Name: fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

Siamo grati alla dottoressa A. Cuttriss per la sua attenta revisione del manoscritto. Questo lavoro è finanziato dalla sovvenzione ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) e dal CNRS.

1. Purificazione dellatto NBD-C2
NOTA: Sebbene questo protocollo dettagli l'uso di un distruttore cellulare per rompere i batteri, può essere modificato per utilizzare altre strategie di lisi(ad esempio, una stampa francese). All'inizio della purificazione, è obbligatorio utilizzare un tampone appena degassato, filtrato e integrato con 2 mM ditiotreitolo (DTT) per prevenire l'ossidazione della cisteina. Tuttavia, per la fase di etichettatura delle proteine, è fondamentale ...

I risultati di questi test si basano direttamente sui segnali dei sensori lipidici fluorescenti. Pertanto, la purificazione di queste sonde etichettate in un rapporto 1: 1 con NBD e senza contaminazione da fluoroforo NBD libero è un passo critico in questo protocollo. È inoltre obbligatorio verificare se l'LTP in esame è correttamente piegato e non aggregato. La quantità di LTP testata nei saggi di estrazione deve essere uguale o superiore a quella delle molecole PS o PI(4)P accessibili per misurare correttamente se ...

La distribuzione precisa dei lipidi tra le diverse membrane e all'interno delle membrane delle cellule eucariotiche1,2 ha profonde implicazioni biologiche. Decifrare come funzionano le LTP è un problema importante nella biologia cellulare3,4,5,6e gli approcci in vitro sono di grande valore nell'affrontare questo problema7,8,9,10,11. Qui, viene presentata una strategia in vitro,basata sulla fluorescenza, che è stata determinante nello stabilire che diverse proteine ORP / Osh influenzano lo scambio PS / PI (4) P tra le membrane cellulari12 e quindi costituiscono una nuova classe di LTP. PS è un glicerofosfolipide anionico che rappresenta il 2-10% dei lipidi totali di membrana nelle cellule eucariotiche13,14,16. È distribuito lungo un gradiente tra l'ER e il PM, dove rappresenta il 5-7% e fino al 30% dei glicerofosfolipidi, rispettivamente17,18,19. Inoltre, la PS è essenzialmente concentrata nel foglietto citosolico del PM. Questo accumulo e la partizione irregolare di PS nel PM sono fondamentali per i processi di segnalazione cellulare19. A causa della carica negativa delle molecole di PS, il foglietto citosolico del PM è molto più anionico del foglietto citosolico di altri organelli1,2,19,20. Ciò consente il reclutamento, tramite forze elettrostatiche, di proteine di segnalazione come il substrato C-chinasi ricco di alanina miristoilata (MARCKS)21, sarcoma (Src)22, l'oncogene virale del sarcoma kirsten-ratto (K-Ras)23e il substrato della tossina botulinica C3 correlato a Ras 1 (Rac1)24 che contengono un tratto di aminoacidi caricati positivamente e una coda lipidica.
Ps è anche riconosciuta dalla proteina chinasi C convenzionale in modo stereoselettivo tramite un dominio C225. Tuttavia, PS è sintetizzato in ER26, indicando che deve essere esportato nel PM prima che possa svolgere il suo ruolo. Non si sapeva come ciò fosse stato realizzato19 fino alla scoperta che, nel lievito, Osh6p e Osh7p trasferiscono PS dal ER al PM27. Questi LTP appartengono a una famiglia evolutivamente conservata negli eucarioti il cui membro fondatore è OSBP e che contiene proteine (ORP nell'uomo, proteine dell'Osh nel lievito) che integrano un dominio correlato all'OSBP (ORD) con una tasca per ospitare una molecola lipidica. Osh6p e Osh7p sono costituiti solo da un ORD le cui caratteristiche strutturali sono adattate per legare specificamente PS e trasferirlo tra le membrane. Tuttavia, non era chiaro come queste proteine trasferivano direzionalmente il PS dall'ER al PM. Osh6p e Osh7p possono intrappolare PI(4)P come ligando lipidico alternativo12. Nel lievito, PI(4)P è sintetizzato dal fosfatidilinositolo (PI) nel Golgi e nel PM da PI 4-chinasi, Pik1p e Stt4p, rispettivamente. Al contrario, non c'è PI(4)P nella membrana ER, poiché questo lipide viene idrolizzato in PI dalla fosfatasi Sac1p. Quindi, un gradiente PI(4)P esiste in entrambe le interfacce ER/Golgi ed ER/PM. Osh6p e Osh7p trasferiscono PS dall'ER al PM tramite cicli di scambio PS/PI(4)P utilizzando il gradiente PI(4)P che esiste tra queste due membrane12.
