Name: immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method at JoVE.com

ברצוננו להודות לבינג יה, ניית'ן ספיקס והאו ליו על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למענקי בריאות EY022640 (D.-Q.Z.) ופרס מחקר הסטודנטים של אוניברסיטת אוקלנד (E.J.A.).

טיפול בעכבר וכל ההליכים הניסיוניים נערכו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות עבור חיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אוקלנד (פרוטוקול מס ' 18071).
הערה: שמות הפתרונות והיצירות שלהם מפורטים בטבלה 1.
1. הכנת רק?...

<ol>
	<li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+retinal+function.">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li><li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+organization+of+the+mammalian+retina:+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases.">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li><li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina.">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li><li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina.">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).</li><li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li><li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells.">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332 (2013).</li><li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging.">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+CLARITY:+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue.">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain.">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li><li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+retinal+dopaminergic+neurons:+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments.">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li></ol>

שינוי פרוטוקול CLARITY עבור רשתית הרכבה שלמה. פישטנו את פרוטוקול CLARITY כדי להשיג פולמור הולם ללא צורך בפינוי ואקום או תא ייבוש, כפי שנעשה ברוב המחקריםהקודמים 7,9,11. תהליך הפולמליזציה מעוכב על ידי חמצן, הדורש כי המדגם להיות מבודד מהאוו...

הרשתית החולייתנית היא אולי החלק הנגיש ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), והיא משמשת מודל מצוין לחקר ההתפתחות, המבנה והתפקוד של המוח. חמישה סוגים של נוירונים ברשתית מופצים בשלוש שכבות גרעיניות המופרדות על ידי שתי שכבות plexiform. השכבה הגרעינית החיצונית (ONL) מורכבת מצלמי פוטורצפטורים קלאסיים (מוטות וקונוסים) הממירים אור לאותות חשמליים. אותות חשמליים מעובדים על ידי נוירונים בשכבה הגרעינית הפנימית (INL), כולל תאים דו קוטביים, אופקיים ואמקרין, ולאחר מכן מועברים לתאי גנגליון ברשתית (RGCs) בשכבת תא הגנגליון (GCL). RGCs הם נוירוני הפלט של הרשתית, כאשר האקסונים מקרינים למוח לתרום לתפקוד חזותי יוצר תמונה ולא יוצר תמונה. בנוסף, שלושה סוגים של תאי גליה (תאי מולר, אסטרגליה ומיקרוגליה) מספקים חומרים מזינים לנוירונים ומגנים על נוירונים מפני שינויים מזיקים בסביבה החוץ-תאית שלהם.
תת-אוכלוסין מיוחד אחד של תאי אמקרין מייצר ומשחרר דופמין, נוירומודולטור חשוב במערכת העצבים המרכזית, מגדיר מחדש מעגלים עצביים ברשתית במהלך הסתגלות אור1,2. לתאי אמקרין דופאמין (DACs) יש תכונה ייחודית של פרופילים מורפולוגיים. הסומטה שלהם ממוקמים INL proximal עם דנדריטים ramifying בחלק הדיסטלי ביותר של שכבת plexiform הפנימית (IPL). תהליכים דמויי אקסון של DACs הם unmyelinated, רזה וארוך, מסועף בדלילות, לשאת varicosities (האתרים של שחרור דופמין). הם יוצרים מקלעת צפופה עם דנדריטים ב- IPL, כולל מבנים דמויי טבעת סביב הסומטה של תאי אמקרין AII. האקסונים גם לרוץ דרך INL לכיוון OPL, יצירת מסלול צנטריפוגלי על פני הרשתית3. הוכחנו כי תהליכי DAC מבטאים קולטנים בתגובה לשחרור גלוטמט מתאי עצב פרה-קוטביים, כולל תאים דו קוטביים ותאי גנגליון רשתית רגישים באופן מהותי (ipRGCs)4,5,6. עם זאת, לא ברור אם קולטני גלוטמט מבטאים על האקסונים, הדנדריטים, או שניהם מכיוון שהם מנותקים בקטעי רשתית אנכיים ולא ניתן להבחין ביניהם5,6. חיסון צריך להתבצע ברשתיות הר שלם כדי לחשוף הסתעפות תלת מימדית של DACs ואת נוכחותם של קולטני גלוטמט על תאים תת תאיים. למרות הרשתית היא שקופה יחסית, עובי של רשתית הר עכבר כולו הוא כ 200 מיקרומטר, אשר מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם מפחית חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה עקב פיזור אור רקמה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, התאמנו את שיטת ההידרוגל התואמת לרקמות (CLARITY) שפותחה לאחרונה עבור מקטעי מוח עבים לרטינות עכבר הר שלם7.
שיטת CLARITY פותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוחעבות 7. הוא משתמש בחומר ניקוי חזק, נתרן דודציל סולפט (SDS) ואלקטרופרזה כדי להסיר את רכיבי השומנים (הגורמים לפיזור אור רקמות), ומשאיר את החלבונים וחומצות הגרעין במקומם. השומנים שהוסרו מוחלפים בפיגום שקוף המורכב ממונומרים הידרוג'ל כגון אקרילאמיד לתמיכה במבנה החלבון הנותר. ניתן לתייג את הרקמה המנוקה באמצעות אימונוהיסטוכימיה ולצלם אותה עם עומק חדירת אור מוגבר באופן משמעותי דרך הרקמה (עד כמה מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה). מאז, שיטת CLARITY עברה אופטימיזציה ופישוט על ידי מספר קבוצות מחקר8,9,10. פרוטוקול CLARITY שונה משתמש בטכניקת סליקה פסיבית כדי למנוע את הנזק האפשרי לרקמות המיוצר על ידי אלקטרופורזה לניקוי המוח כולו ואיברים שלמים אחרים11. עם זאת, שיטה זו עדיין לא הוחלה על רשתית הר שלם. כאן, התאמנו את טכניקת הבהירות הפסיבית עבור רטינות הר שלם כדי להפוך אותם שקופים יותר עבור אימונוהיסטוכימיה והדמיה. מצאנו כי רוב החלבונים ברשתית שנבדקו נשמרו במהלך תהליך זה עבור אימונוהיסטוכימיה. באמצעות פתרון התאמת אינדקס שבירה, הצלחנו לדמיין נוירונים ברשתית על פני עובי של כ 200 מיקרומטר מן ONL ל- GCL ברשתית הרכבה שלמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Fisher Biotech</td>
			<td>BP170</td>
			<td>Hydrogel monomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorscence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Scanning confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0258</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Bacteriostatic preservative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.122</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610301</td>
			<td>Delipidation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51876</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>011-19365</td>
			<td>Thermal initiator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount retinas with the clarity tissue clearing method

