Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США (1K22CA23763201 до H.Z., GM118510 до D.M.C.) и Фондом Чарльза Э. Кауфмана для H.Z. Авторы хотели бы поблагодарить Джейсона Тонса за корректуру рукописи.

1. Производство переходных клеточных линий
<ol><li>Культивируемые акцепторные клетки U2OS на стеклянные крышки диаметром 22 х 22 мм (для живой визуализации) или круглые покровные пластинки диаметром 12 мм (для ПЧ или FISH), покрытые поли-D-листином в 6-й колодце со средой роста (10% фетальна?...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+in+the+nucleus.">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+DNA+repair+pathways+converge.">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li><li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination.">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

Этот протокол продемонстрировал образование и растворение конденсатов на теломерах с помощью системы химической димеризации. Кинетика разделения фаз и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, контролируются с помощью живой визуализации. Локализацию и состав конденсата опр...

Многие белки и нуклеиновые кислоты подвергаются разделению жидкой фазы (LLPS) и самособираются в биомолекулярные конденсаты для организации биохимии в клетках1,2. LLPS хроматинсвязывающих белков приводит к образованию конденсатов, которые связаны со специфическими геномными локусами и участвуют в различных функциях местного хроматина3. Например, ТОО белка HP1 лежит в основе формирования гетерохроматиновых доменов для организации генома4,5,ТООО факторов транскрипции формирует транскрипционные центры для регулирования транскрипции6,ТОО из зарождающихся мРНК и белков многополых генерирует гистоновые локусные тела для регулирования транскрипции и обработки гистоновых мРНК7.  Однако, несмотря на то, что было обнаружено много примеров хроматин-ассоциированных конденсатов, основные механизмы образования, регуляции и функции конденсата остаются плохо изученными. В частности, не все хроматин-ассоциированные конденсаты образуются через LLPS и тщательные оценки образования конденсата в живых клетках все еще необходимы8,9. Например, показано, что белок HP1 у мышей обладает лишь слабой способностью образовывать жидкие капли в живых клетках, а гетерохроматиновые очаги ведут себя как коллапсировавших полимерныхшариков 10. Поэтому желательны инструменты для индуцирования конденсатов de novo на хроматине в живых клетках, особенно те, которые позволяют использовать живую визуализацию и биохимические анализы для мониторинга кинетики образования конденсата, физических и химических свойств образующихся конденсатов и клеточных последствий образования конденсата.
Этот протокол сообщает о системе химической димеризации для индуцирования белковых конденсатов на хроматине11 (рисунок 1A). Димеризатор состоит из двух связанных белково-взаимодействующих лигандов: триметоприма (TMP) и лиганда Halo и может димеризовать белки, слитые с родственными рецепторами: Escherichia coli дигидрофолатредуктаза (eDHFR) и бактериальный фермент алкилдегалогеназа (фермент Halo), соответственно12. Взаимодействие между лигандом Halo и ферментом Halo является ковалентным, что позволяет использовать фермент Halo в качестве якоря путем слияния его с хроматин-связывающим белком для набора фазоразделяющего белка, слитого с eDHFR с хроматином. После первоначального набора повышенная локальная концентрация белка, разделяющего фазы, проходит критическую концентрацию, необходимую для разделения фаз, и, таким образом, зародывает конденсат на якоре(рисунок 1В). Путем слияния флуоресцентных белков (например, mCherry и eGFP) с eDHFR и Halo, нуклеация и рост конденсатов могут быть визуализированы в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Поскольку взаимодействие между eDHFR и TMP является нековалентным, избыток свободного TMP может быть добавлен, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Затем это высвобождает белок разделения фаз из якоря и растворяет конденсат, связанный с хроматином.
Мы использовали этот инструмент для индуцирования образования ядерного тела de novo промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах в теломераз-отрицательных раковых клетках, которые используют альтернативное удлинение пути теломер (АЛТ) для поддержания теломер13,14.  Ядерные тела ПМЛ представляют собой безмембранные компартменты, участвующие во многих ядерных процессах15,16 и уникально локализованные в теломерах АЛТ с образованием АПП, для АЛТ теломер-ассоциированных тел ПМЛ17,18. Теломеры группируются в APB, по-видимому, для предоставления шаблонов восстановления для синтеза ДНК теломер, направленных на гомологию, в ALT19. Действительно, синтез ТЕЛОМЕРНОЙ ДНК был обнаружен в APB, и APB играют важную роль в обогащении факторов репарации ДНК на теломерах20,21. Однако механизмы, лежащие в основе сборки APB и кластеризации теломер в APB, были неизвестны. Поскольку белки теломер в АЛТ-клетках уникально модифицированы небольшим убиквитиноподобным модификатором (SUMO)22,многие компоненты APB содержат участки сумоилирования 22,23,24,25 и/или SUMO-взаимодействующие мотивы (SIM)26,27 и взаимодействия SUMO-SIM управляют разделением фаз28,мы предположили, что сумоилирование на теломерах приводит к обогащению SUMO/SIM-содержащих белков и Взаимодействия SUMO-SIM между этими белками приводят к разделению фаз.  Белок PML, который имеет три участка сумоилирования и один сайт SIM, может быть рекрутирован в сумоилированные теломеры для образования APB, а слияние жидких APB приводит к кластеризации теломер. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали систему химической димеризации для имитации образования APB, вызванного сумоилированием, путем набора SIM в теломеры(рисунок 2A)11. GFP сплавляется с Haloenzyme для визуализации и с теломер-связывающим белком TRF1 для закрепления димеризатора на теломерах. SIM-карта слита с eDHFR и mCherry. Кинетика образования конденсата и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, сопровождается визуализацией живых клеток.  Разделение фаз обменяется путем добавления избыточного свободного TMP, чтобы конкурировать с связыванием eDHFR. Иммунофлуоресценция (IF) и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) используются для определения состава конденсата и теломерной ассоциации. Рекрутинговая SIM обогащает SUMO на теломерах, а индуцированные конденсаты содержат PML и, следовательно, являются APB. Вербовка SIM-мутанта, который не может взаимодействовать с SUMO, не обогащает SUMO на теломерах и не индуцирует разделение фаз, что указывает на то, что фундаментальной движущей силой конденсации APB является взаимодействие SUMO-SIM. Соглашаясь с этим наблюдением, полимеры polySUMO-polySIM, которые сплавились с фактором связывания TRF2 RAP1, также могут индуцировать образование APB29. По сравнению с системой синтеза polySUMO-polySIM, где разделение фаз происходит до тех пор, пока производится достаточное количество белков, подход химической димеризации, представленный здесь, индуцирует разделение фаз по требованию и, таким образом, предлагает лучшее временное разрешение для мониторинга кинетики разделения фаз и процесса кластеризации теломер. Кроме того, эта система химической димеризации позволяет рекрутировать другие белки для оценки их способности индуцировать разделение фаз и кластеризацию теломер. Например, неупорядоженный белок, рекрутированный в теломеры, также может образовывать капли и кластерные теломеры, не вызывая образования APB, предполагая, что кластеризация теломер не зависит от химии APB и полагается только на жидкое свойство APB11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

