Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
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この研究は、米国国立衛生研究所(1K22CA23763201からH.Z.、GM118510からD.M.C.)、チャールズ・E・カウフマン財団からH.Z.に支援されました。著者たちは、原稿を校正してくれたジェイソン・トーンズに感謝したいと思います。

1. 過渡細胞株の製造
<ol><li>培養U2OSアクセプター細胞は、22 x 22 mmガラスカバーリップ(ライブイメージング用)または直径12mmの円形カバーリップ(IFまたはFISH用)でポリDリジンを6ウェルプレートにコーティングし、成長培地(10%のウシウシ血清およびDMEMのペニシリン・ストレプトマイシン溶液)に達するまで</li>
	<li>トランスフェクション前に1 mLトランスフェクション培地(ペニシリ?...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+in+the+nucleus.">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+DNA+repair+pathways+converge.">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li><li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination.">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

このプロトコルは、化学二量体化システムを用いたテロメア上の凝縮物の形成と溶解を実証した。相分離および液滴融合誘発テロメアクラスタリングのキネティクスは、ライブイメージングで監視されます。凝縮物の局在および組成は、DNA FISHおよびプロテインIFで決定される。
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。1つ目は、タンパク質および二量体濃度を...

多くのタンパク質および核酸は、液体-液相分離(LLPS)を受け、生体分子凝縮物に自己集合して細胞1,2の生化学を組織する。クロマチン結合タンパク質のLLPSは、特異的ゲノム遺伝子座に関連する縮合物の形成を導き、様々な局所クロマチン機能3に関与している。例えば、HP1タンパク質のLLPSは、ゲノム4、5、転写因子のLLPSが転写センターを形成して転写センターを形成し、新生mRNAのLLPSおよび多セックスコームタンパク質がヒストン軌跡体を生成してヒストンmRNAの転写および処理を調節するヘテロクロマチンドメインの形成を基礎とする。 しかし、クロマチン関連凝縮物の多くの例が発見されているにもかかわらず、凝縮物形成、調節および機能の基礎的なメカニズムは依然として十分に理解されていない。特に、LLPSを介してすべてのクロマチン関連凝縮物が形成されるわけではないが、生細胞における凝縮物形成の慎重な評価は依然として8,9が必要である。例えば、マウスにおけるHP1タンパク質は、崩壊したポリマー球体10のように生きた細胞およびヘテロクロマチン病巣に液体液滴を形成する弱い能力しか持たなかった。したがって、生細胞におけるクロマチンにデノボ凝縮物を誘導するツールが望ましく、特に、生画像化および生化学的アッセイを使用して、凝縮物の動力学、結果として得られた凝縮物の物理的および化学的特性、および凝縮物形成の細胞の影響を監視することを可能にするものである。
このプロトコルは、クロマチン11 上のタンパク質凝縮物を誘導する化学二量体化システムを報告する(図1A)。二量体は、2つの結合されたタンパク質相互作用リガンドで構成されています:トリメトプリム(TMP)とハロリガンドと、同一受容体に融合したタンパク質を二量体化することができます: エシェリヒア・コリ ・ジヒドロホドロ葉酸還元酵素(eDHFR)と細菌アルキルデハロゲン酵素(Halo酵素)、それぞれ12。HaloリガンドとHalo酵素の相互作用は共有化されており、クロマチン結合タンパク質に融合させてクロマチン結合タンパク質に融合してクロマチンに融合した相分離タンパク質をクロマチンに融合させることで、Halo酵素をアンカーとして使用することができます。初期の募集後、相分離タンパク質の局所濃度の上昇は、相分離に必要な臨界濃度を通過し、したがってアンカーで凝縮物を核とする(図1B)。蛍光タンパク質(例えばmCherryやeGFP)をeDHFRとHaloに融合させることで、蛍光顕微鏡で凝縮物の核形成と成長をリアルタイムで可視化することができます。eDHFRとTMPの相互作用は非共有であるため、過剰な遊離TMPを添加して、eDHFR結合のための二量体剤と競合させることができる。これにより、アンカーから相分離タンパク質が放出され、クロマチン関連凝縮物が溶解します。
