Name: chromatin extraction from frozen chimeric liver tissue for chromatin immunoprecipitation analysis
Uploaded: 2021-03-23T13:00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis at JoVE.com

Исследование было поддержано Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) грантом Мауры Дандри (SFB 841 A5) и землей Гамбург в рамках исследовательской программы (LFF-FV44: EPILOG).
Мы хотели бы поблагодарить доктора Тассило Фольца, Ивонн Ладигес и Аннику Вольмари за техническую помощь и критическое прочтение рукописи. Д-ру Томасу Гюнтеру и профессору Адаму Грундхоффу за предоставление очень полезных предложений и наборов праймеров для анализа ChIP-qPCR.

<ol>
	<li>Waddington, C. H., Pantelouris, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+nuclei+in+newt's+eggs.">Transplantation of nuclei in newt's eggs.</a> Nature. 172 (4388), 1050-1051 (1953).</li><li>Silmon de Monerri, N. C., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogens+hijack+the+epigenome:+A+new+twist+on+host-pathogen+interactions.">Pathogens hijack the epigenome: A new twist on host-pathogen interactions.</a> American Journal of Pathology. 184 (4), 897-911 (2014).</li><li>Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshots:+chromatin+control+of+viral+infection.">Snapshots: chromatin control of viral infection.</a> Virology. 435 (1), 141-156 (2013).</li><li>Tropberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+histone+modifications+in+episomal+HBV+cccDNA+uncovers+an+unusual+chromatin+organization+amenable+to+epigenetic+manipulation.">Mapping of histone modifications in episomal HBV cccDNA uncovers an unusual chromatin organization amenable to epigenetic manipulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 5715-5724 (2015).</li><li>Sproul, D., Gilbert, N., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chromatin+structure+in+regulating+the+expression+of+clustered+genes.">The role of chromatin structure in regulating the expression of clustered genes.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (10), 775-781 (2005).</li><li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+and+chromatin+cross-talk.">Histone and chromatin cross-talk.</a> Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 172-183 (2003).</li><li>Ling, X., Harkness, T. A., Schultz, M. C., Fisher-Adams, G., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+histone+H3+and+H4+amino+termini+are+important+for+nucleosome+assembly+in+vivo+and+in+vitro:+redundant+and+position-independent+functions+in+assembly+but+not+in+gene+regulation.">Yeast histone H3 and H4 amino termini are important for nucleosome assembly in vivo and in vitro: redundant and position-independent functions in assembly but not in gene regulation.</a> Genes &amp; Development. 10 (6), 686-699 (1996).</li><li>Zhang, L., Eugeni, E. E., Parthun, M. R., Freitas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+histone+post-translational+modifications+by+peptide+mass+fingerprinting.">Identification of novel histone post-translational modifications by peptide mass fingerprinting.</a> Chromosoma. 112 (2), 77-86 (2003).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing.">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431 (7010), 873-878 (2004).</li><li>Hassa, P. O., Haenni, S. S., Elser, M., Hottiger, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+ADP-ribosylation+reactions+in+mammalian+cells:+where+are+we+today+and+where+are+we+going.">Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 789-829 (2006).</li><li>Dey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">DNA-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 279-299 (2012).</li><li>Hager, G. L., McNally, J. G., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+dynamics.">Transcription dynamics.</a> Molecular Cell. 35 (6), 741-753 (2009).</li><li>Nagy, Z., Tora, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+GCN5/PCAF-containing+complexes+function+as+co-activators+and+are+involved+in+transcription+factor+and+global+histone+acetylation.">Distinct GCN5/PCAF-containing complexes function as co-activators and are involved in transcription factor and global histone acetylation.</a> Oncogene. 26 (37), 5341-5357 (2007).</li><li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde:+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene.">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li><li>Gunther, T., Theiss, J. M., Fischer, N., Grundhoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+viral+and+host+chromatin+by+ChIP-PCR+or+ChIP-Seq+analysis.">Investigation of viral and host chromatin by ChIP-PCR or ChIP-Seq analysis.</a> Current Protocols in Microbiology. 40, 11-21 (2016).</li><li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing.">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 419 (2015).</li><li>Haim, Y., Tarnovscki, T., Bashari, D., Rudich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+protocol+for+use+in+whole+human+adipose+tissue.">A chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for use in whole human adipose tissue.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (9), 1172-1177 (2013).