Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
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이 작품은 미국 국립 보건원 (1K22CA23763201 H.Z., GM118510에서 D.M.C.) 및 찰스 E. 카우프만 재단에 의해 지원되었다. 저자는 원고를 교정제이슨 톤에게 감사드립니다.

1. 일시적인 세포주 생산
<ol><li>배양 U2OS 수용세포는 22 x 22mm 유리 커버립(라이브 이미징용) 또는 12mm 직경의 원형 커버립(IF 또는 FISH용)에 6웰 플레이트에 다중 D-리신으로 코팅되어 있으며, 성장 배지(10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액)이 60%에 도달할 때까지 60%의 컨플루엔시에 도달할 때까지 60%의 컨플루엔시에 도달할 때까지 세포.</li>
	<li>성장 배지를 1mL 경질 배?...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+in+the+nucleus.">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+DNA+repair+pathways+converge.">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li><li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination.">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

이 프로토콜은 화학 적 분수 시스템을 갖춘 텔로미어의 응축수 형성 및 용해를 입증했습니다. 상 분리 및 액적 융합 유도 텔로미어 클러스터링의 운동은 라이브 이미징으로 모니터링됩니다. 응축수 국소화 및 조성물은 DNA FISH 및 단백질 IF로 결정됩니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 단백질과 이량제 농도를 결정하는 것입니다. 게놈 궤적에서 ?...