我々は、テロメア維持のためのテロメア(ALT)経路の代替長化を用いるテロメア(ALT)経路をテロメア維持13,14に対して、テロメア上のデノボ前骨髄球性白血病(PML)核体形成を誘導するためにこのツールを用いた。 PML核体は、多くの核プロセス15、16に関与する膜のないコンパートメントであり、ALTテロメアに固有に局在してAPBを形成し、ALTテロメア関連PML体17,18に対しては、ADBを形成する。テロメアは、ADB内に集結し、おそらくALT19で相同性指向テロメアDNA合成のための修復テンプレートを提供する。実際、テロメアDNA合成は、アペブで検出されており、ADBはテロメア20,21のDNA修復因子を豊かにする上で重要な役割を果たす。しかし、APBアセンブリとテロメアクラスタリングの基礎となるメカニズムは不明でした。ALT細胞のテロメアタンパク質はユビキチン様修飾(SMO)22によって一意に修飾されるため、多くのAPB成分は相総化部位22、23、24、25および/またはSUMO-を含む 相互作用モチーフ(SIM)26、27およびSUMO-SIM相互作用は相分離を促進する28を駆動し、テロメアの相化はタンパク質およびタンパク質を含むSUMO/SIMの濃縮につながると仮定したこれらのタンパク質間のSUMO-SIM相互作用は、相分離につながります。 3つの相総化サイトと1つのSIMサイトを有するPMLタンパク質を集結したテロメアを集結させてADBを形成し、液体ABの合体がテロメアクラスタリングにつながる。この仮説を検証するために、我々は、化学二量体化システムを用いて、SIMをテロメアに採用して相相化誘導APB形成を模倣した(図2A)11。GFPは、可視化のためにハロエンザイムに融合し、テロメア結合タンパク質TRF1に融合して二量化器をテロメアに固定します。SIMはeDHFRとmCherryに融合しています。凝縮体形成および液滴融合誘発テロメアクラスタリングの動態は、生細胞イメージングに続く。 相分離は、eDHFR結合と競合するために過剰な遊離TMPを添加することによって逆転する。蛍光免疫(IF)および蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)で使用して、凝縮体組成およびテロメリック会合を決定する。SIMを採用すると、テロメアでSUMOが豊かになり、誘導凝縮物にはPMLが含まれているため、ADBです。SUMOと相互作用できないSIM変異体を採用しても、相素体上でのSUMOの充実や相分離の誘導は行わないため、APB結露の基本的な原動力はSUMO-SIM相互作用であることを示しています。この観察に同意すると、TRF2結合因子RAP1に融合したポリスミオポリSIMポリマーも、APB形成29を誘導し得る。相分離が十分なタンパク質が生成される限り、相分離が起こるポリSUMO-polySIM融合システムと比較して、ここで提示される化学二量化アプローチは、オンデマンドで相分離を誘導し、したがって、相分離およびテロメアクラスタリングプロセスの運動を監視するより良い時間分解能を提供する。さらに、この化学二量体化システムは、相分離およびテロメアクラスタリングを誘導する能力を評価するために他のタンパク質の採用を可能にする。例えば、テロメアに採用された無秩序なタンパク質は、APB形成を誘発することなく液滴およびクラスターテロメアを形成することもできるが、テロメアクラスタリングはAPB化学から独立しており、APB液体特性11のみに依存することを示唆している。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

クロマチン関連凝縮物は多くの核プロセスに関与しているが、根本的なメカニズムは依然として不可解である。このプロトコルは、テロメア上に凝縮物を作成するための化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを記述する。化学二量体は、それぞれタンパク質に結合できる2つの結合リガンドで構成されています: ハローリガンドからハロエンス酵素への結合とトリメトプリム (TMP) 大 腸菌 ジヒドロホウ酸還元酵素 (eDHFR) それぞれ).Halo酵素をテロメアタンパク質に融合させ、共有化Haloリガンド-酵素結合を介して二量体をテロメアに固定します。TMPとeDHFRの結合は、eDHFR融合相分離タンパク質をテロメアに採用し、凝縮物形成を誘導する。TMP-eDHFR相互作用は非共有化であるため、過剰なフリーTMPを使用してeDHFR結合のための二量体剤と競合することにより結露を逆転させることができる。テロメア上に前骨髄性白血病(PML)核体形成を誘導し、凝縮物の成長、溶解、局在化および組成物を決定する例が示される。この方法は、局所クロマチンに直接結合するタンパク質またはガイドRNAを用いてゲノム遺伝子座に標的とされるdCas9にHaloを融合させることにより、他のゲノム位置で凝縮物を誘導するように容易に適応することができる。生化学的アッセイのための細胞集団における相分離を維持しながら、単一細胞の生画像化に必要な時間分解能を提供することにより、クロマチン関連凝縮物の形成と機能の両方を調査するのに適しています。

