Name: chromatin extraction from frozen chimeric liver tissue for chromatin immunoprecipitation analysis
Uploaded: 2021-03-23T13:00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis at JoVE.com

تم دعم الدراسة من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) من خلال منحة إلى مورا داندري (SFB 841 A5) ومن قبل ولاية هامبورغ مع برنامج البحث (LFF-FV44: EPILOG).
نود أن نشكر الدكتور تاسيلو فولز وإيفون لاديجيس وأنيكا فولماري على المساعدة الفنية وعلى قراءة المخطوطة بشكل نقدي. الدكتور توماس غونتر والبروفيسور آدم جروندهوف لتقديمهما اقتراحات مفيدة للغاية ومجموعات التمهيدي لتحليل ChIP-qPCR.

<ol>
	<li>Waddington, C. H., Pantelouris, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+nuclei+in+newt's+eggs.">Transplantation of nuclei in newt's eggs.</a> Nature. 172 (4388), 1050-1051 (1953).</li><li>Silmon de Monerri, N. C., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+hijack+the+epigenome:+A+new+twist+on+host-pathogen+interactions.">Pathogens hijack the epigenome: A new twist on host-pathogen interactions.</a> American Journal of Pathology. 184 (4), 897-911 (2014).</li><li>Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshots:+chromatin+control+of+viral+infection.">Snapshots: chromatin control of viral infection.</a> Virology. 435 (1), 141-156 (2013).</li><li>Tropberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+histone+modifications+in+episomal+HBV+cccDNA+uncovers+an+unusual+chromatin+organization+amenable+to+epigenetic+manipulation.">Mapping of histone modifications in episomal HBV cccDNA uncovers an unusual chromatin organization amenable to epigenetic manipulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 5715-5724 (2015).</li><li>Sproul, D., Gilbert, N., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chromatin+structure+in+regulating+the+expression+of+clustered+genes.">The role of chromatin structure in regulating the expression of clustered genes.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (10), 775-781 (2005).</li><li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+and+chromatin+cross-talk.">Histone and chromatin cross-talk.</a> Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 172-183 (2003).</li><li>Ling, X., Harkness, T. A., Schultz, M. C., Fisher-Adams, G., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+histone+H3+and+H4+amino+termini+are+important+for+nucleosome+assembly+in+vivo+and+in+vitro:+redundant+and+position-independent+functions+in+assembly+but+not+in+gene+regulation.">Yeast histone H3 and H4 amino termini are important for nucleosome assembly in vivo and in vitro: redundant and position-independent functions in assembly but not in gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 10 (6), 686-699 (1996).</li><li>Zhang, L., Eugeni, E. E., Parthun, M. R., Freitas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+histone+post-translational+modifications+by+peptide+mass+fingerprinting.">Identification of novel histone post-translational modifications by peptide mass fingerprinting.</a> Chromosoma. 112 (2), 77-86 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431 (7010), 873-878 (2004).</li><li>Hassa, P. O., Haenni, S. S., Elser, M., Hottiger, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+ADP-ribosylation+reactions+in+mammalian+cells:+where+are+we+today+and+where+are+we+going.">Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 789-829 (2006).</li><li>Dey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">DNA-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 279-299 (2012).</li><li>Hager, G. L., McNally, J. G., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+dynamics.">Transcription dynamics.</a> Molecular Cell. 35 (6), 741-753 (2009).</li><li>Nagy, Z., Tora, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+GCN5/PCAF-containing+complexes+function+as+co-activators+and+are+involved+in+transcription+factor+and+global+histone+acetylation.">Distinct GCN5/PCAF-containing complexes function as co-activators and are involved in transcription factor and global histone acetylation.</a> Oncogene. 26 (37), 5341-5357 (2007).</li><li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde:+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene.">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li><li>Gunther, T., Theiss, J. M., Fischer, N., Grundhoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+viral+and+host+chromatin+by+ChIP-PCR+or+ChIP-Seq+analysis.">Investigation of viral and host chromatin by ChIP-PCR or ChIP-Seq analysis.</a> Current Protocols in Microbiology. 40, 11-21 (2016).</li><li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing.">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 419 (2015).</li><li>Haim, Y., Tarnovscki, T., Bashari, D., Rudich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+protocol+for+use+in+whole+human+adipose+tissue.">A chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for use in whole human adipose tissue.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (9), 1172-1177 (2013).