많은 단백질과 핵산은 액체-액체 상 분리(LLPS)를 거치고 세포1,2에서생화학을 조직하기 위해 생분자 응축수로 자가 조립한다. 크로마틴 결합 단백질의 LLPS는 특정 게놈 loci와 연관되고 각종 국소 크로마틴 기능에 연루되는 응축수의 형성에 이끌어 냅니다3. 예를 들어, HP1 단백질의 LLPS는 게놈4,5,전사 인자의 LLPS를 구성하는 이종로크로마티닌 도메인의 형성을 기초로 하여 전사6,초기 mRNA및 다성 빗 단백질의 LLPS는 그의 mRNA의 전사 및처리를 조절하기 위해 그의 음색 궤적 바디를 생성한다.  그러나 크로마틴 관련 응축수의 많은 예가 발견되었음에도 불구하고 응축수 형성, 조절 및 기능의 기본 메커니즘은 제대로 이해되지 않습니다. 특히, 모든 크로마틴 관련 응축수들이 LLPS를 통해 형성되는 것은 아니며 살아있는 세포에서 응축수 형성에 대한 신중한 평가는 여전히8,9가필요하다. 예를 들어, 마우스의 HP1 단백질은 살아있는 세포에서 액체 방울을 형성하는 데 약한 용량만 있는 것으로 나타났으며 이종로그로마틴 포시는 붕괴된 폴리머소구(10)로행동한다. 따라서, 살아있는 세포에서 크로마틴에 드 노보 응축수를 유도하는 도구는 바람직하며, 특히 살아있는 화상 진찰 및 생화학 적 분석의 사용을 허용하여 응축수 형성의 운동, 결과 응축수의 물리적 및 화학적 특성 및 응축수 형성의 세포 결과를 모니터링 할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
이러한 프로토콜은 크로마틴11(도 1A)에단백질 응축수를 유도하는 화학 적 이질 시스템을 보고합니다. 이산화제는 두 개의 연결된 단백질 상호 작용 리간드로 구성되어 있습니다: 트리메토림(TMP)과 헤일로 리간드와 코냑 수용체에 융합된 단백질을 이질할 수 있습니다: 에젤리치아 대장균 디하이드로폴레이트 환원효소(eDHFR) 및 세균성 알킬데할로게나아제 효소(Halo enzyme), 각각12. Halo 리간드와 헤일로 효소 간의 상호 작용은 공유되며, Halo 효소는 크로마틴결합 단백질에 융합하여 eDHFR에 융합된 위상 분리 단백질을 크로마틴에 모집함으로써 앵커로 사용될 수 있게 합니다. 초기 모집 후, 단백질을 분리하는 상의 국소 농도가 증가하여 위상 분리에 필요한 임계 농도를 전달하여앵커(도 1B)에서응축수를 핵을 형성한다. 형광 단백질(예: mCherry 및 eGFP)을 eDHFR 및 Halo에 융합함으로써 응축수의 핵 형성 및 성장을 형광 현미경 검사법과 실시간으로 시각화할 수 있습니다. eDHFR과 TMP 간의 상호 작용은 비공유이기 때문에, 초과 무료 TMP는 eDHFR 바인딩을 위한 이질화와 경쟁하기 위하여 추가될 수 있다. 그러면 앵커로부터 위상 분리 단백질을 방출하고 크로마틴 관련 응축수용을 용해시킬 것이다.
우리는 텔로미어 유지보수를위한 텔로미어(ALT) 경로의 대체 길이를 사용하는 텔로머라제-음성 암 세포에서 텔로미어에 대한 드 노보 보골 성 백혈병(PML) 핵체 형성을 유도하기 위해 이 도구를사용했다.  PML 핵체는 많은 핵 공정에 관여하는 멤브레인이 없는 구획으로,ALT텔로미어 관련 PML체(17,18)에대해 APB를 형성하기 위해 ALT 텔로미어로 고유하게 국한된다. 아마도 ALT19에서homology 지향 텔로미어 DNA 합성을 위한 복구 템플릿을 제공하기 위하여, APBs 내의 텔로미어 클러스터. 실제로, 텔로미어 DNA 합성은 APBs에서 검출되고 APBs는 텔로미어20,21에DNA 복구 요인을 풍부하게 하는 데 필수적인 역할을 한다. 그러나 APB 어셈블리와 알토미어 클러스터링의 기본 메커니즘은 알 수 없었습니다. ALT 세포내 텔로미어 단백질은 작은 유비퀴틴 유사 수정제(SUMOs)22에의해 고유하게 변형되기 때문에, 많은 APB 성분은 스모일레이션 사이트(22,23,24,25 및/또는 SUMO)를 함유하고 있습니다. 상호 작용하는 모티프(SEM)26,27 및 SUMO-SIM 상호 작용은 위상 분리28을구동하며, 텔로미어의 스모틸화는 단백질을 함유한 SUMO/SIM의 농축으로 이어진다고 가설을 세우고 이러한 단백질 간의 SUMO-SIM 상호 작용은 위상 분리로 이어집니다.  3개의 스모일화 사이트와 1개의 SIM 사이트가 있는 PML 단백질은, APB를 형성하기 위하여 스모이드텔로미어로 모집될 수 있고 액체 APB의 결합은 텔로미어 클러스터링으로 이끌어 냅니다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, 우리는 텔로미어에 SIM을 모집하여 스모닐화 유도 APB 형성을 모방하기 위해 화학 적 이질화를 사용했다(도 2A)11. GFP는 시각화를 위해 Haloenzyme및 텔로미어 결합 단백질 TRF1에 융합되어 이질제를 텔로미어에 고정시합니다. SIM은 eDHFR과 mCherry에 융합됩니다. 응축수 형성 및 액적 융합 유도 텔로미어 클러스터링의 운동제는 살아있는 세포 이미징으로 뒤따릅니다.  단계 분리는 eDHFR 바인딩과 경쟁하기 위해 초과 무료 TMP를 추가하여 반전됩니다. 피시테 혼성화(FISH)에서의 면역형광(IF) 및 형광은 응축수 조성물 및 텔로메릭 협회를 결정하는 데 사용된다. SIM을 모집하면 텔로미어에서 SUMO가 풍부하게 되며 유도된 응축수에는 PML이 포함되어 있으므로 APB가 포함됩니다. SUMO와 상호 작용할 수 없는 SIM 돌연변이를 모집해도 텔로미어에서 SUMO가 풍부하게 하거나 위상 분리를 유도하지 않으며, 이는 APB 응축의 기본 추진력이 SUMO-SIM 상호작용임을 나타낸다. 이러한 관찰에 동의하면, TRF2 결합인자 RAP1에 융합된 폴리스모 폴리머는 또한 APB형성(29)을유도할 수 있다. 상 분리가 충분한 단백질이 생산되는 한 위상 분리가 발생하는 polySUMO-polySIM 융합 시스템에 비해, 여기에 제시된 화학 적 이질 접근법은 수요에 대한 위상 분리를 유도하고 따라서 상 분리 및 텔로미어 클러스터링 공정의 운동을 모니터링하는 더 나은 시간적 해결을 제공한다. 또한, 이 화학 적 이산화 시스템은 위상 분리 및 텔로미어 클러스터링을 유도하는 능력을 평가하기 위해 다른 단백질의 모집을 허용합니다. 예를 들어, 텔로미어에 채용된 무질서한 단백질은 APB 형성을 유도하지 않고 방울과 클러스터 텔로미어를 형성할 수 있으며, 텔로미어 클러스터링은 APB 화학과 무관하며 APB 액체특성(11)에만의존한다는 것을 시사한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