Entro un ciclo, Osh6p estrae PS dall'ER, scambia PS per PI(4)P al PM e trasferisce PI(4)P all'ER per estrarre un'altra molecola di PS. Osh6p/Osh7p interagiscono con Ist2p28, una delle poche proteine che si connettono e portano la membrana ER e il PM in stretta vicinanza tra loro per creare siti di contatto ER-PM nel lievito29,30,31. Inoltre, l'associazione di Osh6p con membrane caricate negativamente diventa debole non appena la proteina estrae uno dei suoi ligandi lipidici a causa di un cambiamento conformazionale che modifica le sue caratteristiche elettrostatiche32. Questo aiuta Osh6p accorciando il tempo di permanenza della membrana, mantenendo così l'efficienza della sua attività di trasferimento lipidico. Combinato con il legame a Ist2p, questo meccanismo potrebbe consentire a Osh6p / 7p di eseguire rapidamente e con precisione lo scambio lipidico all'interfaccia ER / PM. Nelle cellule umane, le proteine ORP5 e ORP8 eseguono lo scambio PS/PI(4)P nei siti di contatto ER-PM attraverso meccanismi distinti33. Hanno un ORD centrale, simile a Osh6p, ma sono direttamente ancorati all'ER tramite un segmento transmembranaC-terminale 33 e si agganciano al PM tramite un dominio di omologia Pleckstrin (PH) N-terminale che riconosce PI(4)P e PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 utilizza PI(4)P per trasferire PS, ed è stato dimostrato che ORP5/8 regola ulteriormente i livelli di PM PI(4,5)P2 e presumibilmente modula le vie di segnalazione. A sua volta, una diminuzione dei livelli di PI(4)P e PI(4,5)P2 abbassa l'attività di ORP5/ORP8 poiché queste proteine si associano al PM in modo dipendente dal PIP. La sintesi di PS anormalmente alta, che porta alla sindrome di Lenz-Majewski, influisce sui livelli di PI(4)P attraverso ORP5/836. Quando l'attività di entrambe le proteine è bloccata, ps diventa meno abbondante al PM, abbassando la capacità oncogenica di segnalare le proteine37.
Al contrario, la sovraespressione di ORP5 sembra promuovere l'invasione delle cellule tumorali e i processi metastatici38. Pertanto, le alterazioni dell'attività di ORP5/8 possono modificare gravemente il comportamento cellulare attraverso cambiamenti nell'omeostasi lipidica. Inoltre, ORP5 e ORP8 occupano siti di contatto ER-mitocondri e conservano alcune funzioni mitocondriali, possibilmente fornendo PS39. Inoltre, ORP5 si localizza nei siti di contatto delle goccioline lipidiche ER per fornire PS alle goccioline lipidiche mediante scambio PS / PI (4) P40. La strategia qui descritta per misurare (i) l'estrazione di PS e PI(4)P dai liposomi e (ii) il trasporto di PS e PI(4)P tra liposomi è stata ideata per stabilire e analizzare l'attività di scambio PS/PI(4)P di Osh6p/Osh7p12,32 e utilizzata da altri gruppi per analizzare l'attività di ORP5/ORP835 e di altre LTP10, 41. Si basa sull'uso di un lettore di piastre a fluorescenza, uno spettrofluorometro standard in formato L e due sensori fluorescenti, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP, in grado di rilevare rispettivamente PS e PI (4) P.