</li><li>Castellano-Castillo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+improvements+for+the+processing+of+small+frozen+pieces+of+adipose+tissue.">Chromatin immunoprecipitation improvements for the processing of small frozen pieces of adipose tissue.</a> PLoS One. 13 (2), 0192314 (2018).</li><li>Savic, D., Gertz, J., Jain, P., Cooper, G. M., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+genome-wide+transcription+factor+binding+sites+in+frozen+tissues.">Mapping genome-wide transcription factor binding sites in frozen tissues.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 30 (2013).</li><li>Perna, A., Alberi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TF-ChIP+method+for+tissue-specific+gene+targets.">TF-ChIP method for tissue-specific gene targets.</a> Frontiers Cell Neuroscience. 13, 95 (2019).</li><li>Allweiss, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+primary+human+hepatocytes+and+prevention+of+hepatitis+B+virus+reinfection+efficiently+deplete+nuclear+cccDNA+in+vivo.">Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo.</a> Gut. 67 (3), 542-552 (2018).</li><li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data.">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (4), 349-357 (2016).</li><li>Perna, A., Alberi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TF-ChIP+Method+for+Tissue-Specific+Gene+Targets.">TF-ChIP Method for Tissue-Specific Gene Targets.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 95 (2019).</li><li>Liang, N., Fan, R., Goni, S., Treuter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Frozen+Liver+Tissues+for+Integrated+Omics+Analysis.">Preparation of Frozen Liver Tissues for Integrated Omics Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1951, 167-178 (2019).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+network+analysis+of+human+serum+albuminome+by+integrated+use+of+quick+crosslinking+and+two-step+precipitation.">Proteomic and network analysis of human serum albuminome by integrated use of quick crosslinking and two-step precipitation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9856 (2017).</li><li>Singh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ChIP-seq+method+facilitates+transcription+factor+profiling+in+human+tumors.">Optimized ChIP-seq method facilitates transcription factor profiling in human tumors.</a> Life Science Alliance. 2 (1), 201800115 (2019).</li><li>Aoki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-functional+cross-linking+reagents+efficiently+capture+protein-DNA+complexes+in+Drosophila+embryos.">Bi-functional cross-linking reagents efficiently capture protein-DNA complexes in Drosophila embryos.</a> Fly. 8 (1), 43-51 (2014).</li><li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+in+vitro+and+in+vivo+models+for+the+study+of+human+hepatitis+B+virus+infection.">Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection.</a> Journal of Hepatology. 64, 17-31 (2016).</li><li>Krishna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+anatomy+of+the+liver.">Microscopic anatomy of the liver.</a> Clinics in Liver Disease. 2, 4-7 (2013).</li><li>Tannapfel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+diagnosis+of+non-alcoholic+and+alcoholic+fatty+liver+disease.">Histopathological diagnosis of non-alcoholic and alcoholic fatty liver disease.</a> Virchows Archiv. 458 (5), 511-523 (2011).</li><li>Schuppan, D., Afdhal, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cirrhosis.">Liver cirrhosis.</a> Lancet. 371 (9615), 838-851 (2008).</li><li>Allweiss, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+shutdown+of+HBV+transcripts+promotes+reappearance+of+the+SMC5/6+complex+and+silencing+of+the+viral+genome+in+vivo.">Therapeutic shutdown of HBV transcripts promotes reappearance of the SMC5/6 complex and silencing of the viral genome in vivo.</a> Gut. , 322571 (2021).</li><li>Gerna, G., Kabanova, A., Lilleri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+cell+tropism+and+host+cell+receptors.">Human cytomegalovirus cell tropism and host cell receptors.</a> Vaccines. 7 (3), (2019).</li><li>Echavarria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviruses+in+immunocompromised+hosts.">Adenoviruses in immunocompromised hosts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 704-715 (2008).</li><li>Frohlich, J., Grundhoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+in+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+infection+and+associated+disease.">Epigenetic control in Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection and associated disease.</a> Seminars in Immunopathology. 42 (2), 143-157 (2020).</li><li>Nicoll, M. P., Proenca, J. T., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+herpes+simplex+virus+latency.">The molecular basis of herpes simplex virus latency.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 684-705 (2012).</li><li>Thorley-Lawson, D. A., Hawkins, J. B., Tracy, S. I., Shapiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+Epstein-Barr+virus+persistent+infection.">The pathogenesis of Epstein-Barr virus persistent infection.</a> Current Opinion in Virology. 3 (3), 227-232 (2013).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

