Name: immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method at JoVE.com

ونود أن نشكر بينغ يي، وناثان سبيكس، وهاو ليو على الدعم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للمنح الصحية EY022640 (D.-Q.Z.) وجائزة أبحاث الطلاب الجامعيين في جامعة أوكلاند (E.J.A.).

وقد أجريت رعاية الفئران وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة للحيوانات المختبرية ووافقت عليها اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة أوكلاند (البروتوكول رقم 18071).
ملاحظة: يتم سرد أسماء الحلول والتركيبات الخاصة بهم في ا...

<ol>
	<li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+retinal+function.">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li><li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+organization+of+the+mammalian+retina:+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases.">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li><li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina.">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li><li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina.">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).</li><li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li><li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells.">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332 (2013).</li><li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging.">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+CLARITY:+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue.">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain.">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li><li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+retinal+dopaminergic+neurons:+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments.">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li></ol>

تعديل بروتوكول CLARITY لشبكية العين كاملة التركيب. لقد قمنا بتبسيط بروتوكول CLARITY لتحقيق البلمرة الكافية دون الحاجة إلى إخلاء فراغ أو غرفة الجفاف ، كما هو مستخدم في معظم الدراسات السابقة7و9و11. يتم تثبيط عملية البلمرة عن طريق الأكسج?...

قد تكون الشبكية الفقارية هي الجزء الأكثر سهولة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وهي بمثابة نموذج ممتاز لدراسة تطور الدماغ وبنيته ووظيفته. يتم توزيع خمس فئات من الخلايا العصبية في شبكية العين في ثلاث طبقات نووية مفصولة طبقتين شكلية. تتكون الطبقة النووية الخارجية (ONL) من مستقبلات ضوئية كلاسيكية (قضبان ومخاريط) تحول الضوء إلى إشارات كهربائية. تتم معالجة الإشارات الكهربائية بواسطة الخلايا العصبية في الطبقة النووية الداخلية (INL)، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب والأفقية والأماكرين، ثم تنتقل إلى خلايا العقدة الشبكية (RGCs) في طبقة خلايا العقدة (GCL). RGCs هي الخلايا العصبية الناتجة من شبكية العين، مع محاور عصبية إسقاط إلى الدماغ للمساهمة في تشكيل الصورة وغير تشكيل الصورة وظيفة بصرية. بالإضافة إلى ذلك، توفر ثلاثة أنواع من الخلايا الدبقية (خلايا مولر، والأستروغليا، والميكروجليا) العناصر الغذائية للخلايا العصبية وتحمي الخلايا العصبية من التغيرات الضارة في بيئتها خارج الخلية.
واحد السكان الفرعية المتخصصة من خلايا الاماكرين تنتج وتطلق الدوبامين, neuromodulator هامة في الجهاز العصبي المركزي, إعادة تكوين الدوائر العصبية الشبكية خلال التكيف مع الضوء1,2. خلايا الدوبامين amacrine (DACs) لديها ميزة فريدة من ملامح مورفولوجية. وتقع سوماتا بهم في INL القريبة مع dendrites ramifying في الجزء الأكثر قاصرة من طبقة plexiform الداخلية (IPL). عمليات تشبه أكسون من DACs هي unmyelinated، رقيقة وطويلة، متفرعة بشكل متفرق، وتحمل الدوالي (مواقع إطلاق الدوبامين). أنها تشكل الضفيرة الكثيفة مع dendrites في IPL، بما في ذلك هياكل تشبه حلقة حول سوماتا من خلايا AII amacrine. المحاور أيضا تشغيل من خلال INL نحو OPL, تشكيل مسار الطرد المركزي عبر شبكية العين3. لقد أثبتنا أن عمليات DAC تعبر عن المستقبلات استجابة لإطلاق الغلوتامات من الخلايا العصبية presynaptic، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب وخلايا العقدة الشبكية الحساسة للضوء في جوهرها (ipRGCs)4،5،6. ومع ذلك، فمن غير الواضح ما إذا كانت مستقبلات الغلوتامات تعبر عن محاور الفأس، التشعبات، أو كليهما لأنها مقطوعة في أقسام الشبكية الرأسية ولا يمكن تمييزها عن بعضها البعض5،6. يجب إجراء التلطخ المناعي في شبكية العين الكاملة للكشف عن تفريع ثلاثي الأبعاد ل DACs ووجود مستقبلات الغلوتامات على المقصورات دون الخلوية. على الرغم من أن شبكية العين شفافة نسبيا، إلا أن سمك شبكية العين ذات التركيب الكامل للفأر يبلغ حوالي 200 ميكرومتر، مما يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة، فضلا عن تقليل اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة بسبب تشتت الأنسجة الخفيفة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتكييف طريقة التهذييل الهيدروجيل الأنسجة المتوافقة (CLARITY) التي تم تطويرها مؤخرا لأقسام الدماغ السميكة إلى شبكية العين الماوس جبل كامل7.
تم تطوير طريقة CLARITY في الأصل من قبل مختبر Deisseroth لاحتواء المناعة وتصوير عينات الدماغ السميكة7. ويستخدم المنظفات القوية، كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) والكهربائية لإزالة مكونات الدهون (التي تسبب تشتت الضوء الأنسجة)، وترك البروتينات والأحماض النووية في مكانها. يتم استبدال الدهون إزالتها مع سقالة شفافة تتكون من مونومرات هيدروجيل مثل الأكريلاميد لدعم بنية البروتين المتبقية. يمكن تسمية الأنسجة المطهية عن طريق الكيمياء المناعية وصورت مع زيادة كبيرة في عمق اختراق الضوء من خلال الأنسجة (تصل إلى عدة ملليمترات تحت سطح الأنسجة). ومنذ ذلك الحين، تم تحسين طريقة CLARITY وتبسيطها من قبل العديد من مجموعات البحث8و9و10. يستخدم بروتوكول CLARITY المعدل تقنية إزالة سلبية لتجنب تلف الأنسجة المحتمل الناتج عن الكهتروفورسيس لتطهير الدماغ كله والأعضاء الأخرى السليمة11. ومع ذلك، لم يتم تطبيق هذه الطريقة بعد على شبكية العين كاملة التركيب. هنا، قمنا بتكييف تقنية CLARITY السلبية لشبكية العين الكاملة لجعلها أكثر شفافية للكيمياء المناعية والتصوير. وجدنا أن غالبية بروتينات الشبكية التي تم اختبارها تم الحفاظ عليها خلال هذه العملية للكيمياء المناعية. باستخدام معامل الانكسار مطابقة الحل، كنا قادرين على صورة الخلايا العصبية الشبكية عبر سمك ما يقرب من 200 ميكرومتر من ONL إلى GCL في شبكية العين جبل كامل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP170</td>
			<td>Hydrogel monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorscence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0258</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Bacteriostatic preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.122</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610301</td>
			<td>Delipidation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51876</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>011-19365</td>
			<td>Thermal initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method

تم تعديل طريقة التهذير الهيدروجيل الأنسجة (CLARITY)، التي وضعت أصلا من قبل مختبر Deisseroth، وتستخدم على نطاق واسع لاحتواء المناعة والتصوير لعينات الدماغ سميكة. ومع ذلك، لم يتم استخدام هذه التكنولوجيا المتقدمة بعد لشبكية العين كاملة التركيب. على الرغم من أن شبكية العين شفافة جزئيا، إلا أن سمكها البالغ حوالي 200 ميكرومتر (في الفئران) لا يزال يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة وكذلك الحد من اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة. هنا، قمنا بتكييف طريقة CLARITY لشبكية العين الماوس جبل كامل عن طريق البلمرة لهم مع مونومر الأكريلاميد لتشكيل هيدروجيل نانوبري ومن ثم تطهيرها في كبريتات دودسيل الصوديوم للحد من فقدان البروتين وتجنب تلف الأنسجة. كانت شبكية العين المجهزة بالوضوح ملطخة بالمناعة بأجسام مضادة للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية والبروتينات المتشابكة ، مثبتة في محلول مطابق لمؤشر الانكسار ، وصورت. تظهر بياناتنا أن CLARITY يمكن أن يحسن جودة تلطيخ المناعة الكيميائية القياسية والتصوير للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية في إعداد التركيب الكامل. على سبيل المثال ، تم تحسين الدقة ثلاثية الأبعاد للهياكل الدقيقة الشبيهة بالفأس والتشجرات لخلايا amacrine الدوبامين بشكل كبير من خلال CLARITY. بالمقارنة مع شبكية العين غير المصنعة كاملة التركيب ، يمكن أن يكشف CLARITY عن وجود مناعة للبروتينات المتشابكة مثل بروتين الكثافة بعد المتشابك 95. تظهر نتائجنا أن CLARITY يجعل شبكية العين أكثر شفافية بصريا بعد إزالة الدهون ويحافظ على الهياكل الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية وبروتيناتها ، والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني للحصول على تصوير عالي الدقة للخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية في إعداد التركيب الكامل.

شبكية العين المعدلة المعالجة CLARITY هي أنسجة شفافة بصريا. لصياغة طريقة تطهير الأنسجة التي تتوافق مع التطبيقات المناعية الكيميائية في شبكية العين مع توفير الهذيان الكافي والاحتفاظ السلامة الهيكلية للبروتينات الخلوية، قمنا بتكييف طريقة إزالة الأنسجة وضوح لشبكية العين الماوس جبل...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method at JoVE.com

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

هنا نقدم بروتوكولا لتكييف طريقة وضوح أنسجة الدماغ لشبكية العين كاملة جبل لتحسين نوعية تلطيخ المناعية القياسية والتصوير عالي الدقة من الخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية.

الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

يسمح هذا البروتوكول بالتحقيق في مورفولوجيا الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية ويمكن أن يعطي فكرة عن التغيرات المورفولوجية الخلوية ودون الخلوية التي تحدث في حالات المرض. هذه الطريقة تحسن بشكل كبير الشفافية البصرية للشبكية ويسمح عالية الدقة, التصوير ثلاثي الأبعاد, الأسلاك الدائرة, وهياكل الخلوية الفرعية غرامة من الخلايا العصبية الشبكية في إعداد هرمون شبكية العين. احث عيون الماوس مع ملقط منحني ونقلها إلى طبق بيتري صغير مع برنامج تلفزيوني 0.1 M.كزة حفرة صغيرة على طول تقاطع القرنية تصلب مع الإبرة تحت المجهر تشريح، ثم نقل العين إلى 4٪ فورمالديهايد السلطة لمدة ساعة واحدة. نقل العين مرة أخرى إلى طبق مع برنامج تلفزيوني. تحت مجهر تشريح، استخدم مقص التشريح لقطع كل الطريق حول تقاطع كورنيوسكليال.إزالة القرنية والعدسة. ثم قطع عليه في قاعدة العصب البصري وتقشير بعناية تصلب قبالة مع ملقط لعزل شبكية العين. جعل أربعة تخفيضات صغيرة بالتساوي حول شبكية العين واستخدام فرشاة تلميح غرامة انخفض في برنامج تلفزيوني لوضعها الجانب GCL شقة أسفل في شكل يشبه البرسيم على قطع مربع صغير من ورقة تصفية النيتروسليلوز.التقط زاوية ورق النيتروسليلوز مع ملقط وضعه في لوحة بئر 48 مع 4٪ فورمالديهايد الطاقة لمدة ساعة واحدة، ثم نقل ورقة التصفية والشبكية إلى بئر مع برنامج تلفزيوني وغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما. ذوبان A4P0 الحل على الجليد. ثم نقل شبكية العين إلى محلول A4P0 واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع التحريض لطيف.أضف الزيت النباتي إلى البئر لتغطية محلول A4P0 بالكامل. احتضان في حمام مائي في 40 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات مع عدم اهتزاز. ثم يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل.احتضان شبكية العين في كبريتات دودسيل الصوديوم 10٪ في 40 درجة مئوية لمدة يومين مع اهتزاز لطيف ثم نقل ورقة التصفية والشبكية إلى PBS مع تريتون X-100 وغسل خمس مرات لمدة 90 دقيقة لكل غسل. بعد الغسل النهائي، قم بتخزين الشبكية عند أربع درجات مئوية في PBS-T مع 0.01٪ من أزيد الصوديوم أو انتقل مباشرة إلى تلطيخ المناعة. إزالة شبكية العين من ورقة التصفية عن طريق تقشير بلطف تشغيله مع فرشاة تلميح غرامة في PBS-T.المحتضنة في الأجسام المضادة الأولية المخفف في حل حجب لمدة يومين في 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. بعد الحضانة، اغسل خمس مرات لمدة 90 دقيقة في PBS-T. احتضان شبكية العين مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخففة في حل حجب لمدة يومين في 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.حماية العينات من الضوء طوال الفترة المتبقية من الإجراء. غسل شبكية العين خمس مرات لمدة 90 دقيقة في 0.02 متر الفوسفات العازلة. أخيرا احتضان شبكية العين في معامل الانكسار القائم على سوربيتول مطابقة الحل في 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز لطيف.