NBD-C2Lact corrisponde al dominio C2 della glicoproteina, la lattaderina, che è stato riprogettato per includere un'unica cisteina esposta a solvente vicino al presunto sito di legame PS; un fluoroforo NBD sensibile alla polarità (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) è legato covalentemente a questo residuo (Figura 1A)12. Per essere più precisi, il dominio C2 della lattaderina (Bos taurus, UniProt: Q95114,residui 270-427) è stato clonato in un vettore pGEX-4T3 da esprimere in fusione con la glutatione S-transferasi (GST) in Escherichia coli. La sequenza C2Lact è stata quindi mutata per sostituire due residui di cisteina accessibili con solvente (C270, C427) con residui di alanina e per introdurre un residuo di cisteina in una regione vicino al presunto sito di legame con PS (mutazione H352C) che può essere successivamente etichettato con N,N'-dimetil-N-(iodoacetil)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) etilene diammina (IANBD) 12. Un sito di scissione per la trombina è presente tra la proteina GST e l'N-terminus del dominio C2. Un grande vantaggio è che questo dominio riconosce selettivamente PS in modo indipendente da Ca2+contrariamente ad altri domini C2 noti o All'allegato A542. NBD-PHFAPP è derivato dal dominio PH della proteina umana 1 adattatrice di quattro fosfati (FAPP1), che è stata riprogettata per includere una singola cisteina esposta a solventi che può essere etichettata con un gruppo NBD vicino al sito di legame PI(4)P (Figura 1A)43. La sequenza nucleotidica del dominio PH della proteina FAPP umana (UniProt: Q9HB20, segmento [1-100]) è stata clonata in un vettore pGEX-4T3 da esprimere in tandem con un tag GST. La sequenza PHFAPP è stata modificata per inserire un unico residuo di cisteina all'interno dell'interfaccia di legame della membrana della proteina43. Inoltre, è stato introdotto un linker a nove residui tra il sito di scissione della trombina e l'N-terminus del dominio PH per garantire l'accessibilità alla proteasi.
Per misurare l'estrazione di PS dai liposomi, NBD-C2Lact viene miscelato con liposomi costituiti da fosfatidilcolina (PC) contenenti tracce di PS. A causa della sua affinità per PS, questo costrutto si lega ai liposomi e il fluoroforo NBD subisce un cambiamento di polarità quando entra in contatto con l'ambiente idrofobo della membrana, che provoca un blue-shift e un aumento della fluorescenza. Se ps viene estratto quasi completamente da una quantità stechiometrica di LTP, la sonda non si associa ai liposomi e il segnale NBD è inferiore (Figura 1B)32. Questa differenza di segnale viene utilizzata per determinare se un LTP(ad esempio, Osh6p) estrae PS. Una strategia simile viene utilizzata con NBD-PHFAPP per misurare l'estrazione di PI(4)P (Figura 1B), come descritto in precedenza12,32. Due saggi basati su FRET sono stati progettati per (i) misurare il trasporto di PS dai liposomi LA a LB, che imitano rispettivamente la membrana ER e il PM, e (ii) il trasporto PI(4)P nella direzione inversa. Questi test vengono eseguiti nelle stesse condizioni(cioè stesso tampone, temperatura e concentrazione lipidica) per misurare lo scambio PS/PI(4)P. Per misurare il trasporto di PS, NBD-C2Lact viene miscelato con liposomi LA composti da PC e drogati con il 5 mol% di PS e il 2 mol% di una fosfatidiletanolammina fluorescente marcata con rodamina (Rhod-PE) e liposomi LB che incorporano il 5 mol% di PI(4)P.