لا يزال تحضير الكروماتين من الأنسجة المجمدة المفاجئة يمثل تحديا بسبب عدد الخطوات التي تحتاج إلى تحسين من أجل تحقيق نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. تتطلب معظم البروتوكولات المنشورة بالفعل16،23 فرم الأنسجة قبل التفكك اليدوي (الغسل). حاولنا تجنب الخطوات التي يمكن أن تؤدي إلى تدهور البروتين قبل تثبيت العينة قدر الإمكان. تستخدم خطوة السحق بالفعل في مستحضرات الكبد المجمدة24 وتجعل التفكك اليدوي أسهل وقابل للتكرار (انظر الشكل 2 أ). باستخدام ملاط مصمم خصيصا لأنابيب 1.5 مل (انظر البروتوكولات) ، يتم تقليل فقدان العينة أثناء عملية السحق ، مما يسمح بمعالجة كميات صغيرة من الأنسجة مثل عينات خزعة الكبد. من حيث المبدأ ، من الممكن استخدام تجانس الأنسجة المباشر دون أي خطوات طحن ؛ ومع ذلك ، فإن تجانس الأنسجة دون سحق سابق له قابلية استنساخ أسوأ في تجربتنا وكان ظهور مشاكل للتطبيقات النهائية أعلى (البيانات غير معروضة).
معظم المشاكل التي يواجهها تحضير الكروماتين من الأنسجة مستمدة من طبيعة هذه العينات وعدم القدرة على التحقق بشكل صحيح مما إذا كانت مجموعات الخلايا صغيرة بما يكفي للتثبيت دون فقدان الجودة. علاوة على ذلك ، فإن التحقق من كل حصة في كل خطوة سيستغرق وقتا طويلا مما يزيد من فرصة تدهور البروتين.
التثبيت (الخطوة 3.9) هو جزء أساسي وحاسم من إعداد الكروماتين. نظرا لطبيعة الأنسجة ، تأخرت خطوة التثبيت حتى يتم تجانس الأنسجة. تتميز خطوة التثبيت المؤجلة هذه بميزة إنتاج تعليق خلية أكثر تجانسا. ومع ذلك ، فإننا ندرك أنه في حالة الأهداف الحساسة للتلاعب بشكل خاص ، قد يكون من الضروري إجراء التثبيت قبل الخطوة 3.6 مباشرة. هذا من شأنه أن يساعد في حماية البروتينات الحساسة للغاية أو PTMs ، على الرغم من أنه قد يزيد من حجم مجموعات الخلايا ، والتي عند تثبيتها قد تؤدي إلى قص غير متجانس. تركيز محلول FA المستخدم في البروتوكول قياسي ، ومع ذلك ، يمكن تعديله لمحاولة تحسين التثبيت العام. يعكس وقت التثبيت المختار هنا أيضا الظروف القياسية الشائعة الاستخدام في هذا المجال. في حالة التركيز العالي لمحلول التثبيت ، يمكن تقليل وقت التثبيت ، بينما في حالة وجود كمية أقل يجب زيادته. يجب على المشغل أن يأخذ في الاعتبار أن تغيير وقت التثبيت قد يؤدي إما إلى الإفراط في تثبيت العينة أو إفساح المجال لتحلل البروتين. في حالة استهداف ترسيب المجمعات الكبيرة (أو جزء منها) و TFs ، سيكون من المفيد إجراء تثبيت مزدوج الخطوة باستخدام حل DSG متبوعا ب FAواحد 25,26. DSG في هذه الحالة من شأنه أن يثبت تفاعلات البروتين والبروتين ، بينما يعمل الفورمالديهايد في الغالب على تفاعلات الحمض النووي والبروتينالمباشرة 27.
يجب على المشغل أن يأخذ في الاعتبار إمكانية تنفيذ مجموعة قائمة على العمود لتنقية الحمض النووي بدءا من الخطوة 6.7 وهي أسرع ولا تستخدم مركبات سامة. ومع ذلك ، سيكون هناك دائما قدر معين من الحمض النووي غير المرتبط الذي سيتم فقده. لهذا السبب ، نقترح استخدام استخلاص الفينول كلوروفورم الكلاسيكي متبوعا بترسيب EtOH. علاوة على ذلك ، قبل تشغيل هلام الأغاروز (الخطوة 7.2) ، قد يكون من المفيد قياس تركيز الحمض النووي وتحميل نفس الكمية لكل بئر للحصول على صورة أوضح.
ينبع أحد قيود هذا البروتوكول من حقيقة أننا استكشفنا هذا البروتوكول واستخدمناه فقط باستخدام عينات الكبد المشتقة من الفئران الخيمرية بين الإنسانوالكبد 28. في حد ذاته يتكون الكبد من النسيج الظهاري والضام29. في حالة المرض ، قد تكون الأنسجة الليفية والأنسجة الدهنية موجودة30,31 مما يخلق تحديات إضافية أثناء اضطراب الأنسجة. ومع ذلك ، فإننا ندرك أنه لا يجوز استخدام بروتوكولنا على العظام والعضلات والأنسجة الدهنية دون تحسين خطوات التفكك والصوتنة. تجدر الإشارة إلى أن كل نسيج يتطلب نوعا من التحسين بسبب عدم وجود بروتوكول مناسب لهم جميعا مثل عينات زراعة الخلايا15. ومع ذلك ، نعتقد أنه مع القليل من التحسين أو عدم التحسين على الإطلاق ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على الأنسجة الأخرى التي تشترك في أوجه التشابه مع الكبد في التكوين ، مثل الرئة أو الأمعاء أو المعدة أو البنكرياس أو أنسجة الكلى.
كما تم استخدام بروتوكولنا بنجاح لتحليل TFs وتعديلات الهستون على إبسوم الحمض النووي المغلق تساهميا HBV (cccDNA) 32. هذا يفتح الفرصة لتطبيق مثل هذا النهج على الجينومات الفيروسية الأخرى التي تؤثر على الكبد مثل الفيروس المضخم للخلاياالبشرية 33 (hCMV) والفيروسات الغدية البشرية34 (HAdV). لا يستبعد أنه سيكون من الممكن تحليل فيروسات الحمض النووي الأخرى التي تنشئ عدوى مستمرة في الأنسجة الأخرى مثل فيروس الهربس كابوسي ساركوما35 (KHSV) ، فيروس الهربس البسيط 36 (HSV1 / 2) فيروسات الورم ، فيروس إبشتاين بار37 (EBV).

