Name: chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (1K22CA23763201'den H.Z.'ye, GM118510'dan D.M.C.'ye) ve Charles E. Kaufman vakfı tarafından H.Z. Yazarlar, makaleyi düzelttikten sonra Jason Tones'a teşekkür etmek istiyor.

1. Geçici hücre hatlarının üretimi
<ol><li>6-6-D-lizin ile kaplanmış 22 x 22 mm cam kapaklar (canlı görüntüleme için) veya 12 mm çapında dairesel kapaklar (IF veya FISH için) üzerindeki Kültür U2OS kabul hücreleri büyüme ortamına sahip kuyu plakası (DMEM'de%10 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin-Streptomisin çözeltisi) %60-70 izdiah edene kadar.</li>
	<li>Transeksiyondan önce büyüme ortamını 1 mL transfeksiyon ortamı (Penisilin-Streptomisicin çözeltisi olmayan büyüm...

<ol>
	<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease.">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates+in+the+nucleus.">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies.">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li><li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+phase+separation+in+live+cells:+diagnosis,+caveats,+and+functional+consequences.">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes &amp; Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li><li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus.">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li><li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation.">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells.">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li><li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+(PML)+body.">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks.">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li><li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics:+catch+me+if+you+can.">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li><li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+nuclear+body+biogenesis,+carcinogenesis,+and+targeted+therapy.">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li><li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer.">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li><li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+DNA+repair+pathways+converge.">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li><li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination.">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways.">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li><li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres.">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li><li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SMC5/6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins.">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li><li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation.">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li><li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation.">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li><li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage.">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li><li>Yal&#231;in, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction.">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li><li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses.">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li><li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies.">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li><li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52.">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li><li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins.">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li><li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers.">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+kinetochore+function.">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li><li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis.">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li><li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance.">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li><li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer.">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets.">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome.">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li><li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+tagging:+a+step-by-step+protocol.">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li></ol>

Bu protokol, telomerler üzerindeki kondensatların kimyasal bir dimerizasyon sistemi ile oluşumunu ve çözünmesini göstermiştir. Faz ayırma kinetiği ve damlacık füzyon kaynaklı telomer kümelenmesi canlı görüntüleme ile izlenir. Yoğuşma lokalizasyonu ve bileşimi DNA FISH ve protein IF ile belirlenir.
Bu protokolde iki kritik adım vardır. Birincisi protein ve dimerizer konsantrasyonunu belirlemektir. Genomik bir lokusta lokal faz ayrımını teşvik etmedeki başarı, faz ay...