Al tempo zero, FRET con Rhod-PE spegne la fluorescenza NBD. Se la PS viene trasportata dai liposomi LA a LB (ad esempio, dopo l'iniezione di Osh6p), si verifica un rapido dequenching a causa della traslocazione di molecole NBD-C2Lact dai liposomi LA a LB (Figura 1C). Data la quantità di PS accessibile, NBD-C2Lact rimane essenzialmente in uno stato legato alla membrana nel corso dell'esperimento12. Pertanto, l'intensità del segnale NBD è direttamente correlata alla distribuzione di NBD-C2Lact tra i liposomi LA e LB e può essere facilmente normalizzata per determinare la quantità di PS trasferita. Per misurare il trasferimento di PI(4)P nella direzione opposta, NBD-PHFAPP viene miscelato con liposomi LA e LB; dato che si lega solo ai liposomi LB che contengono PI(4)P, ma non Rhod-PE, la sua fluorescenza è elevata. Se PI(4)P viene trasferito ai liposomi LA, si trasloca in questi liposomi e il segnale diminuisce a causa di FRET con Rhod-PE (Figura 1C). Il segnale viene normalizzato per determinare quanto PI(4)P viene trasferito43.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;L-cysteine &#8805;97 % (FG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305-100G</td>
			<td>Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W224681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm-diameter glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265934-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324, UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC800324, UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Gold Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0 Liss&#160; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C16:0-PI(4)P&#160;&#160;</td>
			<td>Echelon Lipids</td>
			<td>P-4016-3</td>
			<td>Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 &#181;L of MeOH and 250 &#181;L of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C-500mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Disruptor</td>
			<td>Constant Dynamics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>438601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized (Milli-Q) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF), anhydrous, &#62;99% pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td>Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.&#160; Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac chromatography columns (1.5 &#215; 12 cm).</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette 2 mm</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>EP102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Eppendorf 2510</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Spinning the batcerial lysates</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &#181;L) for fluorescence experiment</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 &#181;L) to handle lipid stock solutions</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (99% pure)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemolysis tubes with a cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES , &#62;99 % pure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra NAP 10 desalting column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE17-0854-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td>Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Acetate</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>26664.293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth medium without glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared with milli-Q water and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH) &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator-based fluorescence plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>M1000 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N&#39;-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 &#181;L in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 &#176;C in the dark.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p5318-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-C2LACT&#160; plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-PHFAPP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &#8805;98.5% (GC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626-25g</td>
			<td>Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoramidon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prefilters (10 mm in diameter).</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>http://pymol.org/</td>
			<td></td>
			<td>Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 &#181;L)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge&#160; Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &#215; 2 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO orange</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10602400001</td>
			<td>Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 &#181;L aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, ultra pure</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge L90K</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible absorbance spectrophotometer</td>
			<td>SAFAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device</td>
			<td>Jasco or Shimadzu</td>
			<td>Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes

Diversi membri della famiglia delle proteine leganti l'ossisterolo (OSBP) (ORP) / OSBP (Osh) conservate evolutivamente sono stati recentemente trovati per rappresentare un nuovo gruppo di proteine di trasferimento lipidico (LTP) nel lievito e nelle cellule umane. Trasferiscono la fosfatidilserina (PS) dal reticolo endoplasmatico (ER) alla membrana plasmatica (PM) tramite cicli di scambio PS/fosfatidilinositolo 4-fosfato (PI(4)P). Questa scoperta consente una migliore comprensione di come la PS, che è fondamentale per i processi di segnalazione, è distribuita in tutta la cellula e lo studio del legame tra questo processo e il metabolismo dei fosfoinositidi (PIP). Lo sviluppo di nuovi protocolli basati sulla fluorescenza è stato determinante nella scoperta e caratterizzazione di questo nuovo meccanismo cellulare in vitro a livello molecolare. Questo documento descrive la produzione e l'uso di due sensori lipidici marcati fluorescentemente, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP, per misurare la capacità di una proteina di estrarre PS o PI(4)P e di trasferire questi lipidi tra membrane artificiali. In primo luogo, il protocollo descrive come produrre, etichettare e ottenere campioni ad alta purezza di questi due costrutti. In secondo luogo, questo documento spiega come utilizzare questi sensori con un lettore di micropiasche a fluorescenza per determinare se una proteina può estrarre PS o PI(4)P dai liposomi, utilizzando Osh6p come caso di studio. Infine, questo protocollo mostra come misurare con precisione la cinetica dello scambio PS/PI(4)P tra liposomi di composizione lipidica definita e determinare le velocità di trasferimento lipidico mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET) utilizzando un fluorometro standard.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Figura 1: Descrizione dei sensori lipidici fluorescenti e saggi in vitro. (A) Modelli tridimensionali di NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP basati sulla struttura cristallina del dominio C2 della lattaderina bovina (PDB ID: 3BN648) e sulla struttura NMR del dominio PH della proteina FAPP1 umana (PD...