שיטת ההזיה הידרוג'ל רקמה (CLARITY), שפותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth, שונתה בשימוש נרחב עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוח עבות. עם זאת, טכנולוגיה מתקדמת זו עדיין לא שימשה עבור רטינות הר שלם. למרות הרשתית היא שקופה חלקית, עובי של כ 200 מיקרומטר (בעכברים) עדיין מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם הפחתת חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה. כאן, התאמנו את שיטת הבהירות עבור רשתית עכבר הר שלם על ידי פילמור אותם עם מונומר אקרילאמיד כדי ליצור הידרוג'ל nanoporous ולאחר מכן לנקות אותם נתרן דודקיל סולפט כדי למזער את אובדן החלבון ולמנוע נזק לרקמות. רשתיות מעובדות בהירות היו immunostained עם נוגדנים עבור נוירונים ברשתית, תאי גליה, וחלבונים סינפטיים, רכוב בתמיסת התאמת אינדקס שבירה, ודימוי. הנתונים שלנו מראים כי CLARITY יכול לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים והדמיה עבור נוירונים ברשתית ותאי גליה בהכנה לכל ההר. לדוגמה, רזולוציה תלת-ממדית של מבנים דקים דמויי אקסון ודנדריטי של תאי אמקרין דופאמין השתפרה בהרבה על ידי CLARITY. בהשוואה לרטינות לא מעובדות של הרכבה שלמה, CLARITY יכולה לחשוף חיסונים לחלבונים סינפטיים כגון חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית 95. התוצאות שלנו מראות כי CLARITY הופך את הרשתית לשקופה יותר מבחינה אופטית לאחר הסרת השומנים ומשמר מבנים עדינים של נוירונים ברשתית וחלבונים שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם באופן שגרתי להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ומבנים תת-תאיים שלהם בהכנה לכל ההר.