Birçok protein ve nükleik asit sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) tabir edilir ve hücrelerde biyokimyayı düzenlemek için biyomoleküler kondensatlara kendiliğinden monte edilir1,2. Kromatin bağlayıcı proteinlerin LLPS'si, spesifik genomik loci ile ilişkili ve çeşitli lokal kromatin fonksiyonlarına karışan kondensatların oluşumuna yol açar3. Örneğin, HP1 proteininin LLPS'si, transkripsiyon4,5,TRANSKRipsiyon faktörlerinin LLPS'si transkripsiyon 6'yı düzenlemek için transkripsiyon merkezlerinin form transkripsiyon merkezlerini düzenlemek için heterokromatin etki alanlarının oluşumunun temelini oluşturur, nascent mRNA'ların LLPS'si ve çok cinsiyetli taraklar proteini, histone mRNA'larının transkripsiyonunu ve işlenmesini düzenlemek için histone lokus cisimleri üretir7.  Bununla birlikte, kromatin ilişkili kondensatların keşfedildiği birçok örneğe rağmen, kondensat oluşumu, regülasyonu ve işlevinin altında bulunan mekanizmalar yeşaya iyi anlaşılmamaktadır. Özellikle, tüm kromatin ilişkili kondensatlar LLPS yoluyla oluşmaz ve canlı hücrelerde yoğuşma oluşumunun dikkatli değerlendirmelerine hala ihtiyaç vardır8,9. Örneğin, faredeki HP1 proteini canlı hücrelerde sıvı damlacıkları oluşturmak için sadece zayıf bir kapasiteye sahip olduğu ve heterokromatin odaklarının çökmüş polimer globülleri10gibi davrandığı gösterilmiştir. Bu nedenle, canlı hücrelerde kromatin üzerinde de novo kondensatları indükleyen araçlar, özellikle yoğuşma oluşumunun kinetiğini, ortaya çıkan kondensatların fiziksel ve kimyasal özelliklerini ve yoğuşma oluşumunun hücresel sonuçlarını izlemek için canlı görüntüleme ve biyokimyasal tahlillerin kullanılmasına izin veren araçlar arzu edilir.
Bu protokol, kromatin11'de protein kondensatlarını indük etmek için kimyasal bir karartma sistemi bildirir (Şekil 1A). Dimerizer iki bağlı protein etkileşimli liganddan oluşur: trimethoprim (TMP) ve Halo ligand ve konyak reseptörlerine kaynaşmış proteinleri küçültebilir: Escherichia coli dihidrofolat redüktaz (eDHFR) ve bakteriyel alkildehalogenaz enzimi (Halo enzimi), sırasıyla12. Halo ligand ve Halo enzimi arasındaki etkileşim, Halo enziminin kromatin bağlayıcı bir proteine kaynaştırılarak bir çapa olarak kullanılmasına izin vererek eDHFR ile kaynaşmış faz ayırıcı bir proteini kromatin ile bir hale getirmek için kullanılır. İlk işe alımdan sonra, faz ayırma proteininin artan lokal konsantrasyonu faz ayırma için gereken kritik konsantrasyonu geçirir ve böylece çapadaki bir yoğuşma çekirdeklerini atar (Şekil 1B). Floresan proteinlerin (örneğin mCherry ve eGFP) eDHFR ve Halo'ya kaynaştırılmasıyla, floresan mikroskopi ile çekirdeklenme ve yoğuşmaların büyümesi gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir. eDHFR ve TMP arasındaki etkileşim kurda olmayan olduğundan, eDHFR bağlama için dimerizer ile rekabet etmek için fazla ücretsiz TMP eklenebilir. Bu daha sonra faz ayırma proteinini çapadan serbest bırakacak ve kromatinle ilişkili yoğuşma çözünecektir.
Bu aracı telomer bakımı için alternatif bir telomer (ALT) yolu uzatma kullanan telomer negatif kanser hücrelerindeki telomerler üzerinde de novo promiyelositik lösemi (PML) nükleer vücut oluşumunu teşvik etmek için kullandık13,14.  PML nükleer gövdeler, birçok nükleer proses15,16'da yer alan membransız bölmelerdir ve ALT telomer ilişkili PML gövdeleri 17,18için APB'ler oluşturmak için ALT telomerlere benzersiz bir şekilde lokalize edilir. Telomerler API'ler içinde kümelenir, muhtemelen ALT19'dahomolojiye yönelik telomer DNA sentezi için onarım şablonları sağlamak için. Gerçekten de, TELOMER DNA sentezi API'lerde tespit edilmiştir ve API'ler telomerlerde DNA onarım faktörlerini zenginleştirmede temel roller oynamaktadır20,21. Bununla birlikte, APB'ler içinde APB montajı ve telomer kümelemenin altında kalan mekanizmalar bilinmiyordu. ALT hücrelerindeki telomer proteinleri küçük ubiquitin benzeri değiştirici (SUMO' lar)22tarafından benzersiz bir şekilde değiştirildiğinden, birçok APB bileşeni sumoylation siteleri 22 , 23,24,25 ve/veya SU içerirMO ile etkileşime giren motifler (SIM'ler)26,27 ve SUMO-SIM etkileşimleri fazayrımını 28'egötürür, telomerler üzerindeki sumoilasyonun protein içeren SUMO/ SIM'in zenginleşmesine yol açtığını ve Bu proteinler arasındaki SUMO-SIM etkileşimleri faz ayrımına yol açar.  Üç sumoylation bölgesi ve bir SIM sitesi olan PML proteini, API'ler oluşturmak için sumoylated telomerlere işe alınabilir ve sıvı USB'lerin birleşmesi telomer kümelenmesine yol açar. Bu hipotezi test etmek için, telomerlere SIM alarak sumoilasyon kaynaklı APB oluşumunu taklit etmek için kimyasal dimerizasyon sistemini kullandık (Şekil 2A)11. GFP, görselleştirme için Haloenzim'e ve dimerizörü telomerlere tutturmak için telomer bağlayıcı protein TRF1'e kaynaştırılır. SIM, eDHFR ve mCherry ile kaynaşmıştır. Canlı hücre görüntüleme ile kondensat oluşumu ve damlacık füzyon kaynaklı telomer kümelenmesi kinetiği takip edilir.  Faz ayrımı, eDHFR bağlama ile rekabet etmek için fazla boş TMP eklenerek tersine çevrilir. Kondens bileşimini ve telomerik ilişkiyi belirlemek için immünoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) kullanılır. SIM alımı telomerlerde SUMO'yu zenginleştirir ve indüklenen kondensatlar PML içerir ve bu nedenle API'lerdir. SUMO ile etkileşime giremeyen bir SIM mutantını işe almak, TELOMERLER üzerinde SUMO'yu zenginleştirmez veya faz ayrımına neden olmaz, bu da APB yoğuşması için temel itici gücün SUMO-SIM etkileşimi olduğunu gösterir. Bu gözleme katılarak, TRF2 bağlayıcı faktör RAP1 ile kaynaşmış poliSUMO-polySIM polimerleri de APB oluşumunu teşvik edebilir29. Yeterli protein üretildiği sürece faz ayrımının gerçekleştiği poliSUMO-polisSIM füzyon sistemi ile karşılaştırıldığında, burada sunulan kimyasal dimerizasyon yaklaşımı talep üzerine faz ayrımına neden olur ve böylece faz ayırma ve telomer kümeleme işleminin kinetiğini izlemek için daha iyi zamansal çözünürlük sunar. Ek olarak, bu kimyasal dimerizasyon sistemi, faz ayırma ve telomer kümelemedeki yeteneklerini değerlendirmek için diğer proteinlerin işe alınmasına izin veriyor. Örneğin, telomerlere katılan düzensiz bir protein, APB oluşumunu teşvik etmeden damlacıklar ve küme telomerleri de oluşturabilir, bu da telomer kümelemenin APB kimyası bağımsız olduğunu ve sadece APB sıvı özelliğine dayandığını öne sürmez11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT25053CI</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >28906</td>
