Name: immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00
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Wir danken Bing Ye, Nathan Spix und Hao Liu für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) und den Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.) unterstützt.

Die Mauspflege und alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health für Labortiere durchgeführt und von den Institutional Animal Care and Use Committees der Oakland University genehmigt (Protokoll Nr. 18071).
HINWEIS: Die Namen der Lösungen und ihre Zusammensetzungen sind in Tabelle 1aufgeführt.
1. Gewebevorbereitung
<ol><li>Euthanisieren Sie die Maus mit einer Überdosis CO2, gefolgt v...

<ol>
	<li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+retinal+function.">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li><li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+organization+of+the+mammalian+retina:+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases.">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li><li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina.">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li><li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina.">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).</li><li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li><li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells.">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332 (2013).</li><li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging.">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+CLARITY:+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue.">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain.">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li><li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+retinal+dopaminergic+neurons:+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments.">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li></ol>

Modifikation des CLARITY-Protokolls für Ganzhaut. Wir haben das CLARITY-Protokoll vereinfacht, um eine angemessene Polymerisation zu erreichen, ohne dass eine Vakuumevakuierungs- oder Austrocknungskammer erforderlich ist, wie es in den meisten früheren Studien verwendet wird7,9,11. Der Polymerisationsprozess wird durch Sauerstoff gehemmt, so dass die Probe während des Polymerisationsschritts des Protokolls...

Die Netzhaut von Wirbeltieren ist vielleicht der zugänglichste Teil des zentralen Nervensystems (ZNS) und dient als hervorragendes Modell für die Untersuchung der Entwicklung, Struktur und Funktion des Gehirns. Fünf Klassen von Neuronen in der Netzhaut sind in drei Kernschichten verteilt, die durch zwei plexiforme Schichten getrennt sind. Die äußere Kernschicht (ONL) besteht aus klassischen Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen), die Licht in elektrische Signale umwandeln. Elektrische Signale werden von Neuronen in der inneren Kernschicht (INL), einschließlich bipolarer, horizontaler und amakriner Zellen, verarbeitet und dann an retinale Ganglienzellen (RGCs) in der Ganglienzellschicht (GCL) übertragen. RGCs sind die Ausgangsneuronen der Netzhaut, wobei die Axone auf das Gehirn projizieren, um zur bildbildenden und nicht bildbildenden visuellen Funktion beizutragen. Darüber hinaus versorgen drei Arten von Gliazellen (Müllerzellen, Astroglia und Mikroglia) Neuronen mit Nährstoffen und schützen Neuronen vor schädlichen Veränderungen in ihrer extrazellulären Umgebung.
Eine spezialisierte Subpopulation von amakrinen Zellen produziert und setzt Dopamin frei, einen wichtigen Neuromodulator im ZNS, der die neuronalen Schaltkreise der Netzhaut während der Lichtanpassung neu konfiguriert1,2. Dopaminerge Amakrinzellen (DACs) haben eine einzigartige Eigenschaft morphologischer Profile. Ihre Somata befinden sich im proximalen INL mit Dendriten, die sich im distalsten Teil der inneren plexiformen Schicht (IPL) verzweigen. Axonähnliche Prozesse von DACs sind unmyeliniert, dünn und lang, spärlich verzweigt und tragen Krampfadern (die Stellen der Dopaminfreisetzung). Sie bilden einen dichten Plexus mit Dendriten im IPL, einschließlich ringförmiger Strukturen um die Somata von AII-Amakrinzellen. Die Axone verlaufen auch durch das INL in Richtung OPL und bilden einen Zentrifugalweg über die Netzhaut3. Wir haben gezeigt, dass DAC-Prozesse Rezeptoren als Reaktion auf die Freisetzung von Glutamat aus präsynaptischen Neuronen, einschließlich bipolarer Zellen und intrinsisch lichtempfindlicher retinaler Ganglienzellen (ipRGCs)exprimieren 4,5,6. Es ist jedoch unklar, ob Glutamatrezeptoren auf die Axone, Dendriten oder beides exprimieren, da sie in vertikalen Netzhautabschnitten abgeschnitten sind und nicht voneinander unterschieden werden können5,6. Die Immunfärbung muss in ganzgedeckten Netzhäuten durchgeführt werden, um eine dreidimensionale Verzweigung von DACs und das Vorhandensein von Glutamatrezeptoren auf subzellulären Kompartimenten aufzudecken. Obwohl die Netzhaut relativ transparent ist, beträgt die Dicke einer Maus-Netzhaut etwa 200 μm, was das Eindringen von Antikörpern in das tiefe Gewebe begrenzt und die Lichtdurchdringung für hochauflösende Bildgebung aufgrund der Gewebelichtstreuung reduziert. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir die immunstaining-kompatible Gewebehydrogel-Delipidationsmethode (CLARITY) angepasst, die kürzlich für dicke Hirnschnitte entwickelt wurde, um die Netzhaut der Maus ganz zu montieren7.
Die CLARITY-Methode wurde ursprünglich vom Deisseroth-Labor zur Immunfärbung und Bildgebung dicker Hirnproben entwickelt7. Es verwendet ein starkes Reinigungsmittel, Natriumdodecylsulfat (SDS) und Elektrophorese, um die Lipidkomponenten (die Gewebelichtstreuung verursachen) zu entfernen und die Proteine und Nukleinsäuren an Ort und Stelle zu lassen. Die entfernten Lipide werden durch ein transparentes Gerüst aus Hydrogelmonomeren wie Acrylamid ersetzt, um die verbleibende Proteinstruktur zu unterstützen. Das gereinigte Gewebe kann immunhistochemisch markiert und mit deutlich erhöhter Lichteindringtiefe durch das Gewebe (bis zu mehreren Millimeter unter der Gewebeoberfläche) abgebildet werden. Seitdem wurde die CLARITY-Methode von mehreren Forschungsgruppen 8 ,9,10optimiert und vereinfacht. Ein modifiziertes CLARITY-Protokoll verwendet eine passive Clearing-Technik, um die möglichen Gewebeschäden zu vermeiden, die durch Elektrophorese zur Beseitigung des gesamten Gehirns und anderer intakter Organe verursacht werden11. Diese Methode wurde jedoch noch nicht auf ganz montierte Netzhäute angewendet. Hier haben wir die passive CLARITY-Technik für Ganzkörper-Netzhäute angepasst, um sie für die Immunhistochemie und Bildgebung transparenter zu machen. Wir fanden heraus, dass ein Großteil der getesteten Netzhautproteine während dieses Prozesses für die Immunhistochemie erhalten blieb. Mit der Brechungsindex-Matching-Lösung konnten wir Netzhautneuronen über die etwa 200 μm Dicke von der ONL bis zur GCL in ganz montierten Netzhäuten abbilden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP170</td>
			<td>Hydrogel monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorscence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0258</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Bacteriostatic preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.122</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610301</td>
			<td>Delipidation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51876</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>011-19365</td>
			<td>Thermal initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method