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Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Qui, descriviamo protocolli che utilizzano sensori lipidici fluorescenti e liposomi per determinare se una proteina estrae e trasporta fosfatidilserina o fosfatidilinositolo 4-fosfato in vitro.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Questo metodo utilizza la fluorescenza per determinare se una proteina si trasferisce a liqidi biologicamente importanti tra membrana sintetica e quindi contribuisce alla distribuzione di questi lipidi all'interno delle cellule eucariotiche. Questa tecnica permette l'estrazione e il trasporto di un lipide naturale da parte di una proteina, richiede e fluorescenza di cellule e liposomi che sono facili da realizzare. Questo metodo può essere utilizzato e modificato per ottenere informazioni sulla biologia cellulare dalle proteine dietro la distribuzione di alcuni lipidi essenziali tra organo e membrane.La dimostrazione visiva è fondamentale per spiegare come eseguire misurazioni in tempo reale del trasferimento lipidico per fluorescenza. Quindi a dimostrare la procedura sarà anche Maud Magdeleine, un ingegnere per il mio laboratorio. Inizia preparando un tampone di acetato di potassio HEPES fresco filtrato e degassato, integrato con un cloruro di magnesio millimolare per formare un tampone HKM.Quindi, preparare i liposomi fatti solo di PC o ulteriormente drogati con il due percento molare PS o PI (4) P. Ora, posiziona il pallone su un evaporatore rotante per asciugare il lipide sotto vuoto. In un pozzo, mescolare liposomi contenenti due percentuali molari di PS con sensore lipidico, NBD-C2 Lact, fino a una concentrazione finale di 250 nanomolari e un volume di 100 microlitri.Riempire un secondo pozzo con la stessa quantità di liposoma e latto NBD-C2 miscelato con tre proteine di trasferimento lipidico micromolari o LTP. Riempi un terzo pozzo con 250 latto NBD-C2 nanomolari mescolato con 80 liposomi PC micromolari puri e un quarto pozzo con liposomi PC micromolari puri 80. Ripetere questi passaggi per preparare tre serie aggiuntive di quattro pozzi.Quindi posizionare la piastra multi-pozzo nel lettore di fluorescenza. Per ogni pozzo registrare uno spettro NBD da 505 a 650 nanometri con una larghezza di banda di cinque nanometri all'eccitazione a 490 nanometri a 25 gradi Celsius. Per ogni serie sottrarre lo spettro registrato con i soli liposomi dagli altri spettri.Per il test di estrazione PI(4)P preparare liposomi drogati con fosfatidilinositolo-4-fosfato a due percentuali molari ed effettuare misurazioni con la sonda NBD-PH FAPP. Eseguire esperimenti di controllo e determinare la percentuale di estrazione. Dopo aver finito di estrudere i liposomi riempire un tubo Con questi liposomi estrusi.Preparare il tampone HKM appena degassato e filtrato e mantenere i tubi contenenti liposomi estrusi a temperatura ambiente. Avvolgere i tubi contenenti liposomi con rodamina etichettata fosfatidiletanolammina in un foglio di alluminio e conservarli in una scatola opaca per evitare qualsiasi sbiancamento fotografico. Impostare la temperatura tra 25 e 37 gradi Celsius e regolare i monocromatici di eccitazione a 460 nanometri con una breve larghezza di banda da uno a tre nanometri e l'emissione a 530 nanometri con una grande larghezza di banda superiore a 10 nanometri.Imposta il tempo di acquisizione su venticinque minuti con la risoluzione del tempo di al massimo un secondo. Nella cuvetta di quarzo diluire 30 microlitri della sospensione liposomica LA e nbd-C2 lact stock solution e tampone HKM prebellico per preparare un campione di 570 microlitri che contiene 200 lipidi totali micromolari e 250 nanomolari o NBD-C2 lact. Aggiungere una piccola barra di agitazione magnetica e posizionare la cuvetta nel porta fluorometro.Una volta che il campione è bilanciato termicamente, attivare la misurazione. Dopo un minuto, aggiungere 30 microlitri della sospensione di liposomi LB al campione. Dopo tre minuti iniettare LTP nel campione in modo che la concentrazione finale dell'LTP sia di 200 nanomolari, quindi