Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health (1K22CA23763201 til H.Z., GM118510 til D.M.C.) og Charles E. Kaufman foundation til H.Z. Forfatterne vil takke Jason Tones for korrekturlesing av manuskriptet.

1. Produksjon av forbigående cellelinjer
<ol><li>Kultur U2OS akseptorceller på 22 x 22 mm glassdeksler (for levende bildebehandling) eller 12 mm diameter sirkulære deksler (for IF eller FISH) belagt med poly-D-lysin i 6-brønns plate med vekstmedium (10% foster bovint serum og 1% Penicillin-Streptomycin løsning i DMEM) til de når 60-70% konfluency.</li>
	<li>Bytt ut vekstmedium med 1 ml transfeksjonsmedium (vekstmedium uten Penicillin-Streptomycin-løsning) før transfeksjon.</li>
	<li>For hver tr...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+in+the+nucleus.">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+DNA+repair+pathways+converge.">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li><li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination.">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

Denne protokollen demonstrerte dannelse og oppløsning av kondensater på telomerer med et kjemisk dimeriseringssystem. Kinetikk av faseseparasjon og dråpefusjonsindusert telomerklynge overvåkes med levende avbildning. Lokalisering og sammensetning av kondensat bestemmes med DNA FISH og protein IF.
Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Den første er å bestemme protein- og dimerizerkonsentrasjon. Suksessen med å indusere lokal faseseparasjon ved et genomisk locus er avhengig av øk...

