Name: immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method at JoVE.com

We willen Bing Ye, Nathan Spix en Hao Liu bedanken voor de technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) en Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).

Muizenzorg en alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health voor proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Oakland University (protocol nr. 18071).
OPMERKING: De namen van de oplossingen en hun samenstellingen zijn opgenomen in tabel 1.
1. Weefselvoorbereiding
<ol><li>Euthanaseer de muis met een overdosis CO2,gevolgd door cervi...

<ol>
	<li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+retinal+function.">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li><li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+organization+of+the+mammalian+retina:+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases.">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li><li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina.">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li><li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina.">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).</li><li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li><li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells.">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332 (2013).</li><li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging.">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+CLARITY:+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue.">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain.">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li><li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+retinal+dopaminergic+neurons:+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments.">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li></ol>

Wijziging van het CLARITY-protocol voor retina's met hele montering. We hebben het CLARITY-protocol vereenvoudigd om adequate polymerisatie te bereiken zonder dat er een vacuümevacuatie- of uitdrogingskamer nodig is, zoals wordt gebruikt in de meeste eerdere studies7,9,11. Het polymerisatieproces wordt geremd door zuurstof, waardoor het monster tijdens de polymerisatiestap van het protocol uit de lucht moet ...

Het gewervelde netvlies is misschien wel het meest toegankelijke deel van het centrale zenuwstelsel (CZS) en dient als een uitstekend model voor het bestuderen van de ontwikkeling, structuur en functie van de hersenen. Vijf klassen neuronen in het netvlies zijn verdeeld in drie nucleaire lagen gescheiden door twee plexivormlagen. De buitenste kernlaag (ONL) bestaat uit klassieke fotoreceptoren (staven en kegels) die licht omzetten in elektrische signalen. Elektrische signalen worden verwerkt door neuronen in de binnenste nucleaire laag (INL), waaronder bipolaire, horizontale en amacrinecellen, en vervolgens overgebracht naar retinale ganglioncellen (RGCs) in de ganglioncellaag (GCL). RGC's zijn de outputneuronen van het netvlies, waarbij de axonen naar de hersenen projecteren om bij te dragen aan beeldvormende en niet-beeldvormende visuele functie. Bovendien leveren drie soorten gliacellen (Muller-cellen, astroglia en microglia) voedingsstoffen aan neuronen en beschermen neuronen tegen schadelijke veranderingen in hun extracellulaire omgeving.
Een gespecialiseerde subpopulatie van amacrinecellen produceert en geeft dopamine vrij, een belangrijke neuromodulator in het CZS, die retinale neurale circuits herconfigureert tijdens lichtaanpassing1,2. Dopaminerge amacrinecellen (DAC's) hebben een uniek kenmerk van morfologische profielen. Hun somata bevinden zich in de proximale INL met dendrieten die rammen in het meest distale deel van de binnenste plexivormlaag (IPL). Axon-achtige processen van DAC's zijn ongemyelineerd, dun en lang, schaars vertakt en dragen spataderen (de plaatsen van dopamine-afgifte). Ze vormen een dichte plexus met dendrieten in de IPL, inclusief ringachtige structuren rond de somata van AII amacrinecellen. De axonen lopen ook door de INL naar de OPL en vormen een centrifugale route over het netvlies3. We hebben aangetoond dat DAC-processen receptoren uitdrukken als reactie op glutamaatafgifte uit presynaptische neuronen, waaronder bipolaire cellen en intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglioncellen (ipRGCs)4,5,6. Het is echter onduidelijk of glutamaatreceptoren zich uitdrukken op de axonen, dendrieten of beide, omdat ze zijn afgesneden in verticale retinale secties en niet van elkaar kunnen worden onderscheiden5,6. Immunostaining moet worden uitgevoerd in volledig gemonteerde netvliezen om driedimensionale vertakking van DAC's en de aanwezigheid van glutamaatreceptoren op subcellulaire compartimenten aan het licht te komen. Hoewel het netvlies relatief transparant is, is de dikte van een muis volledig gemonteerd netvlies ongeveer 200 μm, wat de penetratie van antilichamen in het diepe weefsel beperkt en de lichtpenetratie vermindert voor beeldvorming met hoge resolutie als gevolg van weefsellichtverstrooiing. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we de immunostaining compatibele weefselhydrogel delipidatiemethode (CLARITY) die onlangs is ontwikkeld voor dikke hersensecties, aangepast aan het netvlies van de muis7.
De CLARITY-methode is oorspronkelijk ontwikkeld door het Deisseroth-laboratorium voor immunostaining en beeldvorming van dikke hersenmonsters7. Het maakt gebruik van een sterk reinigingsmiddel, natriumdodecylsulfaat (SDS) en elektroforese om de lipidecomponenten te verwijderen (die weefsellichtverstrooiing veroorzaken), waardoor de eiwitten en nucleïnezuren op hun plaats blijven. De verwijderde lipiden worden vervangen door een transparante steiger bestaande uit hydrogelmonomeren zoals acrylamide ter ondersteuning van de resterende eiwitstructuur. Het gewiste weefsel kan worden geëtiketteerd via immunohistochie en afgebeeld met aanzienlijk verhoogde lichtpenetratiediepte door het weefsel (tot enkele millimeters onder het weefseloppervlak). Sindsdien is de CLARITY-methode geoptimaliseerd en vereenvoudigd door verschillende onderzoeksgroepen8,9,10. Een gewijzigd CLARITY-protocol maakt gebruik van een passieve clearingtechniek om de mogelijke weefselschade veroorzaakt door elektroforese te voorkomen voor het opruimen van de hele hersenen en andere intacte organen11. Deze methode is echter nog niet toegepast op retina's met hele montering. Hier hebben we de passieve CLARITY-techniek voor volledig gemonteerde retina's aangepast om ze transparanter te maken voor immunohistochie en beeldvorming. We ontdekten dat een meerderheid van de geteste retinale eiwitten tijdens dit proces werd bewaard voor immunohistochgie. Met behulp van de refractieve index matching oplossing, waren we in staat om retinale neuronen in beeld te brengen over de ongeveer 200 μm dikte van de ONL naar de GCL in hele retinas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP170</td>
			<td>Hydrogel monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorscence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0258</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Bacteriostatic preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.122</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610301</td>
			<td>Delipidation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51876</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>011-19365</td>
			<td>Thermal initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method