Die Gewebehydrogel-Delipidationsmethode (CLARITY), die ursprünglich vom Deisseroth-Labor entwickelt wurde, wurde modifiziert und häufig für die Immunfärbung und Bildgebung dicker Gehirnproben verwendet. Diese fortschrittliche Technologie wurde jedoch noch nicht für ganz montierte Netzhäute verwendet. Obwohl die Netzhaut teilweise transparent ist, begrenzt ihre Dicke von etwa 200 μm (bei Mäusen) immer noch das Eindringen von Antikörpern in das tiefe Gewebe und reduziert die Lichtdurchdringung für hochauflösende Bildgebung. Hier haben wir die CLARITY-Methode für ganz montierte Maus-Netzhäute angepasst, indem wir sie mit einem Acrylamidmonomer zu einem nanoporösen Hydrogel polymerisiert und dann in Natriumdodecylsulfat räten, um den Proteinverlust zu minimieren und Gewebeschäden zu vermeiden. CLARITY-verarbeitete Netzhäute wurden mit Antikörpern für Netzhautneuronen, Gliazellen und synaptische Proteine immungefärbt, in einer Brechungsindex-Matching-Lösung montiert und abgebildet. Unsere Daten zeigen, dass CLARITY die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und Bildgebung für Netzhautneuronen und Gliazellen in der Ganzkörperpräparation verbessern kann. So wurde beispielsweise die 3D-Auflösung feiner axonartiger und dendritischer Strukturen dopaminerger Amakrinzellen durch CLARITY deutlich verbessert. Im Vergleich zu nicht verarbeiteten Ganzkörper-Netzhäuten kann CLARITY eine Immunfärbung für synaptische Proteine wie postsynaptisches Dichteprotein 95 aufdecken. Unsere Ergebnisse zeigen, dass CLARITY die Netzhaut nach der Entfernung von Lipiden optisch transparenter macht und feine Strukturen von Netzhautneuronen und deren Proteinen bewahrt, die routinemäßig zur hochauflösenden Abbildung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen in der Ganzlagervorbereitung verwendet werden können.