</li><li>Castellano-Castillo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+improvements+for+the+processing+of+small+frozen+pieces+of+adipose+tissue.">Chromatin immunoprecipitation improvements for the processing of small frozen pieces of adipose tissue.</a> PLoS One. 13 (2), 0192314 (2018).</li><li>Savic, D., Gertz, J., Jain, P., Cooper, G. M., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+genome-wide+transcription+factor+binding+sites+in+frozen+tissues.">Mapping genome-wide transcription factor binding sites in frozen tissues.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 30 (2013).</li><li>Perna, A., Alberi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TF-ChIP+method+for+tissue-specific+gene+targets.">TF-ChIP method for tissue-specific gene targets.</a> Frontiers Cell Neuroscience. 13, 95 (2019).</li><li>Allweiss, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+primary+human+hepatocytes+and+prevention+of+hepatitis+B+virus+reinfection+efficiently+deplete+nuclear+cccDNA+in+vivo.">Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo.</a> Gut. 67 (3), 542-552 (2018).</li><li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data.">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 23 (4), 349-357 (2016).</li><li>Perna, A., Alberi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TF-ChIP+Method+for+Tissue-Specific+Gene+Targets.">TF-ChIP Method for Tissue-Specific Gene Targets.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 95 (2019).</li><li>Liang, N., Fan, R., Goni, S., Treuter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Frozen+Liver+Tissues+for+Integrated+Omics+Analysis.">Preparation of Frozen Liver Tissues for Integrated Omics Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1951, 167-178 (2019).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+network+analysis+of+human+serum+albuminome+by+integrated+use+of+quick+crosslinking+and+two-step+precipitation.">Proteomic and network analysis of human serum albuminome by integrated use of quick crosslinking and two-step precipitation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9856 (2017).</li><li>Singh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ChIP-seq+method+facilitates+transcription+factor+profiling+in+human+tumors.">Optimized ChIP-seq method facilitates transcription factor profiling in human tumors.</a> Life Science Alliance. 2 (1), 201800115 (2019).</li><li>Aoki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-functional+cross-linking+reagents+efficiently+capture+protein-DNA+complexes+in+Drosophila+embryos.">Bi-functional cross-linking reagents efficiently capture protein-DNA complexes in Drosophila embryos.</a> Fly. 8 (1), 43-51 (2014).</li><li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+in+vitro+and+in+vivo+models+for+the+study+of+human+hepatitis+B+virus+infection.">Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection.</a> Journal of Hepatology. 64, 17-31 (2016).</li><li>Krishna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+anatomy+of+the+liver.">Microscopic anatomy of the liver.</a> Clinics in Liver Disease. 2, 4-7 (2013).</li><li>Tannapfel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+diagnosis+of+non-alcoholic+and+alcoholic+fatty+liver+disease.">Histopathological diagnosis of non-alcoholic and alcoholic fatty liver disease.</a> Virchows Archiv. 458 (5), 511-523 (2011).</li><li>Schuppan, D., Afdhal, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cirrhosis.">Liver cirrhosis.</a> Lancet. 371 (9615), 838-851 (2008).</li><li>Allweiss, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+shutdown+of+HBV+transcripts+promotes+reappearance+of+the+SMC5/6+complex+and+silencing+of+the+viral+genome+in+vivo.">Therapeutic shutdown of HBV transcripts promotes reappearance of the SMC5/6 complex and silencing of the viral genome in vivo.</a> Gut. , 322571 (2021).</li><li>Gerna, G., Kabanova, A., Lilleri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+cell+tropism+and+host+cell+receptors.">Human cytomegalovirus cell tropism and host cell receptors.</a> Vaccines. 7 (3), (2019).</li><li>Echavarria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviruses+in+immunocompromised+hosts.">Adenoviruses in immunocompromised hosts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 704-715 (2008).</li><li>Frohlich, J., Grundhoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+in+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+infection+and+associated+disease.">Epigenetic control in Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection and associated disease.</a> Seminars in Immunopathology. 42 (2), 143-157 (2020).</li><li>Nicoll, M. P., Proenca, J. T., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+herpes+simplex+virus+latency.">The molecular basis of herpes simplex virus latency.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 684-705 (2012).</li><li>Thorley-Lawson, D. A., Hawkins, J. B., Tracy, S. I., Shapiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+Epstein-Barr+virus+persistent+infection.">The pathogenesis of Epstein-Barr virus persistent infection.</a> Current Opinion in Virology. 3 (3), 227-232 (2013).</li></ol>

Авторам раскрывать нечего.