크로마틴 관련 응축수는 많은 핵 프로세스에 연루되어 있지만 기본 메커니즘은 여전히 애매합니다. 이 프로토콜은 텔로미어에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이압 시스템을 설명합니다. 화학 이량제는 각각 단백질에 결합할 수 있는 두 개의 연결된 리간드로 구성됩니다: 헤일로 리간드에서 헤일로 효소 및 트리메토림(TMP)에서 대장균 디하이드로폴레이트 환원효소(eDHFR)에 각각 결합한다. Halo 효소를 텔로미어 단백질에 융합하여 이머제는 공유 헤일로 리간드 효소 결합을 통해 텔로미어에 이질화합니다. eDHFR에 TMP의 결합은 텔로미어에 단백질을 분리하는 eDHFR 융합 상을 모집하고 응축수 형성을 유도합니다. TMP-eDHFR 상호 작용은 비 공유이기 때문에, 응축은 eDHFR 바인딩을 위한 이질제와 경쟁하기 위하여 초과 자유로운 TMP를 사용하여 반전될 수 있습니다. 텔로미어에 대한 보골세포 백혈병(PML) 핵체 형성을 유도하고 응축수 성장, 용해, 국소화 및 조성물을 결정하는 예가 도시된다. 이 방법은 Halo를 현지 크로마틴에 직접 결합하는 단백질또는 가이드 RNA와 게놈 궤적을 대상으로 하는 dCas9에 직접 결합하는 단백질에 융합하여 다른 게놈 위치에서 응축을 유도하도록 쉽게 적응할 수 있다. 생화학적 분석을 위한 세포의 인구에서 위상 분리를 유지하면서 단하나 세포 라이브 이미징에 필요한 시간적 분해를 제공함으로써, 이 방법은 크로마틴 관련 응축수의 형성과 기능을 모두 조사하는 데 적합합니다.

텔로미어 DNA FISH 및 SUMO 단백질 IF에 의해 확인된 SUMO의 텔로메릭 국소화의 대표적인 이미지는 도 2에도시된다. SIM 모집을 가진 세포는 SIM 돌연변이 모집을 가진 세포에 비해 텔로미어에 SUMO1 및 SUMO 2/3을 풍부하게 했습니다. 이는 말단소에 대한 SIM 이수화로 인한 SUMO 농축이 SUMO-SIM 상호 작용에 달려 있음을 나타냅니다.
IMERIzation 후 TRF1 및 SIM의 대표적인 타?...

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Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

이 프로토콜은 크로마틴에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이질화를 보여줍니다.  화학 이량제와 텔로미어에 대미원식 백혈병 (PML) 핵 체의 형성이 입증된다. 물방울 성장, 용해, 국소화 및 조성물은 살아있는 세포 이미징, 면역 형광 (IF) 및 시상 혼성화 (FISH)에서 형광으로 모니터링됩니다.