Хроматин-ассоциированные конденсаты участвуют во многих ядерных процессах, но лежащие в их основе механизмы остаются неуловимыми. Этот протокол описывает химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на теломерах. Химический димеризатор состоит из двух связанных лигандов, каждый из которых может связываться с белком: галолиганд с гало-ферментом и триметоприм (TMP) с дигидрофолатредуктазой E. coli (eDHFR), соответственно. Слияние фермента Halo с теломерным белком прикрепляет димеризаторы к теломерам посредством ковалентного связывания Halo лиганд-фермент. Связывание TMP с eDHFR рекрутирует eDHFR-плавленую фазу, разделяющую белки на теломеры, и индуцирует образование конденсата. Поскольку взаимодействие TMP-eDHFR является нековалентным, конденсацию можно обратить вспять, используя избыточный свободный TMP, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Приведен пример индуцирования образования ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах и определения роста, растворения, локализации и состава конденсата. Этот метод может быть легко адаптирован для индуцирования конденсатов в других геномных местах путем слияния Halo с белком, который непосредственно связывается с местным хроматином или с dCas9, который нацелен на геномный локус с направляющей РНК. Предлагая временное разрешение, необходимое для визуализации одиночных клеток в реальном времени, сохраняя при этом разделение фаз в популяции клеток для биохимических анализов, этот метод подходит для исследования как образования, так и функции конденсатов, связанных с хроматином.