منذ اكتشافه ، اكتسب التنظيم اللاجيني في خلايا الثدييات اعترافا متزايدا1 ، مع الأخذ في الاعتبار أن فهم مثل هذه الآليات سيوفر رؤى رئيسية ليس فقط في بيولوجيا الخلية ، ولكن أيضا في بيولوجيا المرض والأورام. علاوة على ذلك ، قد تسبب العوامل المعدية أيضا تغيرات جينية للمضيف2 في حين أن آلية الخلية المضيفة قد تؤثر أيضا على كروماتين مسببات الأمراض ، مثل فيروسات الحمض النووي المستمرة 3,4. يبدو أن هذا التفاعل بين المضيف والممرض يلعب دورا في استمرار العدوى. 2
من خلال الارتباط الانعكاسي مع الحمض النووي (DNA)، تشكل بروتينات الهستون مركبا يسمى النيوكليوسوم. تصل النيوكليوسومات بدورها إلى مستوى أعلى من التنظيم يعرف باسم الكروماتين. من المعروف أن إعادة تشكيل الكروماتين تنظم التعبير الجيني بإحكام ، وتمنح أو تمنع الوصول إلى عوامل النسخ (TFs)5. يمكن لهذه العوامل إما أن تؤدي أو تمنع تجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي II (PolII) على محفزات الجينات ، مما يؤثر على تخليق mRNA من قالب الحمض النووي6. تحتوي بروتينات هيستون على ذيول7 ، تحيط بطرفي طية هيستون ، والتي يمكن أن تخضع لتعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) ، مما يسمح بتنظيم محكم للنسخ الجيني عن طريق تغييرات الكروماتين الهيكلية. تقع معظم PTMs هيستون في نهاية الذيل N ، مع كون الأستلة والمثيلة أفضل PTMs المدروسة ، على الرغم من أن الفسفرة8 و ubiquitination9 و ribosylation10 قد تم الإبلاغ عنها أيضا. يعد توصيف هذه البروتينات ودراستها أمرا ضروريا للحصول على نظرة عميقة حول تنظيم الجينات.
يوجد حاليا عدد قليل من الأساليب والأدوات الراسخة المتاحة لدراسة التفاعلات المباشرة بين الحمض النووي والبروتين: مقايسة تحول الحركة الكهربائية (EMSA) ، ومقايسة الخميرة الهجينة الواحدة (Y1H) وبصمة الحمض النووي11. ومع ذلك ، تركز هذه الطرق في حد ذاتها على تفاعلات بروتين الحمض النووي الفردية ولا تنطبق على الدراسات على مستوى الجينوم. ومن القيود الأخرى على هذه التقنيات عدم وجود ارتباط هيستون مع أجزاء الحمض النووي التي تم فحصها. وبالتالي ، لا يقصد بهذه الأساليب أن تعكس تعقيد آلية النسخ في الجسم الحي ولا تأخذ في الاعتبار التغيرات الهيكلية المهمة12 أو غيرها من الإنزيمات / العوامل المساعدة المطلوبة13 التي يمكن أن تؤثر (إما تعزيز أو تثبيط) ارتباط البروتين بالحمض النووي.
فكرة أن تثبيت الخلايا بعوامل مثل الفورمالديهايد (FA) يمكن أن يوفر لقطة في الجسم الحي لتفاعلات البروتين والحمض النووي ، خلقت الأساس لتطوير مقايسات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) 14. هذا ، إلى جانب توافر تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) والأجسام المضادة المحددة للغاية ، سمح بتطوير مقايسات ChIP-qPCR. في وقت لاحق ، فإن ظهور تقنيات التسلسل من الجيل التالي (NGS) ، التي أصبحت تكاليفها ميسورة التكلفة ، وافق على إقران تجارب ChIP مع مناهج NGS (ChIP-seq) ، وبالتالي تزويد الباحثين بأدوات قوية جديدة تمكن من التحقيق في تنظيم الكروماتين. في هذه المقايسات ، يتم تثبيت الخلايا المعزولة أو المستزرعة باستخدام غلوتارات ديسوسينيميديل (DSG) و / أو FA ، ويتم عزل النوى ، ثم يتم تجزئة الكروماتين وترسيبه بواسطة الجسم المضاد محل الاهتمام. بعد ذلك ، يتم تنقية الحمض النووي وتحليله بواسطة طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل أو NGS. على عكس EMSA و Y1H وبصمة الحمض النووي ، فإن فحوصات ChIP لديها القدرة على توفير لقطة عالمية لتفاعل البروتين والحمض النووي داخل الخلية. وهذا يوفر المرونة ويسمح بتحليل مواقع متعددة داخل نفس العينة. ومع ذلك ، نظرا لطبيعة الفحص ، قد يكتشف ChIP ، في النهاية ، ليس فقط التفاعلات المباشرة ، ولكن أيضا التفاعلات غير المباشرة ، ولا يقدم دقة الطرق المذكورة أعلاه ، عند الاهتمام بالتفاعلات المباشرة بين البروتين والحمض النووي.
بروتوكولات تحضير الكروماتين من مادة زراعة الخلايا راسخة15 وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة ، مما يسمح للمستخدم بالحصول على الكروماتين المناسب لكل من نهج qPCR و NGS في 1-2 أيام عمل. ومع ذلك ، فإن الحصول على كروماتين عالي الجودة من الأنسجة الكاملة لا يزال يمثل تحديا بسبب الحاجة إلى فصل الخلايا داخل الأنسجة مع تحقيق التثبيت الأمثل وقص الكروماتين. بالإضافة إلى ذلك ، يختلف تكوين ومورفولوجيا نوع متميز من الأنسجة ، مما يتطلب تعديل البروتوكولات الحالية16,17. يمثل استخدام الأنسجة المحفوظة بالتبريد تحديات إضافية مقارنة بالعينات الطازجة. ويرجع ذلك إلى صعوبة الحصول على تعليق خلية واحدة دون خسارة مادية واسعة النطاق. هذا يؤدي إلى القص غير السليم ، مما يعيق التطبيقات النهائية. ومع ذلك ، فإن الوصول إلى عينات الأنسجة المجمدة بدلا من نظيرتها الجديدة لا يزيد من مرونة العمل فحسب ، بل قد يمثل أيضا الخيار الوحيد للباحثين الذين يعملون مع العينات التي تنشأ من الدراسات الطولية أو المقارنة. تم نشر حفنة من بروتوكولات تحضير الكروماتين للأنسجة المجمدة. تعتمد هذه في الغالب على ذوبان العينة متبوعا بالفرم أو التفكك اليدوي / الآلي أو خطوات سحق النيتروجين السائل18،19،20.
هنا نصف طريقة تحضير الكروماتينالمحسنة 15 لعينات الكبد المجمدة غير الثابتة ، والتي تجمع بين سحق الأنسجة في النيتروجين السائل مع تجانس المدقة ، لتحقيق قص كروماتين قابل للتكرار مناسب لنهج X-ChIP التي تهدف إلى تحليل كل من الجينوم الفيروسي والمضيف.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m sterile syringe filter</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7699822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safeseal tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>7,27,06,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x orange loading dye</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor NGS</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade or Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deacetylase Inhibitor</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>37494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>DWK885300-0001-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 500 mM solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218</td>
			<td>Concentration 10mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>2273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Concentration: 20mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen cooled mini mortar</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H37260-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH free Formaldehyde 16%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc&#160;SC-Protease-Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>11429868001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel - Heavy</td>
			<td>QuantaBio</td>
			<td>2302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MPRK092</td>
			<td>Concentration: 50 &#181;g/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MRNA092</td>
			<td>Concentration: 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10% solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate anhydrous</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83,39,02,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>T2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin extraction from frozen chimeric liver tissue for chromatin immunoprecipitation analysis