Получение хроматина из замороженной ткани остается проблемой из-за количества этапов, которые необходимо оптимизировать для достижения воспроизводимых и надежных результатов. Большинство уже опубликованных протоколов16,23 требуют измельчения тканей перед ручной диссоциацией (дунтингом). Мы старались максимально избегать шагов, которые могли бы спровоцировать деградацию белка до фиксации образца. Стадия измельчения уже используется в замороженных препаратахпечени 24 и делает ручную диссоциацию более легкой и воспроизводимой (см. рис. 2а). При использовании раствора, специально разработанного для пробирок объемом 1,5 мл (см. Протоколы), потеря образца в процессе измельчения уменьшается, что позволяет обрабатывать небольшие количества ткани, такие как образцы биопсии печени. В принципе, можно использовать прямую гомогенизацию тканей без каких-либо этапов измельчения; Однако, по нашему опыту, гомогенизация тканей без предварительного измельчения имеет худшую воспроизводимость, и появление проблем для последующих применений было выше (данные не показаны).
Большинство проблем, возникающих при получении хроматина из тканей, связано с природой этих образцов и неспособностью должным образом проверить, достаточно ли малы клеточные кластеры для фиксации без потери качества. Более того, проверка каждой аликвоты на каждом этапе займет много времени, увеличивая вероятность деградации белка.
Фиксация (этап 3.9) является фундаментальной и важной частью подготовки хроматина. Из-за особенностей ткани этап фиксации был отложен до тех пор, пока ткань не будет гомогенизирована. Преимущество такой отложенной стадии фиксации заключается в получении более однородной клеточной суспензии. Тем не менее, мы признаем, что в случае особо чувствительных к манипуляциям целей может потребоваться выполнить фиксацию непосредственно перед шагом 3.6. Это поможет защитить чрезвычайно чувствительные белки или PTM, хотя это может увеличить размер клеточных кластеров, что при фиксации может привести к неоднородному сдвигу. Концентрация раствора ЖК, используемая в протоколе, является стандартной, однако ее можно модифицировать, чтобы попытаться улучшить общую фиксацию. Выбранное здесь время фиксации также отражает стандартные условия, обычно используемые в полевых условиях. В случае более высокой концентрации фиксирующего раствора время фиксации может быть уменьшено, а в случае меньшего количества его следует увеличить. Оператор должен учитывать, что изменение времени фиксации может либо привести к чрезмерной фиксации образца, либо создать место для деградации белка. В случае нацеливания на осаждение больших комплексов (или их части) и ТФ было бы целесообразно выполнить двухступенчатую фиксацию с использованием решения DSG с последующим FA25,26. DSG в этом случае стабилизирует белок-белковые взаимодействия, в то время как формальдегид действует в основном на прямые ДНК-белковые взаимодействия27.
