Name: fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00
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原稿を慎重に校正してくれたA.カットトリス博士に感謝しています。この研究は、フランス国家研究庁の助成金ExCHANGE(ANR-16-CE13-0006)とCNRSによって資金提供されています。

1. NBD-C2ラクトの精製
注:このプロトコルは、細菌を破壊する細胞破壊器の使用を詳述していますが、他のライシス戦略(例えばフランス のプレス)を使用するように変更することができます。精製の開始時に、システインの酸化を防ぐために、新たに脱気し、濾過し、2 mMジチオトライトール(DTT)を補充したバッファーを使用することが必須です。しかし、タン?...

これらのアッセイの結果は、蛍光脂質センサーのシグナルに直接依存します。したがって、これらのプローブの精製は、NBDと1:1の比率で、かつ無料のNBDフルオロフォア汚染なしに標識され、このプロトコルの重要なステップです。また、検査中のLTPが適切に折り畳まれ、集計されていないかどうかを確認することも必須です。抽出アッセイで試験したLTPの量は、このLTPがこれらの脂質を効率?...

異なる膜間および真核細胞1,2の膜内での脂質の正確な分布は、深い生物学的意味を有する。LTPsの機能の解読は、細胞生物学3、4、5、6、およびinvitroアプローチにおいて重要な問題であり、この問題7、8、9、10、11に対処する上で大きな価値がある。ここでは、細胞膜12間の複数のORP/Oshタンパク質がPS/PI(4)Pに影響を及ぼし、それによって新しいクラスのLTPsを構成することを確立するのに役立ったinvitro、蛍光ベースの戦略が提示される。 ERとPMの間の勾配に沿って分布し、グリセロリン脂質の5〜7%および最大30%をそれぞれ17、18、19に示す。また、PSは、PMの細胞体リーフレットに本質的に濃縮される。この蓄積とPMのPSの不均一なパーティションは、細胞信号プロセス19にとって重要です。PS分子の負電荷のために、PMの細胞体リーフレットは、他のオルガネラ1、2、19、20の細胞体リーフレットよりもはるかにアニオン性である。これにより、静電力を介して、ピリストアレートアラニンを豊富に含むCキナーゼ基質(MARCKS)21、肉腫(Src)22、キルステンラット肉腫ウイルス性腫瘍遺伝子(K-Ras)23、およびRas関連C3ボツリヌス毒素基質1(Rac1)24などのシグナル伝達タンパク質の採用を可能にする。 
PSはまた、C2ドメイン25を介して立体選択的な方法で従来のプロテインキナーゼCによって認識される。ただし、PS は ER26で合成され、その役割を果たす前に PM にエクスポートする必要があることを示します。酵母では、Osh6pおよびOsh7pがERからPM27にPSを移すことを知るまで、これがどのように達成されたかは知られていませんでした。これらのLTPは、創設メンバーがOSBPであり、OSBP関連ドメイン(ORD)をポケットに組み込んで脂質分子をホストするタンパク質(ヒトのORP、酵母のオッシュタンパク質)を含む真核生物中の進化的に保存された家族に属しています。Osh6pとOsh7pは、構造特徴がPSを特異的に結合し、膜間で伝達するように適合したORDのみで構成されています。それにもかかわらず、これらのタンパク質がERからPMにPSをどのように方向的に移したかは不明であった。Osh6pとOsh7pは、PI(4)Pを代替脂質リガンド12としてトラップすることができます。酵母では、PI(4)Pはゴルジのホスファチジルイノシトール(PI)とPMからPI-4キナーゼ、Pik1pおよびStt4pによってそれぞれ合成される。対照的に、この脂質はSac1pホスファターゼによってPIに加水分解されるので、ER膜にはPI(4)Pはありません。したがって、PI(4)P 勾配は ER/ゴルギインターフェイスと ER/PM インターフェイスの両方に存在します。Osh6p および Osh7p は、これら 2 つの膜12の間に存在する PI(4)P 勾配を使用して、ER から PM に PS を転送します。
1サイクル内で、Osh6pはERからPSを抽出し、PMでPI(4)PにPSを交換し、PI(4)PをERに戻して別のPS分子を抽出します。Osh6p/Osh7pは、ER膜とPMを互いに近接して接続して近接させる数少ないタンパク質の1つであるIst2p28と相互作用し、酵母29、30、31にER-PMコンタクトサイトを作成する。また、負に帯電した膜とのOsh6pの関連は、その静電機能を変化させる立体構造変化によるタンパク質がその脂質リガンドの1つを抽出するとすぐに弱くなる32。これは、その膜のドウェル時間を短縮することによってOsh6pを助け、それによってその脂質移動活性の効率を維持する。Ist2pへの結合と組み合わせることで、このメカニズムにより、Osh6p/7pがER/PM界面で脂質交換を迅速かつ正確に実行することが可能になります。ヒト細胞では、ORP5およびORP8タンパク質は、ER-PM接触部位でPS/PI(4)P交換を個別のメカニズム33を介して実行する。それらは、Osh6pに似た中央ORDを有するが、C末端膜貫通セグメント33を介してERに直接固定され、PI(4)PおよびPI(4,5)P233、34、35を認識するN末端プレックストリン相同性(PH)ドメインを介してPMにドッキングする。ORP5/8はPI(4)Pを使用してPSを転送し、ORP5/8はさらにPM PI(4,5)P2レベルを調節し、シグナル伝達経路を調節することが示されています。PI(4)P および PI(4,5)P2レベルの低下は、これらのタンパク質が PIP 依存的な方法で PM に関連付けるため、ORP5/ORP8 活性を低下させます。レンツ・マジェフスキ症候群に至る異常に高いPS合成は、ORP5/836を通してPI(4)Pレベルに影響を与える。両方のタンパク質の活性が遮断されると、PSはPMであまり豊富になくなり、シグナル伝達タンパク質37の発癌能力を低下させる。
逆に、ORP5過剰発現は、癌細胞の浸潤と転移過程38を促進する。したがって、ORP5/8活性の変化は、脂質恒常性の変化を通じて細胞行動を著しく変化させることができる。また、ORP5およびORP8は、ER-ミトコンドリア接触部位を占有し、ミトコンドリア機能を保存し、PS39を供給する可能性がある。さらに、ORP5は、ER-脂質液滴接触部位に局地化し、PS/PI(4)P交換40によってPSを脂質滴に送達する。本明細書に記載されている戦略は、リポソームからの(i)PSおよびPI(4)P抽出物および(ii)リポソーム間のPSおよびPI(4)P輸送を測定し、Osh6p/Osh7p12、32のPS/PI(4)P交換活性を確立および分析するために考案され、他のグループがORP5/ORP835および他のLTPの活性を分析するために使用した 41.これは、それぞれPSとPI(4)Pを検出できる蛍光プレートリーダー、標準Lフォーマット分光蛍光計、および2つの蛍光センサ、NBD-C2ラクトとNBD-PHFAPPの使用に基づいています。