Mange proteiner og nukleinsyrer gjennomgår væske-væske fase separasjon (LLPS) og selvmontering i biomolekylære kondensater for å organisere biokjemi i celle1,2. LLPS av kromatinbindende proteiner fører til dannelse av kondensater som er forbundet med spesifikk genomisk loci og er involvert i ulike lokale kromatinfunksjoner3. For eksempel ligger LLPS av HP1-protein til grunn for dannelsen av heterokromatindomener for å organisere genomet4,5, LLPS av transkripsjonsfaktorer danner transkripsjonssentre for å regulere transkripsjon6, LLPS av nascent mRNAer og multi-sex kammer protein genererer histone locus organer for å regulere transkripsjon og behandling av histone mRNAs7.  Til tross for mange eksempler på kromatinrelaterte kondensater som oppdages, forblir de underliggende mekanismene for kondensatdannelse, regulering og funksjon dårlig forstått. Spesielt dannes ikke alle kromatinrelaterte kondensater gjennom LLPS, og nøye evalueringer av kondensatdannelse i levende celler er fortsatt nødvendig8,9. For eksempel er HP1-protein i mus vist å ha bare en svak kapasitet til å danne flytende dråper i levende celler og heterokromatinfoci oppfører seg som kollapset polymer globules10. Derfor er verktøy for å indusere de novokondensater på kromatin i levende celler ønskelige, spesielt de som tillater bruk av levende avbildning og biokjemiske analyser for å overvåke kinetikken til kondensatdannelse, de fysiske og kjemiske egenskapene til de resulterende kondensatene og de cellulære konsekvensene av kondensatdannelse.
Denne protokollen rapporterer et kjemisk dimeriseringssystem for å indusere proteinkondensater på kromatin11 (figur 1A). Dimerizer består av to koblede proteininteragerende ligander: trimetoprim (TMP) og Halo ligand og kan dimerisere proteiner smeltet til konjakkreseptorene: Escherichia coli dihydrofolate reduktase (eDHFR) og et bakterielt alkyldehalogenase enzym (Halo enzyme), henholdsvis12. Samspillet mellom Halo ligand og Halo-enzymet er kovalent, slik at Halo-enzymet kan brukes som anker ved å smelte det sammen til et kromatinbindende protein for å rekruttere et faseseparerende protein smeltet til eDHFR til kromatin. Etter den første rekrutteringen passerer økt lokal konsentrasjon av faseseparasjonsproteinet den kritiske konsentrasjonen som trengs for faseseparasjon og nukleerer dermed et kondensat ved ankeret (figur 1B). Ved å fusjonere fluorescerende proteiner (f.eks. mCherry og eGFP) til eDHFR og Halo, kan kjernedannelse og vekst av kondensater visualiseres i sanntid med fluorescensmikroskopi. Fordi samspillet mellom eDHFR og TMP ikke er kovalent, kan overflødig fri TMP legges til for å konkurrere med dimmerizeren for eDHFR-binding. Dette vil deretter frigjøre faseseparasjonsproteinet fra ankeret og oppløse det kromatin-assosierte kondensatet.
Vi brukte dette verktøyet til å indusere de novo promyelocytic leukemi (PML) kjernefysisk kroppsdannelse på telomerer i telomerase-negative kreftceller som bruker en alternativ forlengelse av telomerer (ALT) bane for telomervedlikehold13,14.  PML kjernefysiske organer er membranløse rom involvert i mange kjernefysiske prosesser15,16 og er unikt lokalisert til ALT telomerer for å danne APB-er, for ALT telomer-tilknyttede PML-organer17,18. Telomeres-klynge i APBer, antagelig for å gi reparasjonsmaler for homologistyrt telomer DNA-syntese i ALT19. Faktisk har telomere DNA-syntese blitt oppdaget i APBer og APBer spiller viktige roller i å berike DNA-reparasjonsfaktorer på telomerer20,21. Mekanismene som lå til grunn for APB-montering og telomerklynger i APBer var imidlertid ukjente. Siden telomerproteiner i ALT-celler er unikt modifisert av små allestedsnærværende modifikator (SUMOer)22, inneholder mange APB-komponenter sumoyleringssteder 22,23,24,25 og / eller SUMO-interagerende motiver (SIMer)26,27 og SUMO-SIM interaksjoner driver faseseparasjon28, vi antok at summering på telomerer fører til berikelse av SUMO / SIM som inneholder proteiner og SUMO-SIM-interaksjoner mellom disse proteinene fører til faseseparasjon.  PML-protein, som har tre sumoyleringssteder og ett SIM-nettsted, kan rekrutteres til å summere telomerer for å danne APBer og koalescens av flytende APBer fører til telomererklynge. For å teste denne hypotesen brukte vi det kjemiske dimeriseringssystemet til å etterligne sumoyleringsindusert APB-dannelse ved å rekruttere SIM til telomerer (figur 2A)11. GFP smeltes sammen til Haloenzyme for visualisering og til telomerbindende protein TRF1 for å forankre dimmerizeren til telomerer. SIM-kortet er smeltet sammen til eDHFR og mCherry. Kinetikk i kondensatdannelse og dråpefusjonsindusert telomerklynge følges med levende celleavbildning.  Faseseparasjon reverseres ved å legge til overflødig fri TMP for å konkurrere med eDHFR-binding. Immunfluorescens (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH) brukes til å bestemme kondensatsammensetning og telomerisk assosiasjon. Rekruttering av SIM beriker SUMO på telomerer og de induserte kondensatene inneholder PML og er derfor APBer. Rekruttering av en SIM-mutant som ikke kan samhandle med SUMO, beriker ikke SUMO på telomerer eller induserer faseseparasjon, noe som indikerer at den grunnleggende drivkraften for APB-kondensering er SUMO-SIM-interaksjon. Enig med denne observasjonen, polySUMO-polySIM polymerer som smeltet til en TRF2 bindingsfaktor RAP1 kan også indusere APB formasjon29. Sammenlignet med polySUMO-polySIM fusjonssystemet der faseseparasjon oppstår så lenge nok proteiner produseres, induserer den kjemiske dimeriseringsmetoden som presenteres her faseseparasjon på forespørsel og gir dermed bedre tidsoppløsning for å overvåke kinetikken til faseseparasjon og telomerklyngeprosess. I tillegg tillater dette kjemiske dimeriseringssystemet rekruttering av andre proteiner for å vurdere deres evne til å indusere faseseparasjon og telomerklynge. For eksempel kan et forstyrret protein rekruttert til telomerer også danne dråper og klynge telomerer uten å indusere APB-dannelse, noe som tyder på at telomerklynge er uavhengig av APB-kjemi og bare er avhengig av APB flytende egenskap11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

Kromatin-assosierte kondensater er involvert i mange kjernefysiske prosesser, men de underliggende mekanismene forblir unnvikende. Denne protokollen beskriver et kjemisk indusert protein dimeriseringssystem for å skape kondensater på telomerer. Den kjemiske dimmerizeren består av to koblede ligander som hver kan binde seg til et protein: Halo ligand til Halo-enzymet og trimetoprim (TMP) til henholdsvis E. coli dihydrofolate reduktase (eDHFR). Fusjon av Halo-enzymet til et telomerprotein forankrer dimerizers til telomerer gjennom kovalent Halo ligand-enzymbinding. Binding av TMP til eDHFR rekrutterer eDHFR-smeltet fase som skiller proteiner til telomerer og induserer kondensatdannelse. Fordi TMP-eDHFR-interaksjon ikke er kovalent, kan kondens reverseres ved å bruke overflødig fri TMP til å konkurrere med dimmerizeren for eDHFR-binding. Et eksempel på å indusere promyelocytisk leukemi (PML) kjernefysisk kroppsdannelse på telomerer og bestemme kondensatvekst, oppløsning, lokalisering og sammensetning er vist. Denne metoden kan enkelt tilpasses for å indusere kondensater på andre genomiske steder ved å fusjonere Halo til et protein som direkte binder seg til det lokale kromatinet eller til dCas9 som er rettet mot det genomiske locus med en guide RNA. Ved å tilby den tidsmessige oppløsningen som kreves for encellet levende avbildning samtidig som faseseparasjon opprettholdes i en populasjon av celler for biokjemiske analyser, er denne metoden egnet for å undersøke både dannelsen og funksjonen til kromatinrelaterte kondensater.