الترسيب المناعي للكروماتين المتشابك (X-ChIP) هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لتقييم مستويات علامات الهستون وإشغال عوامل النسخ على الكروماتين المضيف و / أو الممرض. يخلق تحضير الكروماتين من الأنسجة تحديات إضافية يجب التغلب عليها للحصول على بروتوكولات قابلة للتكرار وموثوقة مماثلة لتلك المستخدمة في زراعة الخلايا. يعد تعطيل الأنسجة وتثبيتها من الخطوات الحاسمة لتحقيق القص الفعال للكروماتين. قد يتطلب التعايش بين أنواع ومجموعات مختلفة من الخلايا أيضا أوقات قص مختلفة للوصول إلى الحجم الأمثل للشظية ويعيق قابلية تكرار القص. الغرض من هذه الطريقة هو تحقيق مستحضرات كروماتين مضيف موثوقة وقابلة للتكرار من الأنسجة المجمدة (الكبد) مناسبة لكل من تطبيقات ChIP-qPCR وتسلسل الجيل التالي (NGS). لاحظنا أن الجمع بين سحق أنسجة النيتروجين السائل متبوعا بالتجانس يؤدي إلى زيادة قابلية التكاثر مقارنة بالتجانس فقط ، لأنه يوفر تعليقا يتكون في الغالب من خلايا مفردة منفصلة يمكن قصها بكفاءة. علاوة على ذلك ، يجب إجراء خطوة التثبيت تحت دوران معتدل لتوفير تشابك متجانس. ثم تكون المادة الثابتة مناسبة لعزل النوى القائمة على المخزن المؤقت ، لتقليل تلوث البروتين السيتوبلازمي والحمض النووي الممرض والحمض النووي الريبي (عند الاقتضاء) ، وتجنب تدرجات الطرد المركزي التي تستغرق وقتا طويلا. ستكمل الصوتنة اللاحقة التحلل النووي وقص الكروماتين ، مما ينتج عنه نطاق حجم محدد وفقا لظروف القص المختارة. يجب أن يتراوح نطاق الحجم بين 100 و 300 nt لتطبيقات NGS ، بينما يمكن أن يكون أعلى (300-700 nt) لتحليل ChIP-qPCR. يمكن لمثل هذه التعديلات البروتوكولية أن تحسن بشكل كبير تحليلات الكروماتين من عينات الأنسجة المجمدة.