De weefselhydrogeldelipidatiemethode (CLARITY), oorspronkelijk ontwikkeld door het Deisseroth-laboratorium, is gewijzigd en wordt veel gebruikt voor immunostaining en beeldvorming van dikke hersenmonsters. Deze geavanceerde technologie is echter nog niet gebruikt voor volledig gemonteerde retina's. Hoewel het netvlies gedeeltelijk transparant is, beperkt de dikte van ongeveer 200 μm (bij muizen) nog steeds de penetratie van antilichamen in het diepe weefsel en vermindert het de lichtpenetratie voor beeldvorming met hoge resolutie. Hier hebben we de CLARITY-methode voor het netvlies van de muis in zijn geheel aangepast door ze te polymeriseren met een acrylamidemonomeer om een nanoporeuze hydrogel te vormen en ze vervolgens te verwijderen in natriumdodecylsulfaat om eiwitverlies te minimaliseren en weefselschade te voorkomen. CLARITY-verwerkte retinas werden immunostained met antilichamen voor retinale neuronen, gliacellen en synaptische eiwitten, gemonteerd in een refractieve index matching oplossing, en afgebeeld. Onze gegevens tonen aan dat CLARITY de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en beeldvorming voor retinale neuronen en gliacellen in de hele montering kan verbeteren. Bijvoorbeeld, 3D-resolutie van fijne axon-achtige en dendritische structuren van dopaminerge amacrine cellen werden veel verbeterd door CLARITY. In vergelijking met niet-verwerkte retina's met hele monturen kan CLARITY immunostaining onthullen voor synaptische eiwitten zoals postsynaptisch dichtheidseiwit 95. Onze resultaten tonen aan dat CLARITY het netvlies optisch transparanter maakt na het verwijderen van lipiden en fijne structuren van retinale neuronen en hun eiwitten behoudt, die routinematig kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van beeldvorming met hoge resolutie van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren in de voorbereiding van de hele berg.