Representative bilder av telomerisk lokalisering av SUMO identifisert av telomer DNA FISH og SUMO protein IF er vist i figur 2. Celler med SIM-rekruttering beriket SUMO1 og SUMO 2/3 på telomerer sammenlignet med celler med SIM-mutantrekruttering. Dette indikerer at SIM-dimeriseringsindusert SUMO-berikelse på telomerer avhenger av SUMO-SIM-interaksjoner.
En representativ intervallfilm av TRF1 og SIM etter dimerisering vises i Video 1. Øyeblikksb...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

Denne protokollen illustrerer et kjemisk indusert protein dimeriseringssystem for å skape kondensater på kromatin.  Dannelsen av promyelocytisk leukemi (PML) kjernelegeme på telomerer med kjemiske dimerizere er demonstrert. Dråpevekst, oppløsning, lokalisering og sammensetning overvåkes med levende celleavbildning, immunfluorescens (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH).

Kjemisk dimeriseringsindusert proteinkondensater på telomerer

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Denne protokollen beskriver det kjemiske dimeriseringssystemet for å indusere proteinkondensater på telomerer. Det kan enkelt tilpasses for å indusere kondensater på andre genomiske loci, og er egnet for å undersøke dannelsen og funksjonen til kromatinrelaterte kondensater. Denne metoden tilbyr tidsoppløsning som kreves for levende celleavbildning og opprettholder faseseparasjon i populasjonen av celler for biokjemiske analyser.Til å begynne med oppløses dimerizers i DMSO ved 10 millimolar og lagre dem i plastmikrosenterrør ved minus 80 grader Celsius for langsiktig lagring. Fortynn en aliquot på 10 millimolar dimerizer i bildebehandlingsmedium til en lagerkonsentrasjon på 10 mikromolar og lagre den på minus 20 grader Celsius. Når du er klar til bruk, fortynn dimerizere til en endelig arbeidskonsentrasjon på 100 nanomolar i vekstmedium eller bildebehandlingsmedium.Frø 10 til femte celler i 12 millimeter diameter sirkulære dekselglass belagt med Poly-D-Lysine i en seksbrønnsplate. Deretter transfekter cellene med Halo-GFP-TRF1 og mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDFR-SIM mutant plasmider og vent i 24 til 48 timer før du fortsetter til immunfluorescence. Tilsett de fortynnede 100 nanomolar dimerizers til cellene og inkuber dem i 37 grader Celsius i fire til fem timer.Etter inkubasjonen fikser du cellene i PBS-oppløsning som inneholder 4% formaldehyd og 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur for å permeabilisere cellene. Vask deretter cellene tre ganger med PBS. Vask dekselet to ganger med 50 mikroliter TBS-Tx og en gang med 50 mikroliter antistofffortynningsbuffer.Inkuber hvert deksel med 50 mikroliter primær anti-PML, anti-SUMO-1 eller anti-SUMO-2 og 3 antistoff ved fire grader Celsius i et fuktet kammer over natten. Vask dekselet glir tre ganger med antistofffortynningsbuffer for å fjerne ubundet primært antistoff, og inkuber deretter cellene med sekundært antistoff i en time i en mørk boks ved romtemperatur. Etter farging glir vaskedekselet tre ganger med TBS-Tx.Merk lysbilder ved å legge til to mikroliter med ett mikrogram per milliliter DAPI, snu deretter dekselet og plasser dem på DAPI-fallet. Aspirer ekstra væske fra kanten av dekselslippet. Forsegle lysbildet med neglelakk, la det tørke og skyll toppen av dekselslippet med vann.Plasser lysbildene i fryseren til det er bilde. Frø 10 til femte celler på 12 millimeter sirkulære dekselglass belagt med Poly-D-Lysine i en seksbrønnsplate og transfekt dem med Halo-TRF1 og mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutantplasmider. Fest cellene med 4% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og vask dem fire ganger med PBS.For IF-FISH, flekk cellene med primære og sekundære antistoffer og refikser dem med 4% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, vask dem deretter fire ganger med PBS og dehydrer dekselet glir i en etanolserie. Inkuber dekselet med 488 telomer C-PNA-sonden i fem mikroliter hybridiseringsløsning ved 75 grader Celsius i fem minutter, og inkuber deretter dekselet over natten i et fuktet kammer ved romtemperatur. Vask dekselet tre ganger med vaskebuffer i to minutter per vask ved romtemperatur og monter dem med ett mikrogram per milliliter DAPI i monteringsmedier for avbildning.For levende bildebehandling, monter dekselslippene i magnetiske kamre på et oppvarmet