يعد تحضير الكروماتين خطوة حاسمة في تحقيق ChIP ناجح. من أجل تحضير كروماتين عالي الجودة من العينات المجمدة ، يجب أن نضمن تعطيل الأنسجة بكفاءة قبل التثبيت لتجنب وجود كتل الأنسجة التي يمكن أن تعيق القص الفعال. يوضح الشكل 1 مسارا موجزا للبروتوكول. لا يكفي السحق وحده لفصل الأنسجة تماما لأنه ينتج مجموعات خلايا متغيرة الحجم وعدد قليل من الخلايا المفردة (الشكل 1 أ). بربط خطوة السحق الأولى بتجانس Dounce ، يتم تقليل كمية كتل الأنسجة بشدة والباقي أصغر (الشكل 1 ب). بعد خطوات التثبيت والتحلل ، يزداد عدد النوى المفردة المرئية (الشكل 1 ج) ، بينما يفقد المظهر الكروي النموذجي. بعد صوتنة لمدة 28 دورة ، تلطيخ النووي (Hoechst 33258 / DAPI) هو في الغالب غير مرئي بعد الآن. هذه بالفعل علامة على نجاح القص (الشكل 1 د). بعد فك تشابك قسامة الكروماتين وتصور الحمض النووي على هلام الأغاروز ، يمكن التعرف على القص الناجح من خلال وجود شظايا في حدود 100-300 bp. (الشكل 2 أ) يمكن أن تختلف كمية الحمض النووي وفقا لتكوين قطعة الأنسجة المعدة. يمكن استخدام هذا الكروماتين بنجاح ل ChIP-qPCR. كما هو موضح في الشكل 2 ب ، يمكن ترسيب الكروماتين بنجاح باستخدام الأجسام المضادة H3K4me3 و H3K27ac (التعديلات المرتبطة بالجينات النشطة) و H3K27me3 (التعديل المرتبط بالجينات الصامتة). نتج عن مناطق تعزيز إطار القراءة المفتوح للكروموسوم 1 43 (C1orf43) والوحدة الفرعية للبروتيازوم 20S Beta 2 (PSMB2) ومناطق تعزيز نازعة هيدروجين الجلسرين ألدهيد 3 فوسفات (mGapdh) إثراء H3K4me3 و H3K27ac مقارنة ب Homeobox C13 (HOXC13) و Homeobox C12 (HOXC12) ومناطق تعزيز عامل نسخ المايلين 1 (mMyt1) (الجدول 1). وذلك لأن C1orf43 و PSMB2 و mGapdh يتم نسخها بشكل أساسي في الكبد ، بينما يتم إسكات HOXC13 و HOXC12 و mMyt1. يظهر H3K27me3 السلوك المعاكس الذي يؤكد نجاح مقايسة ChIP. حقيقة أن كبد هذه الفئران هو وهم ، سمح لنا بتحليل كل من الفئران والكروماتين البشري. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام نفس الكروماتين بنجاح في تجارب ChIP-seq. بعد خطوة التسلسل ، تمت محاذاة القراءات إلى فهرس يتكون من كل من الفئران والجينومات البشرية لتقليل كمية الأجزاء غير المحاذية. بعد ذلك ، يتم فصل القراءات وفقا للأنواع وتحليلها بشكل أكبر باستخدام EaSeq22 . ثم تم قياس شدة الإشارة في موقع بدء النسخ (TSS) لكل جين وتم فرز النتيجة لشدة إشارة H3K4me3. يوضح الشكل 3 أ والشكل 3 ج وجودا ملحوظا ل H3K4me3 و H3K27ac في TSS لجزء كبير من الجينات داخل كل من الكروماتين الفأر والإنسان. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط مضاد H3K27me3 ب H3K4me3 / H3K27ac. H3K27me3 موجود على كامل طول الجين وليس فقط في TSS ، كما هو متوقع من PTM هذا. يوضح الشكل 3 ب والشكل3 د مجموعة HOXC / HoxC المعروفة بتخصيبها ل H3K27me3 وغير نشطة نسخيا في كل من كبد الفئران والإنسان. يظهر تنميط H3K4me3 و H3K27ac قمم هذين PTMs بينما تميل شدة إشارة H3K27me3 إلى أن تكون أقل وأكثر توزيعا.
نظرا لتعقيد تحضير الكروماتين ، قد يحدث التثبيت الزائد ، وقد يكون وقت التحلل أو الصوتنة دون المستوى الأمثل ، وقد تستمر كتل الخلايا الكبيرة ، أو قد تكون المعالجة غير الكافية للعينة غير كافية. هذه كلها أحداث تؤثر على جودة التحضير. في بعض الحالات ، سيظل إثراء شظايا الكروماتين ضمن الحجم الصحيح موجودا أو سيتم نقله إلى حجم أعلى. في حالات أخرى ، قد يكون هناك فقدان للمواد بسبب التحلل المبكر أو القص غير الناجح. يوضح الشكل 4 بعض الأمثلة على هذه النتائج السلبية ودون المستوى الأمثل. يظهر الحارة 3 و 4 إثراء حجم الشظية بين 200 نقطة أساس و 800 نقطة أساس. ومع ذلك ، فمن الواضح أن حجم الشظية يمتد من 100 نقطة أساس إلى 10000 برميل >. في الحارة 5 و 6 ، يوجد تخصيب في نطاق 100-250 نقطة أساس مع فقدان واضح للمواد أثناء التحضير. هذا يمكن أن يفسر لماذا أنتجت صوتنة شظايا أصغر. يظهر الحارة 7 إعدادا دون المستوى الأمثل قليلا مع زيادة نطاق الشظايا ، بينما يظهر الحارة 8 فقدانا شبه كامل للمواد. يمكن أن يحدث هذا بسبب التحلل النووي المبكر أو تفكك الأنسجة غير الكافي مع ما يترتب على ذلك من فقدان بعد الخطوة 5.5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول تحضير الكروماتين. تم التقاط الصور بعد سحق الأنسجة (أ) ، والتجانس اليدوي الإضافي (ب) ، وبعد التحلل النووي (ج) وبعد الصوتنة (قبل الطرد المركزي) (د). تم إجراء تلطيخ نووي باستخدام Hoechst 33258 / DAPI. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig02.jpg"> الشكل 2: قص الكروماتين التمثيلي ، وتقييم جودته بواسطة ChIP-qPCR. 1٪ هلام الأغاروز مع عينات الكروماتين المجزأة وفقا لبروتوكولات من مستحضرات الكروماتين المختلفة. تتم إضافة عنصر تحكم في الكروماتين غير المصقول لضمان عدم تدهور الكروماتين / الحمض النووي مسبقا (أ). تم اختبار الكروماتين المقطوع للتأكد من جودته في إجراء فحص ChIP-qPCR. تم استخدام الأجسام المضادة H3K4me3 و H3K27ac و H3K27me3 لترسيب الكروماتين الطازج. (ب) أجري تحليل qPCR على المروجين النشطين البشريين (C1orf43 و PSMB2) والفئران (Gapdh) والمروجين غير النشطين البشريين (HOXC13 و HOXC12) والفئران (Myt1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig03.jpg"> الشكل 3: تحليل ChIP-seq التمثيلي. تمت محاذاة القراءات مع مؤشر تم إنشاؤه باستخدام كل من جينومات الإنسان والفأر (hg19 و mm10). بعد المحاذاة ، تم فصل القراءات البشرية والفئران وتحليلها بشكل أكبر. خريطة حرارية للجينات البشرية حيث تم قياس الإشارة في TSS وأظهرت بترتيب تنازلي لشدة H3K4me3 (a). مثال على مجموعة الجينات البشرية للجينات المكبوتة (مجموعة HOX) المحاطة بجينات نشطة (ب). خريطة حرارية لجينات الفئران حيث تم قياس الإشارة عند TSS وعرضها بترتيب تنازلي لشدة H3K4me3 (c). مثال على مجموعة جينات الفئران من الجينات المكبوتة (مجموعة Hox) المحاطة بجينات نشطة (د). تم تطبيع جميع البيانات المعروضة بواسطة EaSeq لكل مليون قراءة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig04.jpg"> الشكل 4: مستحضرات الكروماتين دون المستوى الأمثل والفاشلة. 1٪ جل أغاروز مع عينات كروماتين مجزأة وفقا للبروتوكول. يحتوي الشكل على كروماتين غير مقطوع يستخدم كعنصر تحكم (الحارة 2) ، وليس القص الأمثل (الحارة 3-4) ، والقص الأمثل مع فقدان المواد الواضح (الحارة 5-6) ، والقص دون المستوى الأمثل (الحارة 7) وفقدان المواد على نطاق واسع (الحارة 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>اسم التمهيدي</td>
			<td></td>
			<td>تسلسل</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">C1orf43 المروج</td>
			<td>أمامي</td>
			<td>AGTGGGTGGAGAATGCAGAC</td>
		</tr><tr><td>عكس</td>
			<td>غاغاتاككاكاتك</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">مروج PSMB2</td>
			<td>أمامي</td>
			<td>CTTATTCAACCCCCGACAAA</td>
		</tr><tr><td>عكس</td>
			<td>GATGAAGGACGGTGAGAGGA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">HOXC13 المروج البعيد</td>
			<td>أمامي</td>
			<td>GAGCCCGAGATTCACTCAAC</td>
		</tr><tr><td>عكس</td>
			<td>TTATGCCCAGTTTTGGGGTA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">HOXC12 المروج البعيد</td>
			<td>أمامي</td>
			<td>AAAGCTTCCCACTGCAAAGA</td>
		</tr><tr><td>عكس</td>
			<td>AAATCTGGGGGCGAACTACT</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">مروج mGAPDH</td>
			<td>أمامي</td>
			<td>GGTCCAAAGAGAGGAGAG</td>
		</tr><tr><td>عكس</td>
			<td>GCCCTGCTTATCCAGTCCTA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">مروج mMYT</td>
			<td>أمامي</td>
			<td>CAGCCCAATTCTAGCCACAT</td>
		</tr><tr><td>عكس</td>
			<td>CCAAAGCAGGGGAGTAGGAG</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: قائمة بادئات qPCR للجينات النشطة وغير النشطة المستخدمة في فحوصات ChIP-qPCR.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis at JoVE.com