Репрезентативные изображения теломерной локализации SUMO, идентифицированные теломерной ДНК FISH и белка SUMO IF, показаны на рисунке 2. Клетки с набором SIM-карты обогащали SUMO1 и SUMO 2/3 на теломерах по сравнению с клетками с набором мутантов SIM. Это указывает на то, что вызванное д?...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

Этот протокол иллюстрирует химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на хроматине.  Показано образование ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах с химическими димеризаторами. Рост, растворение, локализацию и состав капель контролируются с помощью визуализации живых клеток, иммунофлуоресценции (IF) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Химические белковые конденсаты, индуцированные димеризацией, на теломерах

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Этот протокол описывает систему химической димеризации для индуцирования белковых конденсатов на теломерах. Он может быть легко адаптирован для индуцирования конденсатов на других геномных локусах и подходит для прощуптывания образования и функции конденсатов, связанных с хроматином. Этот метод обеспечивает временное разрешение, необходимое для визуализации живых клеток, и поддерживает разделение фаз в популяции клеток для биохимических анализов.Для начала растворите димеризаторы в ДМСО на 10 миллимоляров и храните их в пластиковых микроцентрифужных трубках при минус 80 градусах Цельсия для длительного хранения. Разбавить аликвоту 10-миллимолярного димеризатора в среде визуализации до концентрации запаса 10 микромолярной и хранить ее при минус 20 градусах Цельсия. Когда они будут готовы к использованию, разбавьте димеризаторы до конечной рабочей концентрации 100 наномоляров в питательной среде или среде визуализации.Посеять с 10 до пятой ячейки в круглых покровных стеклах диаметром 12 миллиметров, покрытых поли-D-лизином, в шестиямямямяцной пластине. Затем трансфектируют клетки с помощью мутантных плазмид Halo-GFP-TRF1 и mCherry-eDHFR-SIM или mCherry-eDFR-SIM и подождите от 24 до 48 часов, прежде чем приступить к иммунофлуоресценции. Добавьте к клеткам разбавленные 100 наномолярных димеризаторов и инкубируем их при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех-пяти часов.После инкубации зафиксируйте клетки в растворе PBS, содержащем 4%формальдегид и 0,1% тритона X-100, в течение 10 минут при комнатной температуре для пронизывания клеток. Затем трижды промыть клетки PBS. Крышка для стирки проскальзывает дважды с 50 микролитрами TBS-Tx и один раз с 50 микролитрами буфера разбавления антител.Инкубируйте каждый противоскользящий слип с 50 микролитрами первичного анти-PML, анти-SUMO-1 или анти-SUMO-2 и 3 антитела при четырех градусах Цельсия в увлажненной камере на ночь. Крышка для стирки трижды скользит с буфером разбавления антител для удаления несвязанным первичным антителом, затем инкубирует клетки с вторичным антителом в течение одного часа в темном ящике при комнатной температуре. После окрашивания крышка для стирки трижды скользит с TBS-Tx.Метьте слайды, добавляя два микролитра по одному микрограмму на миллилитр DAPI, затем переворачивайте крышку и помещайте их на каплю DAPI. Аспирировать лишнюю жидкость с края крышки. Запечатайте горку лаком для ногтей, дайте ей высохнуть и промойте верхнюю часть крышки водой.Поместите слайды в морозильную камеру до тех пор, пока не будет подана изображение. Посейте 10 до пятой клетки на 12-миллиметровой круглой крышке очков, покрытых поли-D-лизином, в шестиямяцной пластине и трансфектируем их с Halo-TRF1 и mCherry-eDHFR-SIM или mCherry-eDHFR-SIM мутантными плазмидами. Зафиксируйте клетки 4%-формальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре и промыть их четыре раза PBS.Для IF-FISH окрасьте клетки первичными и вторичными антителами и повторно зафиксируют их 4%-формальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре, затем промыть их четыре раза PBS и обезвоживать крышку в серии этанола. Инкубируют крышку с помощью 488 теломер C-PNA зонда в пяти микролитрах гибридизационного раствора при 75 градусах Цельсия в течение пяти минут, затем инкубируют крышку на ночь в увлажненной камере при комнатной температуре. Промывайте крышку три раза с помощью буфера для стирки в течение двух минут на стирку при комнатной температуре и монтируем их с помощью одного микрограмма на миллилитр DAPI в монтажных носителях для визуализации.Для визуализации в реальном времени установите крышку в магнитных камерах на нагретой ступени в камере окружающей среды, поддерживая клетки в одном миллилитрах среды визуализации без фенол-красного цвета. Настройте микроскоп и аппарат контроля окружающей среды, как описано в тексте рукописи. Найдите клетки с ярким сигналом GFP на теломерах и диффузным сигналом mCherry в цитозоле.