רשתית מעובדת בהירות שונה הם רקמה שקופה אופטית. כדי לגבש שיטת ניקוי רקמות התואמת ליישומים אימונוהיסטוכימיים ברשתית תוך מתן לשון נאותה ושימור השלמות המבנית של החלבונים התאיים, התאמנו את שיטת ניקוי רקמת CLARITY לרשתיות עכברים שלמות. הצלחנו לפשט את הפרוטוקול ולשנות אותו עבור רשתית הר...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method at JoVE.com

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להתאים את שיטת הבהירות של רקמות המוח עבור רטינות הר שלם כדי לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ואת המבנים התת תאיים שלהם.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

פרוטוקול זה מאפשר לחקור את המורפולוגיה העדינה של נוירונים ברשתית ויכול לתת תובנה על השינויים המורפולוגיים התאיים והתת-תאיים המתרחשים במצבי מחלה. שיטה זו משפרת באופן משמעותי את השקיפות האופטית של הרשתית ומאפשרת הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה, חיווט מעגלים ומבנים תאיים תת-תאיים עדינים של נוירונים ברשתית בהכנת רשתית הורמונלית. לאכוף את עיני העכבר עם מלקחיים מעוגלים ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי קטנה עם 0.1 M PBS.לתקוע חור קטן לאורך צומת סקלרה הקרנית עם המחט מתחת למיקרוסקופ הניתוח, ולאחר מכן להעביר את העין לתוך 4% כוח פורמלדהיד במשך שעה אחת. מעבירים את העין בחזרה למנה עם PBS. תחת מיקרוסקופ ניתוח, להשתמש מספריים ניתוח לחתוך את כל הדרך סביב צומת Corneoscleral.מוציאים את הקרנית והעדשה. ואז לחתוך אותו בבסיס עצב הראייה בזהירות לקלף את הסקלרה עם מלקחיים כדי לבודד את הרשתית. בצע ארבעה חתכים קטנים באופן שווה סביב הרשתית ולהשתמש מברשת קצה דק טבול PBS להניח אותו שטוח GCL בצד למטה בצורה דמוית תלתן על חתך מרובע קטן מנייר מסנן nitrocellulose.להרים את הפינה של נייר nitrocellulose עם מלקחיים ומניחים אותו בצלחת 48 היטב עם 4% כוח פורמלדהיד במשך שעה אחת, ולאחר מכן להעביר את נייר המסנן הרשתית לבאר עם PBS ולשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. להפשיר פתרון A4P0 על קרח. לאחר מכן העבירו את הרשתית לתמיסת A4P0 ודגרו בן לילה בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה.מוסיפים שמן צמחי לבאר כדי לכסות לחלוטין את פתרון A4P0. דגירה באמבט מים ב 40 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות ללא רעידות. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף.דגירה הרשתית ב 10% נתרן דודקיל סולפט ב 40 מעלות צלזיוס במשך יומיים עם טלטול עדין ולאחר מכן להעביר את נייר המסנן רשתית PBS עם טריטון X-100 ולשטוף חמש פעמים במשך 90 דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה הסופית, יש לאחסן את הרשתית ב-4 מעלות צלזיוס ב-PBS-T עם 0.01% נתרן אזיד או לעבור ישירות לכתמים אימונו. מוציאים את הרשתית מנייר הסינון על ידי קילוף עדין עם מברשת קצה עדינה ב-PBS-T.דגירה בנוגדן ראשוני מדולל בתמיסת חסימה במשך יומיים ב 40 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות. לאחר הדגירה, לשטוף חמש פעמים במשך 90 דקות PBS-T. דגירה הרשתית עם נוגדנים משניים מתאימים מדוללים בחסימת פתרון במשך יומיים ב 40 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות.הגן על הדגימות מפני אור לאורך שארית ההליך. לשטוף את הרשתית חמש פעמים במשך 90 דקות ב 0.02 M חוצץ פוספט. לבסוף דגירה הרשתית בתמיסת אינדקס שבירה מבוססת סורביטול ב 40 מעלות צלזיוס לילה עם רעידות עדינות.מיתאר תגית כיסוי זכוכית עם סמן קבוע קצה דק כדי לסמן גבול מרובע בחלק האחורי של שקופית מיקרוסקופ זכוכית. הפוך את השקופית והשתמש במזרק כדי לעקוב אחר הגבול עם קו דק של גריז סיליקון בחזית השקופית. השאירו פער קטן בפינה אחת לפתרון הרכבה עודף לברוח.מעבירים את הרשתית למרכז האזור התחום וממקמים אותה עם מברשת קצה עדינה כך שהיא שוכנת שטוחה עם הצד photoreceptor נגד שקופית הזכוכית. פיפט כ 60 microliters של sRIMS כך שהוא מכסה את הרשתית שטוחה משתרע על פינה אחת של המתחם. ודא כי הרשתית נשארת שטוחה במקומה.החל את תלוש הכיסוי, החל מהפינה עם sRIMS ולאט לאט להוריד אותו עד שהוא נוגע בשמן מכל הצדדים. מניחים ערימה של שלוש תלושי כיסוי בכל צד של הרשתית המותקנת כמרווח. השתמש בקצה הארוך של שקופית אחרת כדי ללחוץ על שובר הכיסוי כך שההר יהיה שטוח ושווה.אחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס עד להדמיה. התחל על ידי הצבת השקופית על שלב המיקרוסקופ ואיתור המדגם. כדי להשיג תמונות מוערמות Z של דגימות, התמקדו תחילה באות בכל ערוץ בנפרד וקבעו את זמן החשיפה או מהירות הסריקה למיקרוסקופים פלואורסצנטיים או קונפוקליים בהתאמה.הגדר את הטווח עבור מחסנית Z על-ידי הגדרה ידנית של מישור המוקד בחלק העליון והתחתון של הטווח הרצוי או על-ידי הגדרת נקודת האמצע ולאחר מכן ציון טווח סביב נקודת האמצע. התאימו את גודל הצעד או את מספר הפרוסות לפי הצורך. לכוד את התמונה ושמור את הקובץ המקורי.לאחר מכן יוצא כקובץ TIF או כתבנית רצויה אחרת. השתמש בניתוח תמונה, תוכנה לבחירה כדי להתאים את הבהירות והניגודיות בכל ערוץ עד שיושג בהירות אופטימלית הן בתמונות הבודדות והן בעיבוד התלת מימדי של מחסנית Z. כאשר מעובד עם פרוטוקול CLARITY שונה שקיפות אופטית מלאה לאורך העובי של הרשתית נצפתה לעומת רשתית בקרה לא מעובדת.תמונות מוערמות Z עבור קונוסים שכותרתו Arrestin ב- ONL, TH שכותרתו DAC של INL, ו RBPMS מסומן RGCs ב- GCL מוצגים כאן. המיקום היחסי של נוירונים לאורך כל עובי הרשתית נצפה בתמונה כיסוי. כתמי TH ובהירות מעובדים רטינות הר שלם הושווה עם תמונות שהתקבלו הכנה סטנדרטית.דנדריטים ותהליכים דמויי אקסון של DACs התגלו בצורה ברורה יותר ברשתית מעובדת בהירות מאשר ברשתית סטנדרטית. תהליכים דמויי אקסון של DACs הציגו מבנים שלמים דמויי טבעת ברשתית בהירות בהשוואה לרשתית סטנדרטית. מבנים דמויי טבעת של רשתית CLARITY שנלקחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי היו כמעט זהים לאלה שנצפו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.התהליכים דמויי האקסון רצו גם לכיוון הרשתית החיצונית. חיסון מכתים נגד GluA2 ו PSD-95 הראו puncta ברור, חושף GluA2 בודדים המכילים קולטני אמפא ואתרים סינפטיים פוסט putative פוסט, בהתאמה. תמונת שכבת-על הראתה ניקוב מסוים בתהליכי DAC.הנקודות של לוקליזציה משותפת putative הוצגו XZ, YZ, ו XY מטוסים TH במשותף באופן ברור עם שניהם GluA2 ו PSD-95. חשוב כי הרשתית נשארת שטוחה במהלך תהליך פולמור הידרוג'ל, כך הרשתית פינה יכול לשכב שטוח עבור תהליך הרכבה והדמיה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...