5 מיקרומטרים עבור סך של שמונה מיקרומטרים ב- Z ומרווח זמן של חמש דקות למשך שעתיים עד ארבע שעות הן עבור ערוצי GFP והן עבור ערוצי mCherry. השתמש ב-30% מ-594 ננומטר וב-50% מעוצמת הכוח של 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 200 אלפיות השנייה ורווח מצלמה של 300.התחל הדמיה ולקחת לולאה חד פעמית כמו קדם עמעום. לאחר מכן השהו הדמיה, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מדיית הדמיה המכילה 15 מיקרוליטרים של דימרייזר 10 מיקרומולר לתא ההדמיה, דאגו לא לגעת בשלב, ולחדש את ההדמיה. כאשר אתה מוכן להפוך את הדממה, השהה הדמיה והוסף 0.5 מיליליטר של מדיית הדמיה המכילה שני מיקרוליטרים של TMP מלאי 100 מילימולר לתא ההדמיה.המשך הדמיה של התאים במשך שעה עד שעתיים. להדמיה קבועה, השתמש באותה הגדרת מיקרוסקופ כמו הדמיה חיה, אך ללא חימום הבמה. אתר סביב 30 עד 50 תאים עם האות האדום כדי לבחור עבור תאים transfected.לרכוש תמונות עם מרווח של 0.3 מיקרומטר עבור סך של שמונה מיקרומטר ב Z.Use 80% של 647 ננומטר, 80% של 561 ננומטר, ו 70% של עוצמת כוח 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 600 אלפיות השנייה ורווח מצלמה של 300. לוקליזציה טלומרית של SUMO זוהתה באמצעות דג DNA טלומר ואימונופלואורסצנטיות חלבון SUMO. תאים עם גיוס SIM מועשר SUMO-1 ו SUMO-2 ו-3 בהשוואה לתאים עם גיוס מוטציות SIM, מה שמצביע על כך שעמעום SIM גרם להעשרת SUMO בטלומרים תלוי באינטראקציות SUMO-SIM.סרט לשגות זמן של TRF-1 ו- SIM לאחר דימרציה מוצג כאן. SIM גויס בהצלחה לטלומרים, וגם מוקדי ה-SIM וה-TRF-1 הפכו גדולים ובהירים יותר, כצפוי להיווצרות טיפות נוזליות ולצמיחה. בנוסף, היתוך של מוקדי TRF-1 נצפתה, מה שהוביל להתקבצות טלומר, כפי שמוצג במספר הטלומר המופחת ועוצמת הטלומר המוגברת לאורך זמן.לעומת זאת, מוטציית SIM גויסה לטלומרים לאחר דימרציה, אך לא עורר היווצרות טיפה או קיבוץ טלומר, מה שמצביע על כך שהפרדת פאזה ואשכול טלומר מונעים על ידי אינטראקציות SUMO-SIM. היפוך הפרדת הפאזה ואשכול הטלומר נצפתה לאחר הוספת TMP חינם עודף. מספר הטלומר גדל ועוצמת הטלומר ירדה עם הזמן.תמונות מייצגות של APBs שזוהו על ידי דנ"א טלומר דגים וחלבון PML אם מוצגים כאן. תאים עם SIM מגויסים יש יותר APBs מאשר תאים עם מוטציה SIM מגויס, מה שמרמז על דימרציה המושרה עיבויים הם אכן APBs. בעת ביצוע פרוטוקול זה, אל תחשוף דימרימרים רגישים לאור לאור.עבודה בחדר חשוך עם מנורה הפולטת אור אדום ועוטפת תאים בנייר אלומיניום במהלך הדגירה. לאחר הליך זה, תיוג קרבה יכול לשמש ליצירת רשימה מקיפה של רכיבים ב- Condensate המושרה. הדמיה חיה יכולה לשמש כדי לעקוב אחר הדינמיקה של רכיבים ביסוב.שיטות אלה יכולות לסייע בקביעת התפקידים של בקרת קומפוזיציה עיבוי של שליטה.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

חוכמת חלבון: Workbench ל<em&gt; בסיליקון</em&gt;<em&gt; דה נובו</em&gt; עיצוב של ביומולקולות

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...