テロメアDNA FISHおよびSUMOタンパク質IFによって同定されたSUMOのテロメラ局在化の代表的な画像を 図2に示す。SIM採用を有する細胞は、SIM変異体採用を有する細胞と比較して、テロメア上のSUMO1およびSUMO 2/3を豊かにした。これは、SIM二量体化誘導によるテロメアのSUMO濃縮がSUMO-SIM相互作用に依存することを示している。
二量体化後のTRF1とSIMの代表的?...

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Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

このプロトコルは、クロマチン上に凝縮物を作製する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを示す。 化学二量体を用いたテロメア上の前骨髄性白血病(PML)核体の形成が実証されている。液滴の成長、溶解、局在化および組成物は、生細胞イメージング、免疫蛍光(IF)および蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)でモニタリングする。

テロメアの化学的二量体化誘導タンパク質凝縮物

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

このプロトコルは、テロメア上のタンパク質凝縮物を誘導する化学二量体化システムについて説明する。他のゲノム座に凝縮物を誘導するように容易に適合することができ、クロマチン関連凝縮物の形成および機能を調査するのに適している。この方法は、生細胞イメージングに必要な時間分解能を提供し、生化学的アッセイのための細胞集団における相分離を維持する。まず、DMSOの2量体を10ミリモルで溶解し、プラスチック製のマイクロ遠心分離チューブにマイナス80°Cで保存して長期保存します。イメージング培地中の10ミリモル二量体剤のアリコートを10マイクロモルのストック濃度に希釈し、マイナス20度で保存します。使用する準備ができたら、成長培地またはイメージング培地中で100ナノモルの最終的な作業濃度に二量化剤を希釈する。第10~5番目の細胞を直径12ミリメートルの円形カバーグラスに、ポリD-リジンを6ウェルプレートにコーティングした。次に、Halo-GFP-TRF1とmCherry-eDHFR-SIMまたはmCherry-eDFR-SIM変異体プラスミドで細胞をトランスフェクトし、免疫蛍光に進む前に24〜48時間待ちます。希釈した100ナノモル二量体を細胞に加え、摂氏37度で4~5時間インキュベートします。インキュベーション後、4%ホルムアルデヒドと0.1%トリトンX-100を含むPBS溶液中の細胞を室温で10分間固定し、細胞を透過させます。その後、細胞をPBSで3回洗浄します。ウォッシュカバーは、TBS-Txの50マイクロリットルで2回、抗体希釈バッファーの50マイクロリットルで1回スリップします。一次抗PML、抗SUMO-1、または抗SUMO-2および3抗体を一晩加湿したチャンバーで摂氏4度で50マイクロリットルずつインキュベートします。ウォッシュカバーは、抗体希釈バッファーで3回スリップして結合していない一次抗体を除去し、室温の暗い箱の中で細胞を1時間インキュベートします。染色後、洗濯カバーはTBS-Txで3回スリップします。1 ミリリットル DAPI あたり 1 マイクログラムの 2 マイクロリットルを追加してスライドにラベルを付け、カバースリップを裏返し、DAPI ドロップに配置します。カバースリップの端から余分な液体を吸引する。スライドをマニキュアで密封し、乾燥させ、カバースリップの上部を水ですすきます。スライドをイメージングするまで冷凍庫に入れる。6ウェルプレートにポリD-リジンでコーティングされた12ミリメートル円形カバーグラスの第5細胞にシード10を、ハロ-TRF1およびmCherry-eDHFR-SIMまたはmCherry-eDHFR-SIM変異体プラスミドでトランスフェクトする。4%ホルムアルデヒドを室温で10分間固定し、PBSで4回洗浄します。IF-FISHの場合は、一次および二次抗体で細胞を染色し、室温で10分間4%ホルムアルデヒドで再固定し、PBSで4回洗浄し、エタノールシリーズでカバースリップを脱水します。