			<td >Prepare 1% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6 Well Culture Plate</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10861-554</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum Foil</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >01-213-101</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-mCherry antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab183628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-PML antibody</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc966</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO1 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >Ab32058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-SUMO2/3 antibody</td>
			<td >Cytoskeleton</td>
			<td >Asm23</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking Reagent</td>
			<td >Roche</td>
			<td >11096176001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP9706100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BTX Tube micro 1.5ML&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89511-258</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Circle Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3350</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscope&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >MQS31000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl Sulphoxide&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >472301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >MT10017CV</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMCCD Camera</td>
			<td >iXon Life&#160;</td>
			<td >897</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4355221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A4766801</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formamide, Deionized</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >46-101-00ML</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A28181</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A32733</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-000-122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laser merge module&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >NIIMHF47180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21083027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >11668027</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Figure plotting software, MATLAB</td>
			<td >The MathWorks</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slide Box</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >34487</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail Polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >50-949-071</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Imaging software, NIS-Elements&#160;</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >51985091</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Bemis</td>
			<td >13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS 10x, pH 7.4</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >70-011-044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin Solution,100X</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Piezo Z-Drive&#160;</td>
			<td >Physik Instrumente (PI)</td>
			<td >91985</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tips</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10017</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >22-037-246</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-Lysine solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP922I-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spinning disk</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td >CSU-X1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square Cover Slips</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >3305</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS 10x solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP2471500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TelC-Alexa488</td>
			<td >PNA Bio</td>
			<td >F1004</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TMP</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TNH</td>
			<td >Synthesized by Chenoweth lab</td>
			<td ></td>
			<td >Available upon request</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris Solution</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >92-901-00ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100 10% Solution</td>
			<td >MilliporeSigma</td>
			<td >64-846-350ML</td>
			<td >Prepare 0.5% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >U2Os cell line</td>
			<td >From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)</td>
			<td >HTB-96</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >NC9524612</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical dimerization-induced protein condensates on telomeres