Gemodificeerde CLARITY-verwerkte retina's zijn optisch transparant weefsel. Om een weefselophelderingsmethode te formuleren die compatibel is met immunohistochemische toepassingen in het netvlies, terwijl het voldoende delipidatie biedt en de structurele integriteit van de cellulaire eiwitten behoudt, hebben we de CLARITY-weefselopruimingsmethode aangepast aan het netvlies van de muis. We konden het protocol vereenvoudigen en wijzigen voor retina's met hele bevestiging (zie Protocol). Na voltooiing va...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method at JoVE.com

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Hier presenteren we een protocol om de CLARITY-methode van de hersenweefsels aan te passen voor volledig gemonteerde retinas om de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en hoge resolutie beeldvorming van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren te verbeteren.

Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Dit protocol maakt het mogelijk om de fijne morfologie van retinale neuronen te onderzoeken en kan inzicht geven in de cellulaire en subcellulaire morfologische veranderingen die optreden in ziektetoestanden. Deze methode verbetert de optische transparantie van het netvlies aanzienlijk en maakt hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming, circuitbedrading en fijne subcellulaire structuren van retinale neuronen in hormoon retinapreparaat mogelijk. Maak de muisogen met gebogen tangen en breng ze over in een kleine petrischaal met 0,1 M PBS.Prik een klein gaatje langs de hoornvliesscleraverbinding met de naald onder de dissectiemicroscoop en breng het oog vervolgens gedurende een uur over in 4%power formaldehyde. Breng het oog terug naar een schaal met PBS. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een dissectieschaar om helemaal rond de Corneoscleral-verbinding te snijden.Verwijder het hoornvlies en de lens. Snijd het vervolgens aan de basis van de oogzenuw en pel de sclera voorzichtig af met een tang om het netvlies te isoleren. Maak vier kleine sneetjes gelijkmatig rond het netvlies en gebruik een fijne tipborstel gedrenkt in PBS om het plat GCL-kant naar beneden te leggen in de klaverachtige vorm op een kleine vierkante snede van nitrocellulosefilterpapier.Pak de hoek van het nitrocellulosepapier met tang en plaats het gedurende een uur in een 48-putplaat met 4%power formaldehyde, breng vervolgens het filterpapier en netvlies over naar een put met PBS en was het drie keer gedurende vijf minuten elk. Ontdooi de A4P0-oplossing op ijs. Breng vervolgens het netvlies over in de A4P0-oplossing en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius met zachte agitatie.Voeg plantaardige olie toe aan de put om de A4P0-oplossing volledig te bedekken. Incubeer drie uur lang in een waterbad bij 40 graden Celsius zonder te schudden. Was vervolgens drie keer in PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt.Incubeer het netvlies in 10% natriumdodecylsulfaat bij 40 graden Celsius gedurende twee dagen met zacht schudden en breng vervolgens het filterpapier en netvlies over naar PBS met Triton X-100 en was vijf keer gedurende 90 minuten per wasbeurt. Bewaar na de laatste wasbeurt het netvlies op vier graden Celsius in PBS-T met 0,01% natrium azide of ga direct naar immunokleuring. Verwijder het netvlies van het filterpapier door het voorzichtig af te pellen met een fijnpenseel in PBS-T.Geïncubeerd in primair antilichaam verdund in blokkerende oplossing gedurende twee dagen bij 40 graden Celsius met zacht schudden. Was na de incubatie vijf keer gedurende 90 minuten in PBS-T. Incubeer het netvlies met geschikte secundaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing gedurende twee dagen bij 40 graden Celsius met zacht schudden.Bescherm de monsters gedurende de rest van de procedure tegen licht. Was het netvlies vijf keer gedurende 90 minuten in 0,02 M fosfaatbuffer. Tot slot incubeer het netvlies in sorbitol-gebaseerde brekingsindex matching oplossing op 40 graden Celsius 's nachts met zacht schudden.Omlijn een glazen afdekstrook met een fijne punt