Оператор должен учитывать возможность внедрения набора для очистки ДНК на основе колонки, начиная с шага 6.7, который является более быстрым и не использует токсичные соединения. Тем не менее, всегда будет определенное количество несвязанной ДНК, которая будет потеряна. По этой причине мы предлагаем использовать классическую фенол-хлороформную экстракцию с последующим осаждением EtOH. Кроме того, перед запуском агарозного геля (этап 7.2) может быть полезно измерить концентрацию ДНК и загрузить одинаковое количество для каждой лунки, чтобы иметь более четкую картину.
Ограничение этого протокола связано с тем, что мы исследовали и использовали этот протокол только с использованием образцов печени, полученных от химерных мышей28 печени человека. Сама по себе печень состоит из эпителиальной и соединительной ткани29. В случае заболевания может присутствовать фиброзная ткань и жировая ткань30,31, создавая дополнительные проблемы во время разрушения тканей. Тем не менее, мы признаем, что наш протокол не может быть использован на костной, мышечной и жировой ткани без оптимизации этапов диссоциации и обработки ультразвуком. Следует отметить, что каждая ткань требует некоторой оптимизации из-за отсутствия протокола, подходящего для всех из них, например, для образцовклеточных культур 15. Тем не менее, мы считаем, что с небольшой оптимизацией или вообще без нее этот протокол может быть успешно применен к другим тканям, которые имеют сходство с печенью по составу, таким как ткани легких, кишечника, желудка, поджелудочной железы или почек.
Наш протокол также был успешно использован для анализа TF и модификаций гистонов на ковалентно закрытой эписоме ДНК HBV (cccDNA)32. Это открывает возможность применить такой подход к другим вирусным геномам, влияющим на печень, таким как цитомегаловирус человека33 (hCMV) и аденовирусычеловека 34 (HAdV). Не исключено, что можно будет проанализировать другие ДНК-вирусы, которые устанавливают персистирующую инфекцию в других тканях, такие как вирус саркомыКапоши 35 (KHSV), вирус простого герпеса36 (HSV1/2), вирус Эпштейна-Барр37 (EBV).

С момента своего открытия эпигенетическая регуляция в клетках млекопитающих получает все большее признание1, учитывая, что понимание таких механизмов обеспечит ключевую информацию не только в клеточной биологии, но и в биологии болезней и опухолей. Кроме того, инфекционные агенты могут также вызывать эпигенетические изменения хозяина 2, тогда как механизмклетки-хозяина может также влиять на хроматин патогенов, таких как персистирующие ДНК-вирусы 3,4. Это взаимодействие хозяина и патогена, по-видимому, играет роль в персистенции инфекции. 2
Благодаря обратимой ассоциации с ДНК гистоновые белки образуют комплекс, называемый нуклеосомой. Нуклеосомы, в свою очередь, достигают более высокого уровня организации, известного как хроматин. Известно, что ремоделирование хроматина жестко регулирует экспрессию генов, предоставляя или отказывая в доступе к транскрипционным факторам (TF)5. Эти факторы могут либо запускать, либо блокировать рекрутирование РНК-полимеразы II (PolII) на промоторы генов, влияя на синтез мРНК из матрицыДНК 6. Гистоновые белки содержат хвосты7, фланкирующие оба конца гистоновой складки, которые могут подвергаться посттрансляционным модификациям (PTM), обеспечивая жесткую регуляцию транскрипции гена структурными изменениями хроматина. Большинство гистоновых PTM расположены на хвостовом N-конце, причем ацетилирование и метилирование являются наиболее изученными PTM, хотя также сообщалось о фосфорилировании8, убиквитинировании9 и рибозилировании10 . Характеристика и изучение таких белков необходимы для глубокого понимания регуляции генов.