Kromatinle ilişkili kondensatlar birçok nükleer proseste dahil edilir, ancak alttaki mekanizmalar zor bulunur. Bu protokol, telomerler üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenen bir protein dimerizasyon sistemini açıklar. Kimyasal dimerizer, her biri bir proteine bağlanabilen iki bağlı liganddan oluşur: Halo ligand Halo enzimine ve trimethoprim 'e (TMP) sırasıyla E. coli dihidrofolat redüktaz (eDHFR). Halo enziminin bir telomer proteinine füzyonu, dimerizatörleri katvalent Halo ligand enzim bağlama yoluyla telomerlere tuttur. TMP'nin eDHFR'ye bağlanması, proteinleri telomerlere ayıran eDHFR ile kaynaşmış fazı işe toplar ve yoğuşma oluşumunu teşvik eder. TMP-eDHFR etkileşimi kurvalent olmadığından, yoğunlaşma, eDHFR bağlama için dimerizer ile rekabet etmek için fazla boş TMP kullanılarak tersine çevrilebilir. Telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer vücut oluşumunun teşvik edilmesi ve yoğuşma büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşiminin belirlenmesine örnek gösterilmiştir. Bu yöntem, Halo'yu doğrudan lokal kromatin veya bir kılavuz RNA ile genomik lokusa hedeflenen dCas9'a bağlayan bir proteine kaynaştırarak diğer genomik konumlardaki yoğuşmalara neden olmak için kolayca uyarlanabilir. Biyokimyasal tahliller için hücre popülasyonunda faz ayrımını korurken tek hücreli canlı görüntüleme için gereken zamansal çözünürlüğü sunarak, bu yöntem kromatin ilişkili kondensatların hem oluşumunu hem de işlevini yok etmek için uygundur.