permanente marker om een vierkante grens op de achterkant van een glazen microscoopschuif te markeren. Draai de schuif om en gebruik een spuit om de grens te traceren met een dunne lijn siliconenvet aan de voorkant van de glijbaan. Laat een klein gaatje in een hoek voor overtollige montageoplossing ontsnappen.Breng het netvlies over naar het midden van het begrensde gebied en plaats het met een fijne puntborstel zodat het plat ligt met de fotoreceptorzijde tegen de glazen schuif. Pipetteer ongeveer 60 microliter sRIMS zodat het het afgeplatte netvlies bedekt en zich uitstrekt tot een hoek van de behuizing. Zorg ervoor dat het netvlies plat en op zijn plaats blijft.Breng de afdekslip aan, beginnend vanuit de hoek met de sRIMS en laat deze langzaam zakken totdat deze het vet aan alle kanten raakt. Plaats een stapel van drie afdekslips aan elke kant van het gemonteerde netvlies als een afstandsruimte. Gebruik de lange rand van een andere schuif om de afdekslip naar beneden te drukken, zodat de houder vlak en gelijkmatig is.Bewaar de dia's op vier graden Celsius tot beeldvorming. Begin met het plaatsen van de dia op het microscoopstadium en het lokaliseren van het monster. Om Z-gestapelde beelden van monsters te verkrijgen, richt u eerst op het signaal in elk kanaal afzonderlijk en stelt u de belichtingstijd of scansnelheid in voor respectievelijk fluorescentie- of confocale microscopen.Stel het bereik voor de Z-stack in door het brandpuntsvlak handmatig in te stellen aan de boven- en onderkant van het gewenste bereik of door het middelpunt in te stellen en vervolgens een bereik rond het middelpunt op te geven. Pas de stapgrootte of het aantal segmenten naar wens aan. Leg de afbeelding vast en sla het oorspronkelijke bestand op.Vervolgens geëxporteerd als een TIF-bestand of een ander gewenst formaat. Gebruik beeldanalyse, software naar keuze om de helderheid en het contrast in elk kanaal aan te passen totdat optimale helderheid wordt bereikt in zowel de enkele beelden als de driedimensionale weergave van de Z-stack. Bij verwerking met het aangepaste CLARITY-protocol werd volledige optische transparantie over de dikte van het netvlies waargenomen in vergelijking met niet-verwerkte controle retinas.Z gestapelde afbeeldingen voor Arrestin gelabelde kegels in ONL, TH gelabeld DAC's in INL, en RBPMS gemarkeerde RGCs in GCL worden hier weergegeven. De relatieve locatie van neuronen over de gehele dikte van het netvlies werd waargenomen in het overlay-beeld. TH-kleuring en CLARITY verwerkt geheel Mount retinas werd vergeleken met beelden verkregen uit standaard voorbereiding.Dendrieten en axon-achtige processen van DAC's werden duidelijker onthuld in een helder verwerkt netvlies dan in een standaard netvlies. Axon-achtige processen van DAC's vertoonden complete ringachtige structuren in een helder netvlies in vergelijking met een standaard netvlies. Ringachtige structuren van CLARITY retina genomen met behulp van fluorescentiemicroscopie waren bijna identiek aan die waargenomen met behulp van confocale microscopie.De axon-achtige processen liepen ook naar het buitenste netvlies. Immunokleuring tegen GluA2 en PSD-95 vertoonde verschillende puncta, waardoor individuele GluA2 werd onthuld die respectievelijk AMPA-receptoren en putatieve post synaptische sites bevatten. Een overlay-afbeelding toonde enkele puncta op DAC-processen.De punten van putatieve colokalisatie werden gepresenteerd in XZ-, YZ- en XY-vlakken en TH werden duidelijk gelokaliseerd met zowel GluA2 als PSD-95. Het is belangrijk dat het netvlies vlak blijft tijdens het hydrogelpolymerisatieproces, zodat het ontruimde netvlies plat kan liggen voor het montage- en beeldvormingsproces.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissectie van de Transversus Abdominis Spier voor Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Hele Mount Labeling van Cilia in het Main Olfactorische Systeem van Muizen

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optische Clearing van de Muis centrale zenuwstelsel met passieve DUIDELIJKHEID

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...