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

يركز هذا البروتوكول على تحضير الكروماتين من الأنسجة المجمدة المفاجئة وهو مناسب لترسب الكروماتين المناعي المتشابك (X-ChIP) متبوعا إما بتحليل PCR الكمي (X-ChIP-qPCR) أو نهج تسلسل الجيل التالي (X-ChIP-seq).

استخراج الكروماتين من أنسجة الكبد الخيمرية المجمدة لتحليل الترسيب المناعي للكروماتين

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

ينتج عن هذا البروتوكول استخراج كروماتين قابل للتكرار وموثوق به من عينات الكبد المجمدة لتجارب الترسيب المناعي للكروماتين. للبدء ، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة المجمدة في الهاون ، واتركه هناك لمدة خمس دقائق. ثم اضغط على العينة باستخدام مدقة مبردة مسبقا حتى لا يكون هناك المزيد من الفتات الصلبة.قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على العينة من الهاون. أضف 950 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد مع المثبطات المطلوبة ، وماصة لأعلى ولأسفل برفق حتى يتم إعادة العينة بالكامل. انقل تعليق الأنسجة على الفور إلى الخالط ، وقم بتطبيق 20 إلى 30 ضربة باستخدام Pestle A للحصول على تعليق أدق.تجنب تحريك المدقة خارج الطور السائل لمنع الرغوة. انقل التجانس إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر تم تبريده مسبقا على الجليد. ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق عند 1،300 غرام وأربع درجات مئوية.قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات تماما في 950 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة PBS عن طريق السحب اللطيف. ثم أضف 63.6 ميكرولتر من الفورمالديهايد الخالي من الميثانول بنسبة 16٪ للحصول على تركيز نهائي قدره 1٪قم بتدوير الأنبوب على الفور لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران ، أضف 113 ميكرولترا من 1.25 مولار جليكاين في درجة حرارة الغرفة للحصول على تركيز نهائي 125 مللي مولار ، وقم بتدوير الأنبوب لمدة خمس دقائق أخرى.ثم طرد مركزي العينة عند 1،300 جم لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات بعناية عن طريق سحب 950 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد مع المثبطات المطلوبة. قم بطرد العينة مرة أخرى وأعد تعليق الحبيبات كما هو موضح سابقا.كرر خطوة الطرد المركزي مرة أخرى وانتقل فورا إلى إجراء عزل الكروماتين. أضف 950 ميكرولتر من Buffer A مع المثبطات المطلوبة إلى الحبيبات واخلطها برفق عن طريق السحب حتى يتم إعادة استخدام الحبيبات تماما. ثم قم بتدوير الأنبوب لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.بعد الدوران ، قم بطرد العينة عند 2،000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. أضف 950 ميكرولترا من Buffer B مع المثبطات المطلوبة إلى الحبيبات واخلطها برفق عن طريق السحب حتى يتم إعادة تنشيط الحبيبات تماما. ثم قم بتدوير الأنبوب لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.بعد الدوران ، أجهزة الطرد المركزي العينة مرة أخرى. إزالة الطاف. ثم أضف 300 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة Buffer C مع المثبطات المطلوبة إلى الحبيبات والماصة بقوة.دوامة العينة لمدة 15 إلى 30 ثانية. ثم قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لجمع القطرات على الغطاء. بعد صوتنة عينة الكروماتين ، أضف 30 ميكرولترا من محلول Triton X-100 بنسبة 10٪ والدوامة لمدة خمس إلى 10 ثوان.أجهزة الطرد المركزي العينة في 16،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. وانقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 ملليلتر مبرد مسبقا على الجليد. انقل 10 إلى 25 ميكرولترا من الكروماتين المنفصم إلى أنبوب جديد ، وأضف Buffer C للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر.تجمد القسمة والصدمة بقية الكروماتين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. أضف ثمانية ميكرولترات من خمسة مولار كلوريد الصوديوم واحتضانها لمدة ست ساعات على الأقل عند 65 درجة مئوية في كتلة التسخين أثناء الاهتزاز عند 1،000 دورة في الدقيقة. تمديد الحضانة بين عشية وضحاها إن أمكن.بعد ترك العينات تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، أضف ميكرولتر من RNase A واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية أثناء الرج عند 1000 دورة في الدقيقة. قم بإزالة العينات من كتلة التسخين وأضف سبعة ميكرولترات من 300 مليمول كلوريد الكالسيوم واثنين ميكرولتر من البروتيناز K.احتضان العينات في كتلة التسخين عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أثناء الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد أنبوب فصل أحادي الطور لكل عينة عن طريق الطرد المركزي لها إلى 16،000 جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية.بعد إزالة الأنابيب من كتلة التسخين والسماح لها بالتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق ، انقل 400 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب فصل الطور الذي تم طرده مسبقا. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من محلول كحول أيزو أميل الفينول كلوروفورم ، ودوامة لمدة خمس ثوان. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 16،000 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.ثم أضف 400 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة لمدة خمس ثوان. طرد مركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق أخرى ونقل 400 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر يحتوي على 24 ميكرولتر من خمسة مولار كلوريد الصوديوم و 0.75 ميكرولتر جليكوجين. ثم لفترة وجيزة دوامة الأنبوب.أضف 1،055 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. ثم دوامة جيدا واحتضان العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة أو عند 20 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل. بعد اكتمال الحضانة ، قم بطرد العينة عند 16،000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعناية دون خلع الحبيبات.أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد 70٪ وقم بإمالة الأنبوب برفق لضمان غسل الحبيبات. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 16،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بالكامل بعناية واترك الحبيبات تجف في درجة حرارة الغرفة.بدلا من ذلك ، احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لتجفيف أسرع. أضف 50 ميكرولترا من محلول Tris-EDTA وضع الأنبوب على كتلة التسخين لمدة خمس إلى 10 دقائق تحت الاهتزاز عند 300 دورة في الدقيقة. ثم تحليل الحمض النووي على هلام 1 ٪ أغاروز.بعد الربط المتقاطع للكروماتين وتصور الحمض النووي على هلام الأغاروز ، يمكن التعرف على القص الناجح من خلال وجود شظايا في حدود 100 إلى 300 زوج أساسي. تم ترسيب الكروماتين بنجاح باستخدام ثلاثي ميثيل H3K4 ، وأستلة H3K27 ، والأجسام المضادة ثلاثية الميثيل H3 K27 وتم تحليلها بشكل أكبر بواسطة qPCR. أظهر إطار القراءة المفتوح للكروموسوم الأول 43 ، والوحدة الفرعية للبروتيازوم 20S بيتا اثنين ، ومناطق تعزيز نازعة هيدروجين الجلسرين - 3 فوسفات التي يتم نسخها بنشاط في الكبد إثراء لثلاثي ميثيل H3K4 وأستلة H3K27.وبالمقارنة ، لم يتم إثراء Homeobox C13 و homeobox C12 ومناطق محفز عامل نسخ المايلين الأول للفأر التي يتم إسكاتها في الكبد كما هو متوقع. يظهر ثلاثي الميثيل H3 K27 السلوك المعاكس ، مما يؤكد نجاح الترسيب المناعي للكروماتين أو مقايسة ChIP. تم إخضاع الكروماتين بنجاح ل ChIP-Seq.بعد التسلسل ، تمت محاذاة القصب إلى فهرس معد مسبقا وفصلها وفقا للأنواع. ترسيب ثلاثي الميثيل H3K4 وترسب أستلة H3K27 في مواقع بدء النسخ الجيني معادية مع ترسب ثلاثي الميثيل H3K27 كما هو متوقع. من المعروف أن مجموعة Hox C غير نشطة نسخيا في كل من كبد الفئران والبشر.يظهر تنميط ثلاثي ميثيل H3K4 وأستلة H3K27 قمم لهذين التعديلين بعد الترجمة خارج المجموعة ، بينما تميل شدة إشارة ثلاثي ميثيل H3K27 إلى الزيادة داخل مجموعة الجينات. يتميز استخراج الكروماتين من عينات الأنسجة المجمدة بتنوع جوهري عال ، ويعتمد بشدة على دقة تعليق الخلية ودرجة الحرارة أثناء الربط المتقاطع. يساعد ضمان ظروف المختبر الثابتة في الحفاظ على قابلية استنساخ نطاق حجم الشظية.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

والفحص الكروماتين لأنسجة المخ الإنسان

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

مناعي لونين (CHIP) لتعديل هيستون الفحص الحيوي في التعبير الجيني في الخلايا البشرية المنشط

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

لونين مناعي (رقاقة) باستخدام ذبابة الفاكهة الأنسجة

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...