Telomer DNA FISH ve SUMO protein IF ile tanımlanan SUMO'nun telomer lokalizasyonunun temsili görüntüleri Şekil 2'degösterilmiştir. SIM işe alımı olan hücreler, SIM mutant işe alımı olan hücrelere kıyasla telomerler üzerinde SUMO1 ve SUMO 2/3'ü zenginleştirdi. Bu, telomerlerde SIM dimerizasyon kaynaklı SUMO zenginleştirmenin SUMO-SIM etkileşimlerine bağlı olduğunu gösterir.
Küçültme sonrası TRF1 ve SIM'in temsili bir zaman atlamalı fi...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres at JoVE.com

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

Bu protokol, kromatin üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenmiş bir protein dimerizasyon sistemini göstermektedir.  Kimyasal dimerizatörlü telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer gövdesinin oluşumu gösterilmiştir. Damlacık büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşimi canlı hücre görüntüleme, immünofluoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile izlenir.

Telomerlerde Kimyasal Dimerizasyona Bağlı Protein Kondensatları

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Bu protokol, telomerlerde protein kondensatlarını indük etmek için kimyasal dimerizasyon sistemini açıklar. Diğer genomik locilerde yoğuşmalara neden olmak için kolayca uyarlanabilir ve kromatin ilişkili kondensatların oluşumunu ve işlevini yoklamak için uygundur. Bu yöntem canlı hücre görüntüleme için gerekli zamansal çözünürlüğü sunar ve biyokimyasal tahliller için hücre popülasyonunda faz ayrımını sağlar.Başlamak için, DMSO'daki dimerizatörleri 10 milimolar olarak çözün ve uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derecede plastik mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Görüntüleme ortamında 10 milimolar dimerizer'lık bir aliquot'ı 10 mikromolar stok konsantrasyonuna seyreltin ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kullanıma hazır olduğunuzda, dimerizerleri büyüme ortamında veya görüntüleme ortamında 100 nanomolar nihai çalışma konsantrasyonuna seyreltin.Tohum 10'dan beşinci hücrelere 12 milimetre çapında dairesel kapak camları altı kuyulu bir plakada Poli-D-Lizin ile kaplanmıştır. Daha sonra hücreleri Halo-GFP-TRF1 ve mCherry-eDHFR-SIM veya mCherry-eDFR-SIM mutant plazmidleri ile transfect ve immünofluoresansa geçmeden önce 24 ila 48 saat bekleyin. Seyreltilmiş 100 nanomoler dimerizörü hücrelere ekleyin ve dört ila beş saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.kuluçkadan sonra, hücrelerin dengesini sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 formaldehit ve% 0.1 Triton X-100 içeren PBS çözeltisinde hücreleri sabitleyin. Ardından hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Yıkama kapağı iki kez 50 mikrolitre TBS-Tx ve bir kez de 50 mikrolitre antikor seyreltme tamponu ile kayar.Her kapak kaymasını bir gecede nemlendirilmiş bir odada 50 mikrolitre birincil anti-PML, anti-SUMO-1 veya anti-SUMO-2 ve 3 antikoru ile dört santigrat derecede inkübte edin. İlişkisiz birincil antikoru çıkarmak için antikor seyreltme tamponu ile üç kez kapak kaymaları yıkayın, ardından hücreleri oda sıcaklığında karanlık bir kutuda bir saat boyunca ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Boyamadan sonra, yıkama kapağı TBS-Tx ile üç kez kayar.Mililitre DAPI başına bir mikrogramdan iki mikrolitre ekleyerek slaytları etiketleyin, ardından kapak kaymalarını ters çevirin ve DAPI damlasına yerleştirin. Kapak kaymasının kenarından ekstra sıvı epire edin. Kaydırağı oje ile kapatın, kurumasını bekleyin ve kapak kaymasının üst kısmını suyla durulayın.Slaytları görüntülemeye kadar dondurucuya yerleştirin. Tohum 10'dan beşinci hücrelere 12 milimetrelik dairesel kapak camları altı kuyulu bir tabakta Poly-D-Lizin ile kaplanmış ve halo-TRF1 ve mCherry-eDHFR-SIM veya mCherry-eDHFR-SIM mutant plazmidlerle transfect. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 formaldehit ile sabitleyin ve PBS ile dört kez yıkayın.IF-FISH için, hücreleri birincil ve ikincil antikorlarla lekeleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 formaldehit ile refix edin, ardından PBS ile dört kez yıkayın ve kapak kaymalarını bir etanol serisinde susuz bırakın. Kapak kaymalarını 488 telomer C-PNA probu ile beş dakika boyunca 75 santigrat derecede beş mikrolitre hibridizasyon çözeltisinde kuluçkaya yatırın, ardından kapak kaymalarını oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada bir gecede kuluçkaya yatırın. Kapak kaymalarını oda sıcaklığında yıkama başına iki dakika yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve görüntüleme için montaj ortamlarına mililitre DAPI başına bir mikrogram ile monte edin.Canlı görüntüleme için, kapak kaymalarını manyetik odalara bir çevre odasında ısıtılmış bir aşamaya monte edin ve hücreleri fenol kırmızısı olmadan bir mililitre görüntüleme ortamında saklayın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi mikroskop ve çevre kontrol cihazını kurun. Telomerlerde parlak bir GFP sinyali ve sitozolde difüzör mCherry sinyali olan hücreleri bulun.XYZ bilgileriyle her pozisyonu ezberleyen yaklaşık 20 hücre bulun ve hızlandırılmış görüntüleme için parametreler ayarlayın. Z'de toplam sekiz mikrometre için 0,5 mikrometre aralığı ve hem GFP hem de mCherry kanalları için iki ila dört saat boyunca beş dakikalık zaman aralığı kullanın. 594 nanometrenin %30'unu ve 488 nanometre güç yoğunluğunun %50'sini kullanın, pozlama süreleri 200 milisaniye ve kamera kazancı 300'dür.Görüntülemeye başlayın ve bir zaman döngüsünü ön dimerizasyon olarak alın. Daha sonra görüntülemeyi duraklatın, görüntüleme odasına 15 mikrolitre 10 mikromoler dimerizer içeren 0,5 mililitre görüntüleme ortamı ekleyin, sahneye dokunmamaya dikkat edin ve görüntülemeye devam edin. Dimerizasyonu tersine çevirmeye hazır olduğunuzda, görüntülemeyi duraklatın ve görüntüleme odasına 100 milimoler stok TMP'nin iki mikrolitresini içeren 0,5 mililitre görüntüleme ortamı ekleyin.Hücreleri görüntülemeye bir ila iki saat devam edin. Sabit görüntüleme için, canlı görüntüleme ile aynı mikroskop kurulumunu kullanın, ancak sahne ısıtması olmadan. Transfected hücreler için seçmek için kırmızı sinyal ile yaklaşık 30 ila 50 hücre bulun.Z.Use'ta toplam sekiz mikrometre için 0,3 mikrometre aralığına sahip görüntüler elde edin. SUMO'nun telomer lokalizasyonu telomer DNA FISH ve SUMO protein immünofluoresansı kullanılarak belirlendi. SIM işe alımına sahip hücreler, SIM mutant işe alımına sahip hücrelere kıyasla SUMO-1 ve SUMO-2 ve 3'ü zenginleştirmiş, bu da TELOMERLERDE SIM dimerizasyonuna bağlı SUMO zenginleştirmenin SUMO-SIM etkileşimlerine bağlı olduğunu gösterir.Burada, küçültme sonrası TRF-1 ve SIM'in hızlandırılmış bir filmi gösterilmiştir. SIM telomerlere başarıyla alındı ve sıvı damlacık oluşumu ve büyümesi için öngör edildiği gibi hem SIM hem de TRF-1 odakları daha büyük ve parlak hale geldi. Ayrıca, telomere sayısının azalmasında ve zamanla artan telomer yoğunluğunda gösterildiği gibi telomer kümelenmesine yol açan TRF-1 odaklarının füzyonu gözlenmiştir.Buna karşılık, SIM mutant dimerizasyondan sonra telomerlere alındı, ancak faz ayrımı ve telomer kümelemenin SUMO-SIM etkileşimleri tarafından yönlendirdiğini gösteren herhangi bir damlacık oluşumuna veya telomer kümelenmesine neden olmadı. Faz ayrımı ve telomer kümelemenin tersine dönmesi, fazla serbest TMP ekledikten sonra gözlendi. Telomer sayısı arttı ve telomer yoğunluğu zamanla azaldı.Telomer DNA FISH ve PML protein IF ile tanımlanan API'lerin temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. SIM'in işe alındığı hücreler, SIM mutant işe alınan hücrelerden daha fazla API'ye sahiptir, bu da küçültme kaynaklı kondensatların gerçekten API'ler olduğunu düşündürmektedir. Bu protokolü gerçekleştirirken ışığa duyarlı karartıcıları ışığa maruz bırakmayın.Kırmızı ışık yayan bir lamba ile karanlık bir odada çalışın ve kuluçka sırasında hücreleri alüminyum folyo ile sarın. Bu yordamı takiben, yakınlık etiketlemesi, indüklenen kondensattaki bileşenlerin kapsamlı bir listesini oluşturmak için kullanılabilir. Canlı görüntüleme, yoğuşmadaki bileşenlerin dinamiklerini takip etmek için kullanılabilir.Bu yöntemler, yoğuşma kompozisyon denetimini yönetme rollerini belirlemeye yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Sitokrom kullanarak Mitokondriyal Solunum Fonksiyon Görselleştirme C Oksidaz / Succinat Dehidrogenaz (COX / SDH) Çift-etiketleme Histokimya

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein AKIL: A Tezgahı<em&gt; Siliko olarak</em&gt;<em&gt; De novo</emBiyomoleküllerin&gt; Tasarım

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...