NBD-C2ラクトは、推定されるPS結合部位の近くにユニークな溶媒暴露システインを含むように再設計された糖タンパク質、ラクタドヘリンのC2ドメインに対応します。極性感受性のNBD(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾール)フルオロフォアは、この残基に共有結合している(図1A)12。より正確に言うと、ラクタドヘリンのC2ドメイン(ボストーラス、ユニプロート:Q95114、残留物270-427)を、大腸菌中のグルタチオンS-トランスバラーゼ(GST)と融合して発現させるpGEX-4T3ベクターにクローン化した。C2ラクト配列を突然変異させ、2つの溶媒にアクセス可能なシステイン残基(C270、 C427) アラニン残基を有し、その後N,N'-ジメチル-N-(イオダセチル)-N'-n-(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾル-4-yl)エチレンジアミン(IANB)で標識することができる推定PS結合部位(H352C突然変異)近くの領域にシステイン残基を導入する血栓の切断部位は、C2ドメインのGSTタンパク質とN末語との間に存在する。主な利点は、このドメインが他の既知のC2ドメインまたはアネキシンA542に反してCa2+独立的な方法でPSを選択的に認識することです。NBD-PHFAPPは、ヒト4リン酸アダプタータンパク質1(FAPP1)のPHドメインに由来し、PI(4)P結合部位(図1A)の近傍にNBD基で標識することができる単一の溶媒暴露システインを含むように再設計された。ヒトFAPPタンパク質のPHドメインの塩基配列(UniProt:Q9HB20、セグメント[1-100])は、GSTタグと連換えて発現されるpGEX-4T3ベクターにクローン化されている。このPHFAPP配列は、タンパク質43の膜結合界面内に特有のシステイン残基を挿入するように改変されている。さらに、プロテアーゼへのアクセス性を確保するために、9残基リンカーが、PHドメインのトロンビン切断部位とN末語との間に導入された。
リポソームからのPS抽出を測定するには、 NBD-C2Lactは、微量のPSを含むホスファチジルコリン(PC)で作られたリポソームと混合され、PSに対する親和性のために、この構造はリポソームに結合し、NBDフルオロフォアは膜の疎水性環境に接触するにつれて極性の変化を経験する。PSが量論的量のLTPによってほぼ完全に抽出された場合、プローブはリポソームと関連せず、NBD信号は低い(図1B)32。この信号の違いは、LTP(例えば、Osh6p)がPSを抽出するかどうかを決定するために使用されます。同様の戦略は、前述の12, 32のように、NBD-PHFAPPと共に PI(4)P 抽出 (図 1B) を測定するために使用されます。2つのFRETベースのアッセイは、(i)それぞれER膜とPMを模倣するLAからLBリポソームへのPS輸送を測定し、(ii)逆方向にPI(4)P輸送を測定するように設計された。これらのアッセイは、PS/PI(4)P交換を測定するために同じ条件(すなわち、同じバッファー、温度、および脂質濃度)で行われます。PS輸送を測定するために、NBD-C2ラクトは、PCで構成されるLAリポソームと混合し、5モル%のPSおよび2モル%の蛍光ローダミン標識ホスファチジルエタノールアミン(Rhod-PE)およびLBリポソームを5モルPI%PI(4)Pを組み込んだ。
時間ゼロで、ロードPEを有するFRETは、NBD蛍光をクエンチする。PSがLAからLBリポソームに輸送される場合(例えば、Osh6pを注入すると)、LAからLBリポソームへのNBD-C2Lact分子の転位に伴い、速い脱健全性が生じる(図1C)。アクセス可能なPSの量を考えると、NBD-C2のラクトは、実験12の過程で本質的に膜結合状態のままである。したがって、NBDシグナルの強度は、LAとLBリポソーム間のNBD-C2ラクトの分布と直接相関し、PSが転送される量を決定するために容易に正規化することができる。PI(4)Pの逆方向の移動を測定するために、NBD-PHFAPPはLAおよびLBリポソームと混合される。PI(4)P を含むが、ロード-PEを含まない LBリポソームにのみ結合することを考えると、その蛍光は高い。PI(4)PがLAリポソームに移された場合、これらのリポソームに転写され、Rhod-PEを用いたFRETにより信号が減少する(図1C)。信号は正規化されて、PI(4)P が転送される量が43 になります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;L-cysteine &#8805;97 % (FG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305-100G</td>
			<td>Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W224681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm-diameter glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265934-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324, UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC800324, UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Gold Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0 Liss&#160; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C16:0-PI(4)P&#160;&#160;</td>
			<td>Echelon Lipids</td>
			<td>P-4016-3</td>
			<td>Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 &#181;L of MeOH and 250 &#181;L of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C-500mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Disruptor</td>
			<td>Constant Dynamics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>438601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized (Milli-Q) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF), anhydrous, &#62;99% pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td>Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.&#160; Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac chromatography columns (1.5 &#215; 12 cm).</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette 2 mm</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>EP102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Eppendorf 2510</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Spinning the batcerial lysates</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &#181;L) for fluorescence experiment</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 &#181;L) to handle lipid stock solutions</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (99% pure)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemolysis tubes with a cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES , &#62;99 % pure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra NAP 10 desalting column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE17-0854-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td>Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Acetate</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>26664.293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth medium without glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared with milli-Q water and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH) &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator-based fluorescence plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>M1000 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N&#39;-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 &#181;L in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 &#176;C in the dark.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p5318-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-C2LACT&#160; plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-PHFAPP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &#8805;98.5% (GC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626-25g</td>
			<td>Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoramidon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prefilters (10 mm in diameter).</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>http://pymol.org/</td>
			<td></td>
			<td>Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 &#181;L)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge&#160; Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &#215; 2 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO orange</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10602400001</td>
			<td>Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 &#181;L aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, ultra pure</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge L90K</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible absorbance spectrophotometer</td>
			<td>SAFAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device</td>
			<td>Jasco or Shimadzu</td>
			<td>Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes

進化的に保存されたオキシステロール結合タンパク質(OSBP)関連タンパク質(ORP)/OSBPホモログ(Osh)ファミリーのいくつかのメンバーは、最近、酵母およびヒト細胞における新しい脂質移動タンパク質(LTP)群を表していることが判明した。ホスファチジルセリン(PS)をPS/ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI)交換サイクル を介して 、小胞子(ER)から形質膜(PM)に移します。この知見により、シグナル伝達プロセスに重要なPSがどのように細胞全体に分布しているか、およびこのプロセスとホスホイノシチド(PIP)代謝との間のリンクの調査がより深く理解できる。新しい蛍光ベースのプロトコルの開発は、この新しい細胞機構の発見と特徴付け に 役立っています。本論文では、タンパク質がPSまたはPI(4)Pを抽出し、人工膜間で脂質を移動させる能力を測定するための、蛍光標識された2つの脂質センサNBD-C2ラクト およびNBD-PHFAPPの製造と使用について説明する。まず、プロトコルは、これら2つの構成体の高純度サンプルを製造、ラベル付け、取得する方法を記述する。第2に、これらのセンサーを蛍光マイクロプレートリーダーと併用して、タンパク質がPsまたはPI(4)Pをリポソームから抽出できるかどうかを判断する方法を、Osh6pをケーススタディとして使用する方法を説明する。最後に、このプロトコルは、定義された脂質組成のリポソーム間のPS/PI(4)P交換の運動量を正確に測定し、標準蛍光計を用いた蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)による脂質移動率を測定する方法を示す。