В настоящее время существует несколько хорошо зарекомендовавших себя методов и инструментов для изучения прямых взаимодействий ДНК с белками: электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA), одногибридный анализ дрожжей (Y1H) и следы ДНК11. Однако эти методы сами по себе сосредоточены на единичных взаимодействиях ДНК-белка и неприменимы для полногеномных исследований. Другим ограничением этих методов является отсутствие ассоциации гистонов с исследуемыми сегментами ДНК. Таким образом, такие подходы не предназначены для отражения сложности транскрипционного механизма in vivo и не учитывают важные структурные изменения12 или другие необходимые ферменты/кофакторы13 , которые могут влиять (либо способствуя, либо ингибируя) связывание белка с ДНК.
Идея о том, что фиксация клеток с помощью таких агентов, как формальдегид (FA), может обеспечить in vivo снимок взаимодействий белка и ДНК, создала основу для разработки анализов иммунопреципитации хроматина (ChIP)14. Это, наряду с доступностью технологии количественной ПЦР (кПЦР) и высокоспецифичных антител, позволило разработать анализы ХИП-кПЦР. Впоследствии, появление методов секвенирования следующего поколения (NGS), стоимость которых становится все более доступной, позволило объединить эксперименты ChIP с подходами NGS (ChIP-seq), тем самым предоставив исследователям новые мощные инструменты, позволяющие исследовать регуляцию хроматина. В этих анализах изолированные или культивируемые клетки фиксируются с помощью дисукцинимидилглутарата (DSG) и/или FA, ядра выделяются, хроматин затем фрагментируется и осаждается интересующим антителом. Далее ДНК очищается и анализируется с помощью подходов ПЦР или NGS. В отличие от EMSA, Y1H и отпечатков ДНК, анализы ChIP способны обеспечить глобальный снимок взаимодействия белка с ДНК в клетке. Это обеспечивает гибкость и позволяет анализировать несколько локусов в одном образце. Однако, из-за характера анализа, ХИП может, в конечном итоге, обнаруживать не только прямые, но и косвенные взаимодействия, не предлагая точности вышеупомянутых методов, когда речь идет о прямых взаимодействиях белка с ДНК.
Протоколы получения хроматина из материала клеточной культуры хорошо зарекомендовали себя15 и обладают высокой воспроизводимостью, что позволяет пользователю получить хроматин, подходящий как для кПЦР, так и для NGS-подходов, за 1-2 рабочих дня. Тем не менее, получение высококачественного хроматина из целых тканей по-прежнему представляет собой проблему из-за необходимости диссоциации клеток внутри ткани при достижении оптимальной фиксации и сдвига хроматина. Кроме того, состав и морфология различных типов тканей варьируются, что требует корректировки существующих протоколов16,17. Использование криоконсервированной ткани создает дополнительные проблемы по сравнению со свежими образцами. Это связано с трудностью получения одноячеистой суспензии без обширных материальных потерь. Это приводит к неправильной резке, что затрудняет последующее применение. Тем не менее, доступ к замороженным образцам тканей, а не к свежим аналогам, не только повышает гибкость работы, но и может представлять собой единственный вариант для исследователей, работающих с образцами, полученными в результате продольных или сравнительных исследований. Было опубликовано несколько протоколов приготовления хроматина для замороженных тканей. Они в основном основаны на размораживании образца с последующим измельчением, ручной/машинной диссоциацией или измельчением жидким азотом на этапах18,19,20.