488テロメアC-PNAプローブを5マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液で5分間摂氏75度でカバースリップをインキュベートし、室温で加湿したチャンバーで一晩カバースリップをインキュベートします。カバースリップを洗浄バッファーで1回2分間洗浄して室温で洗浄し、イメージング用の取り付け媒体に1ミリリットルDAPIあたり1マイクログラムで取り付けます。ライブイメージングの場合、カバースリップを環境室の加熱された段階の磁気チャンバーに取り付け、フェノールレッドなしで1ミリリットルのイメージング媒体で細胞を維持します。原稿の説明に従って顕微鏡と環境制御装置を設置する。テロメアに明るいGFP信号を持つ細胞を見つけ、サイトソルの拡散性mCherry信号を検出します。約20個の細胞を見つけ、XYZ情報で各位置を記憶し、タイムラプスイメージングのパラメータを設定します。Z では合計 8 マイクロメートル、GFP チャネルと mCherry チャネルの両方で 2 ~ 4 時間の間隔は 5 マイクロメートルで 0.5 マイクロメートル間隔を使用します。594ナノメートルの30%、488ナノメートルの電力強度の50%を使用し、露出時間は200ミリ秒、カメラゲインは300です。イメージングを開始し、1回のループを事前二量化として使用します。次に、撮像を一時停止し、10マイクロモル二量体装置の15マイクロリットルを含むイメージング媒体を0.5ミリリットルのイメージングチャンバに加え、ステージに触れないように注意し、イメージングを再開する。二量体化を逆にする準備ができたら、イメージングを一時停止し、イメージングチャンバーに100ミリモルストックTMPの2マイクロリットルを含むイメージング培地の0.5ミリリットルを追加します。細胞のイメージングを1~2時間継続します。固定イメージングの場合は、ライブイメージングと同じ顕微鏡設定を使用しますが、ステージ加熱は行わない。トランスフェクトされた細胞を選択する赤信号で約30〜50個の細胞を見つけます。Z.Z.で合計8マイクロメートルの0.3マイクロメートル間隔の画像を取得する 647 ナノメートルの 80%、561 ナノメートルの 80%、488 ナノメートルの 70% の電力強度を使用し、露出時間は 600 ミリ秒、カメラゲインは 300 です。SUMOのテロメラ局在化は、テロメアDNA FISHおよびSUMOタンパク質免疫蛍光を用いて同定した。SIMリクルートメントを有する細胞は、SIM変異体リクルートメントを有する細胞と比較してSUMO-1およびSUMO-2および3を富化し、SIM二量体がテロメアに対するSUMO濃縮を誘導することを示すSUMO-SIM相互作用に依存する。二量体化後のTRF-1とSIMのタイムラプスムービーをここに示します。SIMはテロメアの採用に成功し、液滴の形成と成長が予測されるように、SIMとTRF-1病巣の両方がより大きく明るくなりました。また、TRF-1病巣の融合が観察され、テロメア数の減少や経時のテロメア強度の上昇に示されるように、テロメアクラスタリングが見られた。これに対し、SIM変異体は二量体化後にテロメアに採用されたが、液滴形成やテロメアクラスタリングを誘導せず、相分離およびテロメアクラスタリングがSUMO-SIM相互作用によって駆動されることを示している。過剰な遊離TMPを添加した後に相分離およびテロメアクラスタリングの逆転が観察された。テロメア数が増加し、テロメア強度が時間の経過とともに減少した。テロメアDNA FISHおよびPMLタンパク質IFによって同定されたアプブの代表的な画像を以下に示す。SIMを募集した細胞は、SIM変異体をリクルートした細胞よりも多くのアプブを有し、二量体化誘導凝縮物が実際にADBであることを示唆している。このプロトコルを実行する場合は、光に敏感な二量体を光に当てないでください。インキュベーション中に赤い光を発し、アルミ箔でセルをラップするランプを備えた暗い部屋で作業してください。この手順に従って、近接標識を使用して、誘導凝縮物中の成分の包括的なリストを生成することができます。ライブイメージングは、凝縮物中の成分のダイナミクスに従うために使用することができます。これらのメソッドは、コンデンセート組成制御を管理する役割を決定するのに役立ちます。

Research

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Biology

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