acquisire il segnale per i restanti 21 minuti.Effettuare un esperimento parallelo per normalizzare il segnale NBD. Mescolare 30 microlitri di sospensione liposomico di equilibrio LA con 250 nanomolari NBD-C2 lact in tampone HKM ad un volume finale di 570 microlitri. Dopo un minuto, iniettare 30 microlitri di sospensione di liposomi di equilibrio LB.Convertire le curve cinetiche misurate con un LTP di interesse per determinare la quantità di PS trasferita dai liposomi LA a LB nel tempo. Quindi normalizzare ogni punto dati della curva. Eseguire l'esperimento PI(4)P utilizzando le stesse impostazioni e condizioni dell'emettitore a pavimento del test di trasferimento PS.Nella cuvetta, mescolare 30 microlitri di sospensione di liposomi lb e sonda NBD-PH FAPP con tampone HKM preriscaldato per ottenere un volume finale di 570 microlitri. Una volta raggiunto l'equilibrio termico del campione, avviare la misurazione. Dopo un minuto, iniettare 30 microlitri di sospensione di liposomi LA.Dopo tre minuti, iniettare l'LTP di interesse e registrare il segnale. Eseguire un secondo esperimento per normalizzare il segnale NBD. Mescolare 30 microlitri di sospensione liposomico di equilibrio lb con 250 nanomolari NBD-PH FAPP e 570 microlitri di tampone HKM.Dopo un minuto, iniettare 30 microlitri di sospensione di liposomi di equilibrio LA. Convertire le curve cinetiche per determinare la quantità di PI(4)P trasferita dai liposomi LB a LA nel tempo, quindi normalizzare ogni punto dati. Quantificare la misura in cui un LTP è efficiente.Eseguire una regressione lineare dei primi punti dati della cinetica di trasferimento per ottenere una pendenza. Dividere il valore di pendenza per la concentrazione di LTP nella miscela di reazione per determinare il numero di molecole lipidiche trasferite per proteina per unità di tempo. Il recupero efficiente del latto C2 dalle pere è stato verificato con l'analisi della pagina SDS.Lo spettro assorbente visibile ultravioletto del latto C2 etichettato con NBD ha confermato che tutte le molecole di latto C2 sono state etichettate con un gruppo NBD. La purezza del latto NBD-C2 e la sua fluorescenza sono state determinate dall'analisi della pagina SDS. La fluorescenza del latto NBD-C2 o NBD-PH FAPP era massima quando solo i liposomi contenenti PS o PI(4)P venivano utilizzati per l'incubazione, indicando che il sensore era legato alla membrana.Una bassa fluorescenza è stata osservata quando Osh6p era presente anche indicando che questa proteina estraeva in modo efficiente PS o PI(4)P dai liposomi. Vengono mostrati i risultati di un test di trasferimento PS che utilizza Osh6p come LTP. Sono state calcolate le curve cinetiche medie del trasferimento di PS dai liposomi LA ai liposomi LB, drogati o non drogati con fosfatidilinositolo-4-fosfato.La velocità media iniziale di trasporto ps è stata determinata da tre esperimenti distinti. Allo stesso modo, i risultati di un test di trasferimento PI(4)P che utilizza Osh6p come LTP sono mostrati qui. Insieme alle curve cinetiche medie ottenute dopo la normalizzazione del segnale.Le velocità di trasferimento medio sono state misurate con liposomi LA che sono stati drogati o non drogati con PS. Quando si esegue questo protocollo, utilizzare un buffer fresco e preparare gli stessi giorni. Ridurre al minimo l'esposizione leggera di liposomi e proteine fluorescenti, utilizzare proteine etichettate NBD ben purificate e tenerle sul ghiaccio. può essere confermato misurando il trasferimento di PS e PI(4)P tra organelli all'interno della cellula procariotica utilizzando sensori lipidici fluorescenti geneticamente codificati.Questa tecnica apre la strada a una migliore comprensione di PS e PI(4) sono distribuiti all'interno della cellula e la loro attività subisce la specificità di diversi LTPS.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Ricerca

Biochimica

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In linea Size-esclusione e cromatografia a scambio ionico su una SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

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