Найдите около 20 клеток, запоминая каждую позицию с помощью информации XYZ, и настройте параметры для покадровой визуализации. Используйте расстояние в 0,5 микрометра для восьми микрометров в Z и пятиминутный интервал времени в течение двух-четырех часов для каналов GFP и mCherry. Используйте 30% от 594 нанометров и 50% от 488 нанометровой интенсивности мощности, со временем экспозиции 200 миллисекунд и усилением камеры 300.Запустите визуализацию и пройдите один временной цикл в качестве предварительной димеризации. Затем приостановите визуализацию, добавьте 0,5 миллилитра носителя изображения, содержащего 15 микролитров 10 микромоляльных димеризаторов, в камеру визуализации, заботясь о том, чтобы не коснуться сцены, и возобновите визуализацию. Когда все будет готово к обратной димеризации, приостановите визуализацию и добавьте в камеру визуализации 0,5 миллилитра среды визуализации, содержащей два микролитра 100 миллимолярного запаса TMP.Продолжайте визуалить клетки в течение одного-двух часов. Для фиксированной визуализации используйте ту же настройку микроскопа, что и живая визуализация, но без нагрева сцены. Найдите от 30 до 50 клеток с красным сигналом, чтобы выбрать для трансфектированных клеток.Получайте изображения с интервалом 0,3 микрометра в общей сложности восемь микрометров в Z.Используйте 80% 647 нанометров, 80% 561 нанометра и 70% 488 нанометровой интенсивности мощности, со временем экспозиции 600 миллисекунд и коэффициентом усиления камеры 300. Теломерная локализация SUMO была идентифицирована с использованием иммунофлуоресценции теломерной ДНК FISH и белка SUMO. Клетки с рекрутированием SIM-карты обогащаютСЯ SUMO-1 и SUMO-2 и 3 по сравнению с клетками с набором мутантов SIM, что указывает на то, что димеризация SIM-индуцировала обогащение SUMO на теломерах, зависит от взаимодействий SUMO-SIM.Здесь показан покадровый фильм TRF-1 и SIM-карты после димеризации. SIM был успешно завербован в теломеры, и фокусы SIM и TRF-1 стали больше и ярче, как и прогнозировалось для образования и роста капель жидкости. Кроме того, наблюдалось слияние очагов TRF-1, что приводило к кластеризации теломер, о чем свидетельствует уменьшение числа теломер и увеличение интенсивности теломер с течением времени.Напротив, SIM-мутант был рекрутирован в теломеры после димеризации, но не индуцировал образование капель или кластеризацию теломер, что указывает на то, что разделение фаз и кластеризация теломер обусловлены взаимодействиями SUMO-SIM. Изменение разделения фаз и кластеризации теломер наблюдалось после добавления избыточного свободного ТМЗ. Число теломер увеличивалось, а интенсивность теломер со временем уменьшалась.Репрезентативные изображения APB, идентифицированных теломерной ДНК FISH и белка PML IF, показаны здесь. Клетки с набранной SIM-картой имеют больше ADB, чем клетки с набранным SIM-мутантом, предполагая, что конденсаты, индуцированные димеризацией, действительно являются APB. При выполнении этого протокола не подвергайте светочувствительные димеризаторы воздействию света.Работайте в темном помещении с лампой, которая излучает красный свет и оберните клетки алюминиевой фольгой во время инкубации. Следуя этой процедуре, бесконтактная маркировка может быть использована для создания полного списка компонентов в индуцированном конденсате. Живая визуализация может быть использована для отслеживания динамики компонентов в конденсате.Эти методы могут помочь определить роли управления контролем состава конденсата.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

В естественных условиях обнаружения белок-белковых взаимодействий на микро-узорной поверхности

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Визуализация митохондриальной дыхательной функции использованием цитохрома C Оксидазы / сукцинатдегидрогеназы (ЦОГ / SDH) Дважды маркировки гистохимии

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Белки МУДРОСТЬ Workbench для<em&gt; В кремнии</em&gt;<em&gt; De Novo</em&gt; Дизайн биомолекул

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Высокопроизводительного скрининга для наследования на основе белков в S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Сочетание химических Cross-linking и масс-спектрометрии комплексов интактных белков для изучения архитектуры мульти субъединицы белка сборок

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Количественная оценка конкретных участков белка лизин ацетилирования и стехиометрии Succinylation с помощью приобретения данных независимые масс-спектрометрия

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...