stadium i et miljøkammer, og vedlikehold cellene i en milliliter bildebehandlingsmedium uten fenolrød. Sett opp mikroskopet og miljøkontrollapparatet som beskrevet i tekstmanuskriptet. Finn celler med et lyst GFP-signal på telomerene og diffusivt mCherry-signal i cytosolen.Finn rundt 20 celler, husk hver posisjon med XYZ-informasjonen, og definer parametere for tidsforløpavbildning. Bruk 0,5 mikrometer avstand for totalt åtte mikrometer i Z og fem minutters tidsintervall i to til fire timer for både GFP- og mCherry-kanaler. Bruk 30 % av 594 nanometer og 50 % av 488 nanometers effektintensitet, med eksponeringstider på 200 millisekunder og en kameragevinst på 300.Start avbildningen og ta én tidsløkke som forhåndsdempning. Sett deretter bildet på pause, tilsett 0,5 milliliter bildemedier som inneholder 15 mikroliter 10 mikromolar dimerizer til bildekammeret, pass på at du ikke berører scenen og gjenopptar avbildningen. Når du er klar til å reversere dimerisering, pause bildebehandling og legge 0,5 milliliter bildemedier som inneholder to mikroliter av 100 millimolar lager TMP til bildekammeret.Fortsett å bilde av cellene i en til to timer. For fast bildebehandling, bruk samme mikroskopoppsett som levende bildebehandling, men uten sceneoppvarming. Finn rundt 30 til 50 celler med det røde signalet for å velge for transfekterte celler.Skaff bilder med 0,3 mikrometer avstand for totalt åtte mikrometer i Z.Bruk 80% av 647 nanometer, 80% av 561 nanometer, og 70% av 488 nanometer strømintensitet, med eksponeringstider på 600 millisekunder og en kameraøkning på 300. Telomerisk lokalisering av SUMO ble identifisert ved hjelp av telomer DNA FISH og SUMO protein immunfluorescence. Celler med SIM-rekruttering beriket SUMO-1 og SUMO-2 og 3 sammenlignet med celler med SIM-mutantrekruttering, noe som indikerer at SIM-dimerisering induserte SUMO-berikelse på telomerer, avhenger av SUMO-SIM-interaksjoner.En intervallfilm av TRF-1 og SIM etter dimerisering vises her. SIM ble vellykket rekruttert til telomerer, og både SIM- og TRF-1-foci ble større og lysere, som spådd for væskedråpedannelse og vekst. I tillegg ble det observert fusjon av TRF-1 foci, noe som førte til telomerklynge, som vist i redusert telomertall og økt telomerintensitet over tid.Derimot ble SIM-mutant rekruttert til telomerer etter dimerisering, men induserer ikke dråpedannelse eller telomerklynge, noe som indikerer at faseseparasjon og telomerklynge er drevet av SUMO-SIM-interaksjoner. Reversering av faseseparasjon og telomerklynge ble observert etter å ha lagt til overflødig fri TMP. Telomertallet økte og telomerintensiteten gikk ned over tid.Representative bilder av APB identifisert av telomere DNA FISH og PML protein IF er vist her. Celler med SIM rekruttert har flere AGB-er enn celler med SIM-mutant rekruttert, noe som tyder på at dimeriseringsinduserte kondensater faktisk er APBer. Når du utfører denne protokollen, må du ikke utsette lysfølsomme dimmerizere for lys.Arbeid i et mørkt rom med en lampe som avgir rødt lys og vikle celler med aluminiumsfolie under inkubasjon. Etter denne prosedyren kan nærhetsmerking brukes til å generere en omfattende liste over komponenter i det induserte kondensatet. Levende avbildning kan brukes til å følge dynamikken i komponenter i kondensatet.Disse metodene kan bidra til å bestemme rollene til styring av kondensatsammensetningskontroll.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Visualisering av Mitokondriell lungefunksjon bruker Cytokrom C Oksidase / succinate dehydrogenase (COX / SDH) Double-merking Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein visdom; Workbench for<em&gt; I silikon</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design av biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisk kodet Molekylær Sonder til Study G protein-koblede reseptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Høy gjennomstrømming Screening for Protein-basert arv i S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Kombinere kjemisk Cross-linking og massespektrometri av intakt Protein komplekser å studere arkitektur multi delenhet Protein samlinger

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifisering av områdespesifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometri ved hjelp av Data-uavhengig oppkjøpet massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...