Modifizierte CLARITY-verarbeitete Netzhäute sind optisch transparentes Gewebe. Um eine Gewebereinigungsmethode zu formulieren, die mit immunhistochemischen Anwendungen in der Netzhaut kompatibel ist und gleichzeitig eine ausreichende Entspeiung bietet und die strukturelle Integrität der zellulären Proteine beibehält, haben wir die CLARITY-Gewebereinigungsmethode an die Netzhaut von Mäusen angepasst. Wir konnten das Protokoll vereinfachen und für ganz montierte Netzhäute modifizieren (siehe Prot...

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Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anpassung der CLARITY-Methode des Hirngewebes für ganzklächige Netzhäute vor, um die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und hochauflösenden Bildgebung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen zu verbessern.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der feinen Morphologie von Netzhautneuronen und kann Einblicke in die zellulären und subzellulären morphologischen Veränderungen geben, die in Krankheitszuständen auftreten. Diese Methode verbessert die optische Transparenz der Netzhaut erheblich und ermöglicht hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung, Schaltkreisverdrahtung und feine subzelluläre Strukturen von Netzhautneuronen in der Hormonnetzhautvorbereitung. Die Mausaugen mit einer gekrümmten Zette auffüllen und in eine kleine Petrischale mit 0,1 M PBS überführen.Stechen Sie ein kleines Loch entlang der Hornhautsklera-Verbindung mit der Nadel unter dem Dissektionsmikroskop und übertragen Sie dann das Auge für eine Stunde in 4% Power-Formaldehyd. Übertragen Sie das Auge zurück auf eine Schüssel mit PBS. Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop eine Dissektionsschere, um den gesamten Weg um die Hornhautübergang herum zu schneiden.Hornhaut und Linse entfernen. Schneiden Sie es dann an der Basis des Sehnervs ab und schälen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Ziffe ab, um die Netzhaut zu isolieren. Machen Sie vier kleine Schnitte gleichmäßig um die Netzhaut und verwenden Sie eine feine Spitzenbürste, die in PBS getaucht ist, um sie mit flacher GCL-Seite in der kleeartigen Form auf einen kleinen quadratischen Schnitt aus Nitrocellulose-Filterpapier zu legen.Nehmen Sie die Ecke des Nitrocellulosepapiers mit einer Handzette auf und legen Sie sie für eine Stunde in eine 48-Well-Platte mit 4% Power-Formaldehyd, dann das Filterpapier und die Netzhaut in eine Vertiefung mit PBS geben und dreimal für jeweils fünf Minuten waschen. A4P0-Lösung auf Eis auftauen. Anschließend die Netzhaut in die A4P0-Lösung überführen und über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanftem Rühren inkubieren.Fügen Sie Pflanzenöl in den Brunnen hinzu, um die A4P0-Lösung vollständig abzudecken. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 40 Grad Celsius für drei Stunden ohne Schütteln. Dann dreimal in PBS für fünf Minuten pro Waschgang waschen.Inkubieren Sie die Netzhaut in 10% Natriumdodecylsulfat bei 40 Grad Celsius für zwei Tage mit sanftem Schütteln, dann übertragen Sie das Filterpapier und die Netzhaut mit Triton X-100 auf PBS und waschen Sie fünfmal für 90 Minuten pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche die Netzhaut bei vier Grad Celsius in PBS-T mit 0,01% Natriumazid lagern oder direkt zur Immunfärbung übergehen. Entfernen Sie die Netzhaut vom Filterpapier, indem Sie sie vorsichtig mit einem feinen Spitzenpinsel in PBS-T abziehen.Inkubiert in primärem Antikörper, verdünnt in Blocklösung für zwei Tage bei 40 Grad Celsius mit sanftem Schütteln. Nach der Inkubation fünfmal für 90 Minuten in PBS-T waschen. Inkubieren Sie die Netzhaut mit geeigneten sekundären Antikörpern, die in Blocklösung verdünnt sind, zwei Tage lang bei 40 Grad Celsius unter sanftem Schütteln.Schützen Sie die Proben während des restlichen Verfahrens vor Licht. Waschen Sie die Netzhaut fünfmal für 90 Minuten in 0,02 M Phosphatpuffer. Schließlich wird die Netzhaut in Sorbitol-basierter Brechungsindex-Matching-Lösung bei 40 Grad Celsius über Nacht mit sanftem Schütteln inkubiert.Umreißen Sie einen Glasabdeckungsschlupf mit einem feinen Spitzen-Permanentmarker, um eine quadratische Grenze auf der Rückseite eines Glasmikroskopobjektträgers zu markieren. Drehen Sie den Schieber um und verwenden Sie eine Spritze, um die Grenze mit einer dünnen Linie silikone Fett auf der Vorderseite des Objektträgers zu verfolgen. Lassen Sie einen kleinen Spalt in einer Ecke, damit überschüssige Montagelösung entweichen kann.