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> 図1: 蛍光脂質センサとインビトロアッセイの説明(A) ウシラクタジンのC2ドメインの結晶構造に基づくNBD-C2ラクトおよびNBD-PHFAPPの3次元モデル(PDB ID: 3BN648)およびヒトFAPP1タンパク質のPHドメインのNMR構造(PDB ID:2KJ46)<sup cl...

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Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

ここでは、蛍光脂質センサーおよびリポソームを用いて、タンパク質抽出物を用いてホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトール4-リン酸 をインビトロで輸送するかを決定するプロトコルについて説明する。

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

この方法は、蛍光を使用して、合成膜間の生物学的に重要なリクリクドへのタンパク質転移が真核細胞内のこれらの脂質の分布に寄与するかどうかを判断する。この技術は、タンパク質による天然脂質の抽出および輸送を可能にし、作りやすくなる蛍光細胞やリポソームを必要とする。この方法を使用して、臓器と膜の間のいくつかの必須脂質の分布の背後にあるタンパク質によって細胞生物学への洞察を得るために変更することができます。蛍光による脂質転写のリアルタイム測定を行う方法を説明するには、視覚的な実証が重要です。だから、手順を実証することは、私の研究室のエンジニアであるモード・マグデレーヌでもあります。新鮮なろ過体および脱ガス化されたHEPES酢酸カリウムバッファーを調製し、1ミリモル塩化マグネシウムを添加してHKMバッファーを形成します。次に、PCのみで作られたリポソームを調製するか、または2つのモルパーセントPSまたはPI(4)Pで加減する。さて、フラスコをロータリーエバポレーターに置き、脂質を真空下で乾燥させます。1つの井戸では、2つのモルパーセントPSを含むリポソームを脂質センサーNBD-C2ラクトと混合し、最終的な濃度250ナノモルと100マイクロリットルの体積を混合します。2番目のリポソームとNBD-C2の乳液を3つのミクロモル脂質転写タンパク質またはLTPと混合して十分に充填する。純粋な80マイクロモルPCリポソームと純粋な80マイクロモルPCリポソームと第4の井戸と混合250ナノモルNBD-C2の授乳で第三井戸を埋めます。これらの手順を繰り返して、3 つの追加の 4 つのウェルを準備します。その後、蛍光リーダーにマルチウェルプレートを置きます。各井戸のために摂氏25度で490ナノメートルで励起時に5ナノメートルの帯域幅で505から650ナノメートルまでのNBDスペクトルを記録する。各系列では、他のスペクトルからリポソームのみで記録されたスペクトルを差し引きます。PI(4)P抽出アッセイは、2つのモル%ホスファチジルイノシトール-4-リン酸でドープされたリポソームを調製し、NBD-PH FAPPプローブで測定を行います。制御実験を行い、抽出率を決定します。押し出しリポソームを終了した後、これらの押し出されたリポソームでチューブを充填します。脱ガスし、ろ過されたHKMバッファーを準備し、室温で押し出されたリポソームを含むチューブを保ちます。ローダミンとラベル付けされたフォダミンを含むリポソームを含むチューブをアルミニウム箔で包み、不透明な箱に入れて写真の漂白を防ぎます。25~37°Cの温度を設定し、1~3ナノメートルの短い帯域幅で励起モノクロメーターを460ナノメートルに調整し、10ナノメートル以上の大帯域幅を持つ530ナノメートルに発光します。取得時間を 25 分に設定し、時間分解能を 1 秒に設定します。クオーツキュベットでは、LAリポソーム懸濁液とNBD-C2ラクトストック溶液とプリウォームHKMバッファーの30マイクロリットルを希釈し、200マイクロモル総脂質および250ナノモルまたはNBD-C2ラクトを含む570マイクロリットルサンプルを調製した。小さな磁気攪拌バーを追加し、フルオロメーターホルダーにキュベットを配置します。サンプルが熱的に平衡化されると、測定をトリガします。1分後、LBリポソーム懸濁液を30マイクロリットルのサンプルに加えます。3分後にLTPの最終濃度が200ナノモルになるようにサンプルにLTPを注入し、次いで残りの21分間信号を取得する。並列実験を行い、NBD信号を正規化します。30マイクロリットルのLA平衡リポソーム懸濁液をHKMバッファに250ナノモルNBD-C2ラクトと570マイクロリットルの最終体積で混合します。1分後、LB平衡リポソーム懸濁液を30マイクロリットル注入する。関心のある LTP で測定した運動曲線を変換して、時間の経過とともに LA から LB リポソームに転送される PS の量を決定します。次に、曲線の各データポイントを正規化します。PS転送アッセイと同じフロアエミッタ設定と条件を使用して、PI(4)P実験を行います。キュベットでは、lbリポソーム懸濁液の30マイクロリットルとNBD-PH FAPPプローブを、あらかじめ温めたHKMバッファと混合し、570マイクロリットルの最終容積を得る。サンプルの熱平衡に達したら、測定を開始します。1分後、LAリポソーム懸濁液を30マイクロリットル注入する。3分後、目的のLTPを注入し、信号を記録します。NBD信号を正規化するために2回目の実験を行います。250ナノモルNBD-PH FAPPとHKMバッファーの570マイクロリットルとlb平衡リポソーム懸濁液の30マイクロリットルを混合します。1分後、30マイクロリットルのLA平衡リポソーム懸濁液を注入する。運動曲線を変換して、時間の経過とともにLBからLAリポソームに転送されるPI(4)Pの量を決定し、各データポイントを正規化します。LTP がどの程度効率的かを定量化する。移動動力学の第1のデータ点の線形回帰を行い、傾きを得る。反応混合物中のLTP濃度でスロープ値を割り、時間単位当たりのタンパク質当たりの脂質分子の数を決定する。ビーズからのC2ラクタルの効率的な回収は、SDSページ分析で検証された。NBDで標識されたC2ラクタルの紫外線可視吸収性スペクトルは、全てのC2ラクト分子がNBD基で標識されていることを確認した。NBD-C2の乳液の純度およびその蛍光は、SDSページ分析によって決定された。NBD-C2ラクタルまたはNBD-PH FAPPの蛍光は、PSまたはPI(4)Pを含むリポソームのみをインキュベーションに使用した場合に最大であり、センサーが膜結合していたことを示す。このタンパク質がリポソームからPSまたはPI(4)Pを効率的に抽出したことを示すOsh6pが存在する場合、低蛍光が見られました。OSH6pをLTPとして用いたPS転写アッセイの結果を示す。PSの平均運動曲線を、LAリポソームからLBリポソームへの移行、ドープ、またはホスファチジルイノシトール-4-リン酸でドープしていないものを算出した。平均初期PS輸送速度は、3つの異なる実験から決定した。同様に、OSH6pをLTPとして用いたPI(4)P転写アッセイの結果を以下に示す。シグナルの正規化後に得られる平均運動曲線と共に。平均転写率は、PSでドープされたか、またはドープされなかったLAリポソームで測定された。このプロトコルを実行する場合は、新しいバッファを使用し、同じ日を準備します。豊富なリポソームやタンパク質の光の広がりを最小限に抑え、よく精製されたNBD標識タンパク質を使用し、氷の上に保管してください。遺伝子組み換え蛍光脂質センサを用いて、原核細胞内の細胞内でPSとPI(4)Pの移動を測定することで確認できます。この技術は、PSとPI(4)がセル内に分布し、それらの活性が複数のLTPSの特異性を受けるというより良い理解への道を開く。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Rad51 を介した DNA 鎖交換反応のリアルタイム観察

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...