텔로미어의 화학적 이산화 유발 단백질 응축수

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

이 프로토콜은 텔로미어의 단백질 응축수들을 유도하는 화학 적 이압 시스템을 설명합니다. 다른 게놈 로치에 응축수를 유도하도록 쉽게 적응할 수 있으며 크로마틴 관련 응축수의 형성 및 기능을 조사하는 데 적합합니다. 이 방법은 살아있는 세포 화상 진찰에 필요한 시간적 해결책을 제공하고 생화학적 분석을 위한 세포의 인구에 있는 상 분리를 유지합니다.우선 DMSO의 이질화를 10밀리머로 녹여 플라스틱 미세원심분리기 튜브에 보관하여 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도에 저장하십시오. 이미징 매체에서 10 밀리머 이머제의 알리쿼트를 10 마이크로몰라의 육수 농도로 희석하고 영하 20도에 보관하십시오. 사용할 준비가 되면 이머제는 성장 중간 또는 이미징 매체에서 100 나노몰러의 최종 작동 농도로 희석합니다.6웰 플레이트에 폴리-D-리신으로 코팅된 12밀리미터 직경의 원형 커버 안경으로 5번째 셀에 10번 시드를 드시고 있습니다. 그런 다음 Halo-GFP-TRF1 및 mCherry-eDHFR-SIM 또는 mCherry-eDFR-SIM 돌연변이 플라스미드로 세포를 횡단하고 면역형광을 진행하기 전에 24~48시간을 기다립니다. 희석된 100 나노몰러 이머제를 세포에 추가하고 4~5시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.인큐베이션 후, 세포를 포름알데히드 4%와 0.1%트리톤 X-100을 함유한 PBS 용액에서 세포를 실온에서 10분 동안 수정하여 세포를 투과화한다. 그런 다음 PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 세척 커버는 TBS-Tx의 50 마이크로 리터와 한 번 항체 희석 버퍼의 50 마이크로 리터와 함께 두 번 미끄러집니다.각 커버 슬립을 1차 항PML, 반대로 SUMO-1 또는 반수모-2 및 3항체를 가습 챔버에서 밤새 4도의 섭씨로 배양한다. 세척 커버는 언바운드 1차 항체를 제거하기 위해 항체 희석 버퍼로 세 번 미끄러진 다음 실온의 어두운 상자에 1 시간 동안 이차 항체로 세포를 배양합니다. 염색 후, 세탁 커버는 TBS-Tx로 세 번 미끄러짐.라벨은 밀리리터 DAPI당 1마이크로그램의 마이크로리터 2개를 추가한 다음 커버 슬립을 뒤집어 DAPI 드롭에 놓습니다. 커버 슬립의 가장자리에서 여분의 유체를 흡인. 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하고 건조시키고 커버 슬립의 상단을 물로 헹구십시오.슬라이드를 이미징할 때까지 냉동실에 놓습니다. 종자 10 에 다섯 번째 세포에 12 밀리미터 원형 커버 안경 6 웰 플레이트에 폴리 D-리신 코팅 하 고 헤일로-TRF1 및 mCherry-eDHFR-SIM 또는 mCherry-eDHFR-SIM 돌연변이 플라스미드와 함께 그들을 transfect. 실온에서 10 분 동안 4 %의 포름 알데히드로 세포를 고정하고 PBS로 4 번 세척하십시오.IF-FISH의 경우, 1차 및 이차 항체로 세포를 염색하고 실온에서 10분 동안 4%포름알데히드로 재고한 다음 PBS로 4번 세척하고 에탄올 계열에서 커버 슬립을 탈수합니다. 커버 슬립488 텔로미어 C-PNA 프로브를 5분간 섭씨 75도에서 5마이크로리터의 마이크로리터로 배양한 다음 실온에서 가습된 챔버에서 밤새 커버 슬립을 배양합니다. 커버슬립을 실온에서 세척당 2분 동안 세척 버퍼로 세 번 세척하고 이미징을 위한 마운팅 미디어에 밀리리터 DAPI당 1마이크로그램으로 장착합니다.라이브 이미징의 경우, 페놀 레드 없이 이미징 매체의 1밀리리터에서 세포를 유지, 환경 챔버에서 가열 된 단계에 자기 챔버에 커버 슬립을 마운트. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 현미경 및 환경 제어 장치를 설정합니다. 