Übertragen Sie die Netzhaut in die Mitte des begrenzten Bereichs und positionieren Sie sie mit einem feinen Spitzenpinsel so, dass sie flach mit der Photorezeptorseite gegen den Glasträger liegt. Pipette etwa 60 Mikroliter sRIMS, so dass es die abgeflachte Netzhaut bedeckt und sich bis zu einer Ecke des Gehäuses erstreckt. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut flach und an Ort und Stelle bleibt.Tragen Sie den Deckelschlupf ab der Ecke mit dem sRIMS auf und senken Sie ihn langsam ab, bis er das Fett auf allen Seiten berührt. Legen Sie einen Stapel von drei Deckelzetteln auf jede Seite der montierten Netzhaut als Abstandhalter. Verwenden Sie die lange Kante eines anderen Schlittens, um den Deckelzettel nach unten zu drücken, so dass die Halterung flach und gleichmäßig ist.Lagern Sie die Dias bei vier Grad Celsius bis zur Bildgebung. Beginnen Sie, indem Sie den Objektträger auf den Mikroskopstand legen und die Probe lokalisieren. Um Z-gestapelte Bilder von Proben zu erhalten, konzentrieren Sie sich zunächst auf das Signal in jedem Kanal einzeln und stellen Sie die Belichtungszeit bzw. Scangeschwindigkeit für Fluoreszenz- bzw. Konfokalmikroskope ein.Legen Sie den Bereich für den Z-Stapel fest, indem Sie entweder die Fokusebene oben und unten im gewünschten Bereich manuell einstellen oder indem Sie den Mittelpunkt einstellen und dann einen Bereich um den Mittelpunkt angeben. Passen Sie die Schrittgröße oder die Anzahl der Slices wie gewünscht an. Erfassen Sie das Bild und speichern Sie die Originaldatei.Dann als TIF-Datei oder ein anderes gewünschtes Format exportiert. Verwenden Sie die Bildanalyse, eine Software Ihrer Wahl, um die Helligkeit und den Kontrast in jedem Kanal anzupassen, bis sowohl in den Einzelbildern als auch in der dreidimensionalen Wiedergabe des Z-Stacks eine optimale Klarheit erreicht ist. Bei der Verarbeitung mit dem modifizierten CLARITY-Protokoll wurde eine vollständige optische Transparenz über die gesamte Dicke der Netzhaut im Vergleich zu nicht verarbeiteten Kontroll-Netzhäuten beobachtet.Z-gestapelte Bilder für Arrestin-markierte Kegel in ONL, TH-markierte DACs in INL und RBPMS-markierte RGCs in GCL werden hier gezeigt. Die relative Position von Neuronen über die gesamte Dicke der Netzhaut wurde im Overlay-Bild beobachtet. TH-Färbung und CLARITY verarbeitete ganze Mount Netzhaut wurde mit Bildern aus der Standardvorbereitung verglichen.Dendriten und axonähnliche Prozesse von DACs wurden in einer klar verarbeiteten Netzhaut deutlicher aufgedeckt als in einer Standard-Netzhaut. Axonartige Prozesse von DACs zeigten im Vergleich zu einer Standard-Netzhaut vollständige ringartige Strukturen in einer klaren Netzhaut. Ringförmige Strukturen der CLARITY-Netzhaut, die mit Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, waren fast identisch mit denen, die mit konfokaler Mikroskopie beobachtet wurden.Die axonartigen Prozesse liefen auch in Richtung der äußeren Netzhaut. Die Immunfärbung gegen GluA2 und PSD-95 zeigte eine ausgeprägte Punktion, die einzelne GluA2-haltige AMPA-Rezeptoren bzw. mutmaßliche postsynaptische Stellen aufdeckte. Ein Overlay-Bild zeigte einige Punkte bei DAC-Prozessen.Die Punkte der mutmaßlichen Kollokalisierung wurden in XZ-, YZ- und XY-Ebenen dargestellt und TH-Kolokalisierung sowohl mit GluA2 als auch mit PSD-95 klar co-lokalisiert. Es ist wichtig, dass die Netzhaut während des Hydrogelpolymerisationsprozesses flach bleibt, damit die gereinigte Netzhaut für den Montage- und Bildgebungsprozess flach liegen kann.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Ganze Berge Kennzeichnung von Cilia im Hauptriechsystem der Mäuse

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...