Здесь мы описываем оптимизированный методполучения хроматина 15 для замороженных нефиксированных образцов печени, который сочетает измельчение ткани в жидком азоте с гомогенизацией пестика для достижения воспроизводимого сдвига хроматина, подходящего для подходов X-ChIP, направленных на анализ как вирусных, так и хост-геномов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m sterile syringe filter</td>
			<td>Labsolute</td>
			<td>7699822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safeseal tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>7,27,06,400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x orange loading dye</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor NGS</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade or Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deacetylase Inhibitor</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>37494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>DWK885300-0001-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 500 mM solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218</td>
			<td>Concentration 10mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>CHEMSOLUTE</td>
			<td>2273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10901393001</td>
			<td>Concentration: 20mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen cooled mini mortar</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H37260-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH free Formaldehyde 16%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc&#160;SC-Protease-Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>11429868001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Lock Gel - Heavy</td>
			<td>QuantaBio</td>
			<td>2302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MPRK092</td>
			<td>Concentration: 50 &#181;g/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>MRNA092</td>
			<td>Concentration: 5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 10% solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate anhydrous</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83,39,02,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>T2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin extraction from frozen chimeric liver tissue for chromatin immunoprecipitation analysis

Сшивание иммунопреципитации хроматина (X-ChIP) является широко используемым методом для оценки уровней гистоновых меток и занятости факторов транскрипции на хроматине хозяина и/или патогена. Получение хроматина из тканей создает дополнительные проблемы, которые необходимо преодолеть для получения воспроизводимых и надежных протоколов, сравнимых с теми, которые используются для культивирования клеток. Разрушение и фиксация тканей являются важными шагами для достижения эффективного сдвига хроматина. Сосуществование различных типов клеток и кластеров также может потребовать разного времени сдвига для достижения оптимального размера фрагмента и препятствует воспроизводимости сдвига. Целью этого метода является получение надежных и воспроизводимых препаратов хроматина хозяина из замороженной ткани (печени), пригодных как для ChIP-qPCR, так и для секвенирования следующего поколения (NGS). Мы наблюдали, что комбинация измельчения тканей жидким азотом с последующей гомогенизацией приводит к повышенной воспроизводимости по сравнению только с гомогенизацией, поскольку она обеспечивает суспензию, состоящую в основном из диссоциированных одиночных клеток, которые могут быть эффективно срезаны. Кроме того, этап фиксации должен выполняться при мягком вращении, чтобы обеспечить однородную сшивку. Затем фиксированный материал пригоден для выделения ядер на основе буфера, чтобы уменьшить загрязнение цитоплазматического белка и патогенных ДНК и РНК (если применимо), избегая трудоемких градиентов центрифугирования. Последующая обработка ультразвуком завершит ядерный лизис и сдвиг хроматина, производя определенный диапазон размеров в соответствии с выбранными условиями сдвига. Диапазон размеров должен составлять от 100 до 300 нт для приложений NGS, в то время как для анализа ChIP-qPCR он может быть выше (300-700 нт). Такая адаптация протокола может значительно улучшить анализ хроматина из замороженных образцов тканей.

Получение хроматина является важным шагом в достижении успешного ХИП. Чтобы получить хроматин хорошего качества из замороженных образцов, мы должны обеспечить эффективное разрушение тканей перед фиксацией, чтобы избежать присутствия тканевых комков, которые могут помешать эффективному сдвигу. На рисунке 1 показан сводный конвейер протокола. Одного измельчения недостаточно для полной диссоциации ткани, поскольку она производит клеточные кластеры переменного размера и несколько отдельных клеток (рис. 1а). Связывая первую стадию измельчения с гомогенизацией Dounce, количество тканевых комков сильно уменьшается, а остальные меньше (рис. 1b). После этапов фиксации и лизиса количество видимых одиночных ядер (рис. 1c) увеличивается, в то время как типичный сферический вид теряется. После обработки ультразвуком в течение 28 циклов ядерное окрашивание (Hoechst 33258 / DAPI) в основном больше не видно. Это действительно признак успешной стрижки (рис. 1d). После декросслинкинга аликвоты хроматина и визуализации ДНК на агарозном геле успешную резку можно распознать по наличию фрагментов в диапазоне 100-300.н. (рис. 2а) Количество ДНК может варьироваться в зависимости от состава подготовленного куска ткани. Такой хроматин может быть успешно использован для ХИП-кПЦР. