Name: immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00
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我们要感谢叶冰冰、内森·斯皮克斯和刘浩的技术支持。这项工作得到了国家健康补助金研究所EY022640（D.-Q.Z.）和奥克兰大学教务长本科生研究奖（E.J.A.）的支持。

老鼠护理和所有实验程序都是根据国家卫生研究院关于实验室动物的指南进行的，并得到了奥克兰大学动物护理和使用机构委员会的批准（第18071号议定书）。
注：解决方案的名称及其组成列在 表1中。
1. 组织准备
<ol><li>用过量的二氧化碳对小鼠进行安乐死，然后是颈椎脱位。</li>
	<li>用弯曲的钳子使眼睛受洗，并将其转移到带有0.1...

<ol>
	<li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+retinal+function.">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li><li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+organization+of+the+mammalian+retina:+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases.">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li><li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina.">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li><li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina.">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).</li><li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li><li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells.">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332 (2013).</li><li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging.">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+CLARITY:+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue.">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain.">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li><li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+retinal+dopaminergic+neurons:+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments.">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li></ol>

修改全安装视网膜的清晰协议。 我们已经简化了CLARITY协议，以实现足够的聚合，而无需真空疏散或干燥室，如大多数以前的研究7，9，11所使用。聚合过程受到氧气的抑制，要求样品在协议的聚合步骤中从空气中分离。然而，我们发现，用油覆盖样品，而不是用氮气去气，从而充分隔离样品，使聚合在彻底冲洗?...

脊椎动物直膜也许是中枢神经系统（CNS）中最容易接近的部分，是研究大脑发育、结构和功能的极好模型。网状膜中的五类神经元分布在三个核层中，由两个丛状层隔开。外核层（ONL）由将光转换成电信号的经典光感受器（棒和圆锥体）组成。电信号由内核层 （INL） 中的神经元处理，包括双极、水平和阿马林细胞，然后传输到结节细胞层 （GCL） 中的视网膜结节细胞 （RGCs）。RGC 是视网膜的输出神经元，轴突投射到大脑中，有助于图像形成和非图像形成的视觉功能。此外，三种类型的胶质细胞（穆勒细胞、天文胶质和微胶质）为神经元提供营养，并保护神经元免受细胞外环境的有害变化。
一种特殊的亚种群的阿马克莱细胞产生和释放多巴胺，在CNS中的重要神经调节器，重新配置视网膜神经回路在光适应1，2。多巴胺胺性腺素细胞 （DACs） 具有形态特征的独特特征。他们的索玛塔位于近侧的 INL 中，树突在内丛状层 （IPL） 的最荒凉部分进行撞击。DAC 的Axon 样过程是未细化、薄而长、枝条稀疏且具有差异（多巴胺释放的部位）。它们与 IPL 中的树突形成密集的丛状物，包括围绕 AII amacrine 细胞的索马塔周围的环状结构。轴突也穿过 INL 向 OPL 运行，形成一条穿过视网膜3的离心通道。我们已经证明，DAC处理表达受体，以回应谷氨酸释放从前突性神经元，包括双极细胞和内在感光视网膜结节细胞（ipRGCs）4，5，6。然而，目前还不清楚谷氨酸受体是否表达在轴突上，树突上，或两者，因为它们被切断在垂直视网膜部分，不能区分彼此5，6。需要在整个安装视网膜中进行免疫染色，以揭示 DAC 的三维分支和亚细胞隔间中谷氨酸受体的存在。虽然视网膜相对透明，但小鼠全坐骑视网膜的厚度约为 200 μm，这限制了抗体渗透到深层组织，并减少了组织光散射导致的高分辨率成像光渗透。为了克服这些限制，我们调整了免疫染色相容组织水凝胶脱脂方法（CLARITY）最近开发的厚脑部分到全安装小鼠视网膜7。
CLARITY方法最初是由戴塞罗斯实验室开发的，用于免疫和成像厚脑样本7。它使用强洗涤剂、硫酸钠 （SDS） 和电磷酸盐去除脂质成分（导致组织光散射），使蛋白质和核酸就位。去除的脂质被一个透明的脚手架所取代，该脚手架由丙烯酰胺等水凝胶单体组成，以支持剩余的蛋白质结构。清除的组织可以通过免疫化学进行标记，并通过组织（组织表面以下几毫米）显著增加光渗透深度进行成像。此后，由8、9、10几个研究小组对CLARITY方法进行了优化和简化。修改后的CLARITY协议使用被动清除技术，以避免电泳可能产生的组织损伤，用于清除全脑和其他完整的器官11。然而，这种方法尚未应用于全山视网膜。在这里，我们为全山视网膜采用了被动的CLARITY技术，使其在免疫化学和成像方面更加透明。我们发现，在免疫造血过程中，大多数被测试的视网膜蛋白都保存下来。使用折射指数匹配解决方案，我们能够在全山视网膜中从 ONL 到 GCL 的大约 200μm 厚度上对视网膜神经元进行成像。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP170</td>
			<td>Hydrogel monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorscence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0258</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Bacteriostatic preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.122</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610301</td>
			<td>Delipidation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51876</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>011-19365</td>
			<td>Thermal initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method

组织水凝胶脱皮法（CLARITY），最初由戴塞罗斯实验室开发，已被修改并广泛用于免疫染色和成像厚脑样本。然而，这种先进的技术尚未用于全山视网膜。虽然视网膜是部分透明的，但其厚度约为200微米（小鼠），仍然限制抗体渗透到深层组织，并降低高分辨率成像的光渗透。在这里，我们采用了CLARITY方法，用丙烯酰胺单体聚合，形成纳米多孔水凝胶，然后用硫酸钠清除它们，以尽量减少蛋白质损失，避免组织损伤。CLARITY处理的视网膜被视网膜神经元、胶质细胞和突触蛋白的抗体所感染，安装在折射指数匹配溶液中，并成像。我们的数据表明，CLARITY可以提高全安装制备中视网膜神经元和胶质细胞的标准免疫化学染色和成像的质量。例如，CLARITY 大大提高了多巴胺胺类阿米林细胞精细轴突状和树突状结构的 3D 分辨率。与非加工全山视网膜相比，CLARITY 可以揭示突触蛋白（如后突触密度蛋白 95）的免疫染色。我们的结果表明，在去除脂质后，CLARITY 使视网膜更加透明，并保留了视网膜神经元及其蛋白质的精细结构，这些结构可用于在全安装制备中获取视网膜神经元及其子细胞结构的高分辨率成像。

经过修改的CLARE处理视网膜是光学透明组织。 为了制定一种与视网膜免疫生化应用相容的组织清除方法，同时提供足够的去皮化和保持细胞蛋白的结构完整性，我们采用了CLARITY组织清除方法，以全安装小鼠视网膜。我们能够简化协议并修改它为全安装视网膜（见协议）。在完成组织杂交、清除和折射索引匹配后，与非加工控制视网膜（图 1B）相比，使用此修?...

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Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