시토솔의 텔로미어 및 확산 mCherry 신호에 밝은 GFP 신호가 있는 세포를 찾습니다.약 20개의 세포를 찾아 XYZ 정보로 각 위치를 암기하고 시간 경과 이미징을 위한 매개변수를 설정합니다. GFP 및 mCherry 채널 모두에서 2~4시간 동안 Z에서 총 8마이크로미터, 5분 간격에 0.5 마이크로미터 간격을 사용하십시오. 594 나노미터의 30%와 488나노미터 전력 강도의 50%를 사용하며, 노출 시간은 200밀리초, 카메라 게인은 300입니다.이미징을 시작하고 사전 이산화로 한 번 루프를 수행합니다. 그런 다음 이미징을 일시 중지하고, 10 마이크로 몰라 이량제의 15 마이크로 리터를 포함하는 이미징 미디어의 0.5 밀리리터를 이미징 챔버에 추가하고, 단계를 만지지 않도록주의하고, 이미징을 재개합니다. 이산화를 되돌릴 준비가 되면 이미징을 일시 중지하고 100 밀리머 스톡 TMP의 2개의 마이크로리터를 포함하는 이미징 미디어의 0.5 밀리리터를 이미징 챔버에 추가합니다.세포를 1~2시간 동안 계속 이미징합니다. 고정 이미징의 경우, 라이브 이미징과 동일한 현미경 설정을 사용하지만 단계 가열없이 사용합니다. 전감염된 세포를 위해 선택하기 위해 적색 신호를 가진 약 30~50개의 세포를 찾습니다.Z.Use 647 나노미터의 80%, 561 나노미터의 80%, 488 나노미터 전력 강도의 70%를 600밀리초, 카메라 이득 300에서 총 8마이크로미터간격으로 0.3 마이크로미터 간격으로 이미지를 획득한다. SUMO의 텔로메릭 국소화는 텔로미어 DNA FISH 및 SUMO 단백질 면역형광을 사용하여 확인되었다. SIM 모집을 가진 세포는 SIM 돌연변이 모집을 가진 세포에 비해 SUMO-1 및 SUMO-2 및 3을 풍부하게 하고, 말소미어에 대한 SIM 이수화가 유도된 SUMO 농축이 SUMO-SIM 상호 작용에 달려 있음을 나타냅니다.이산화 후 TRF-1 및 SIM의 타임랩스 영화가 여기에 표시됩니다. SIM은 텔로미어에 성공적으로 채용되었으며, 액체 액적 형성과 성장에 대한 예측대로 SIM과 TRF-1 foci가 더 크고 밝아졌습니다. 또한, TRF-1 포시의 융합이 관찰되었고, 이는 텔로미어 클러스터링으로 이어졌으며, 이는 시간이 지남에 따라 텔로미어 수 감소 및 텔로미어 강도 증가와 같이.대조적으로, SIM 돌연변이는 분수 후에 텔로미어로 모집되었지만, 어떤 물방울 형성 또는 텔로미어 클러스터링을 유도하지 않았으며, 이는 상 분리 및 텔로미어 클러스터링이 SUMO-SIM 상호 작용에 의해 구동된다는 것을 나타낸다. 상 분리 및 텔로미어 클러스터링의 반전은 초과 무료 TMP를 추가한 후 관찰되었다. 텔로미어 수가 증가하고 텔로미어 강도는 시간이 지남에 따라 감소했습니다.텔로미어 DNA FISH 및 PML 단백질 IF에 의해 확인된 APB의 대표적인 심상은 여기에서 도시된다. SIM을 모집한 세포는 SIM 돌연변이를 채용한 세포보다 더 많은 APB를 가지고 있으며, 이압 유도 응축은 실제로 APB입니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 빛에 민감한 이질자를 라이트에 노출시키지 마십시오.잠복하는 동안 붉은 빛을 방출하고 알루미늄 호일로 세포를 감싸는 램프가있는 어두운 방에서 작업하십시오. 이 절차에 따라 근접 라벨링을 사용하여 유도된 응축수에서 포괄적인 구성 요소 목록을 생성할 수 있습니다. 라이브 이미징은 응축수의 구성 요소의 역학을 따르는 데 사용할 수 있습니다.이러한 메서드는 응축수 조성 제어를 제어하는 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

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연구

생물학

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액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

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