مخطط زلة غطاء زجاجي مع علامة دائمة تلميح غرامة لوضع علامة على حدود مربعة على الجزء الخلفي من شريحة المجهر الزجاجي. الوجه الشريحة واستخدام حقنة لتتبع الحدود مع خط رفيع من الشحوم السيليكون على الجزء الأمامي من الشريحة. ترك فجوة صغيرة في زاوية واحدة للحل تصاعد الزائدة للهروب.نقل شبكية العين إلى وسط المنطقة المحيطة ووضعها مع فرشاة طرف غرامة بحيث تقع شقة مع الجانب مستقبلات ضوئية ضد الشريحة الزجاجية. ماصة ما يقرب من 60 ميكرولتر من sRIMS بحيث يغطي شبكية العين بالارض ويمتد إلى زاوية واحدة من الضميمة. تأكد من أن الشبكية تبقى مسطحة وفي مكانها.تطبيق زلة الغطاء، بدءا من الزاوية مع SRIMS وخفض ببطء حتى يمس الشحوم على جميع الجوانب. ضع كومة من ثلاث زلات غطاء على كل جانب من شبكية العين المركبة كمسافة. استخدام حافة طويلة من شريحة أخرى للضغط على أسفل زلة الغطاء بحيث جبل مسطحة وحتى.تخزين الشرائح في أربع درجات مئوية حتى التصوير. ابدأ بوضع الشريحة على مرحلة المجهر وتحديد موقع العينة. للحصول على صور Z مكدسة من العينات، والتركيز أولا على إشارة في كل قناة على حدة وتعيين وقت التعرض أو سرعة المسح الضوئي للمجاهر الفلورية أو confocal على التوالي.تعيين النطاق للكدسة Z إما عن طريق تعيين المستوى البؤري يدويا في أعلى وأسفل النطاق المطلوب أو عن طريق تعيين نقطة الوسط ثم تحديد نطاق حول نقطة الوسط. ضبط حجم الخطوة أو عدد الشرائح حسب الرغبة. التقاط الصورة وحفظ الملف الأصلي.ثم تصديرها كملف TIF أو تنسيق آخر المطلوب. استخدام تحليل الصور، والبرمجيات المفضلة لضبط السطوع والتباين في كل قناة حتى يتم تحقيق الوضوح الأمثل في كل من الصور المفردة وتقديم ثلاثي الأبعاد من المكدس Z. عند معالجتها مع بروتوكول CLARITY المعدلة الشفافية البصرية الكاملة في جميع أنحاء سمك شبكية العين لوحظ بالمقارنة مع شبكية العين التحكم غير المجهزة.Z مكدسة الصور لScinin المخاريط المسمى في ONL، TH المسمى DAC في INL، وRBPMS RGCs ملحوظ في GCL تظهر هنا. لوحظ الموقع النسبي للخلايا العصبية في جميع أنحاء سمك شبكية العين بأكمله في صورة التراكب. تمت مقارنة تلطيخ TH و CLARITY بشبكية العين الكاملة في جبل مع الصور التي تم الحصول عليها من التحضير القياسي.تم الكشف عن Dendrites والعمليات الشبيهة بالمكون المحوري ل DACs بوضوح أكبر في شبكية العين المجهزة الوضوح مما كانت عليه في شبكية العين القياسية. أظهرت العمليات الشبيهة بالفأس من DACs هياكل كاملة تشبه الحلقة في شبكية العين الوضوح مقارنة بشبكية العين القياسية. كانت الهياكل الشبيهة بالحلقة لشبكية العين CLARITY التي تم التقاطها باستخدام المجهر الفلوري متطابقة تقريبا مع تلك التي لوحظت باستخدام المجهر الكونف البؤري.كما ركضت العمليات الشبيهة بالمقرن نحو شبكية العين الخارجية. وأظهرت تلطيخ المناعة ضد GluA2 و PSD-95 puncta متميزة، والكشف عن GluA2 الفردية التي تحتوي على مستقبلات AMPA ومواقع ما بعد متشابك المفترضة، على التوالي. وأظهرت صورة تراكب بعض puncta على عمليات لجنة المساعدة الإنمائية.وعرضت نقاط التوطين المشترك المفترض في طائرات XZ وYZ وXY وTH المترجمة بشكل مشترك مع كل من GluA2 و PSD-95. من المهم أن تبقى شبكية العين مسطحة أثناء عملية بلمرة الهيدروجيل بحيث يمكن للشبكية التي تم تطهيرها وضع مسطحة لعملية التركيب والتصوير.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

كله جبل وصفها من سيليا في النظام الشمية الرئيسية من الفئران

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...