在这里，我们提出了一个协议，以调整整个安装视网膜脑组织的CLARITY方法，以提高标准免疫化学染色和视网膜神经元及其细胞下结构的高分辨率成像的质量。

使用清晰组织清除方法对全山视网膜进行免疫染色

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

该协议允许研究视网膜神经元的精细形态，并可以深入了解在疾病状态中发生的细胞和亚细胞形态变化。该方法显著提高了视网膜的光学透明度，并允许在激素视网膜制备中实现视网膜神经元的高分辨率、三维成像、电路布线和精细的亚细胞结构。用弯曲的钳子使鼠标眼睛受洗，并将它们转移到带有 0.1 M PBS 的小培养皿中。在解剖显微镜下用针头沿着角膜硬膜结处戳一个小孔，然后将眼睛转移到4%功率甲醛中一小时。将眼睛移回带有 PBS 的菜。在解剖显微镜下，使用解剖剪刀在科内奥斯特拉尔交界处一路切割。取出角膜和镜片。然后在视神经底部切开它，用钳子小心地剥去硬膜，以隔离视网膜。在视网膜周围均匀地进行四个小切口，并使用浸入 PBS 的细尖刷，将其平整的 GCL 侧面放在三叶草状形状上，由硝基纤维素滤纸切成小方形。用钳子拾起硝基纤维素纸的一角，放在48个油井板中，用4%的功率甲醛放置一小时，然后将滤纸和网膜转移到PBS的井中，每次洗三次，每次洗五分钟。在冰上解冻 A4P0 溶液。然后将小膜转移到A4P0溶液中，在四摄氏度的温度下温和地孵育一夜。将植物油加入油井中，以完全覆盖 A4P0 溶液。在40摄氏度的水浴中孵化3小时，无颤抖。然后在 PBS 中洗三次，每次洗涤五分钟。在40摄氏度的高温下将视网膜孵化两天，轻轻摇晃，然后用Triton X-100将滤纸和视网膜转移到PBS，每次洗涤90分钟洗5次。最后洗涤后，将视网膜存放在PBS-T的4摄氏度，含0.01%钠，或直接移动至免疫染色。用 PBS-T 中的细尖刷轻轻剥落滤纸，从滤纸中取出网膜。在主抗体中孵育，在40摄氏度的阻塞溶液中稀释两天，轻轻摇晃。孵化后，在PBS-T中洗5次90分钟。在40摄氏度的阻塞溶液中用适当的二次抗体孵育视网膜，轻轻摇晃两天。在整个过程的剩余过程中保护样品免受光线的照射。在 0.02 M 磷酸盐缓冲区中洗涤 5 次，90 分钟。最后在40摄氏度的温度下，在基于山醇的折射指数匹配溶液中孵育网膜，轻轻摇晃。勾勒出带有细尖永久标记的玻璃盖滑梯，以标记玻璃显微镜幻灯片背面的方形边界。翻转滑梯，使用注射器在滑梯正面用细细的硅胶油脂线追踪边界。在一个角落留下一个小缺口，以便多余的安装解决方案以逃避。将直膜转移到边界区域的中心，用细尖刷将其放置，使其与光感受器侧平放在玻璃滑梯上。派珀特约60微升的SRIMS，以便它覆盖扁平的网状网膜，并延伸到外壳的一角。确保小膜保持平整和原位。应用盖滑，从角落开始与 SRIMS，并慢慢降低它，直到它触及油脂的所有方面。将一叠三个盖片放在安装的网膜的每一侧作为垫片。使用另一张幻灯片的长边向下按下盖滑，使山是平的，均匀的。将幻灯片存放在摄氏四度，直到成像。首先将幻灯片放在显微镜舞台上并定位样品。要获取样品的 Z 堆叠图像，请首先单独聚焦每个通道中的信号，并分别设置荧光或共焦显微镜的曝光时间或扫描速度。通过手动将焦距设置在所需范围的顶部和底部，或者设置中点，然后在中点周围指定范围，为 Z 堆栈设置范围。根据需要调整步幅大小或切片数量。捕获图像并保存原始文件。然后作为 TIF 文件或其他所需的格式导出。使用图像分析、选择的软件来调整每个通道的亮度和对比度，直到在单个图像和 Z 堆栈的三维渲染中实现最佳清晰度。与非加工控制视网膜相比，使用修改后的 CLARITY 协议处理时，观察到视网膜厚度的完全光学透明度。此处显示了在 ONL 中标记的塞洛丁标记圆锥体的 Z 堆叠图像，在 INL 中标记 DAC 的 TH 的 Z 堆叠图像，以及在 GCL 中标记的 RBPMS 标记的 RGC 的 Z 堆叠图像。在叠加图像中观察到神经元在整个视网膜厚度的相对位置。TH染色和CLARITY处理整个视网膜山与从标准制备获得的图像进行比较。与标准网状网膜相比，DAC 的树突和轴突状过程在清晰处理的网状中更清晰地显现出来。与标准的光膜相比，DAC 的Axon 样过程在清晰的网状网膜中表现出完整的环状结构。使用荧光显微镜拍摄的CLARITY光子的环状结构与使用共聚焦显微镜观察到的结构几乎相同。类似轴龙的过程也向外视网膜运行。对GluA2和PSD-95的免疫染色显示明显的双关语，分别揭示含有AMPA受体和假设性后突触位点的单独GluA2。叠加图像显示了 DAC 进程上的一些点缀。在 XZ、YZ 和 XY 平面中提出了假设性联合本地化点，TH 与 GluA2 和 PSD-95 都清晰地进行了联合本地化。重要的是，在水凝胶聚合过程中，网膜保持平整，以便清除的网膜可以平放用于安装和成像过程。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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在全安装的胚胎神经系统的可视化果蝇胚胎

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

科研

神经科学

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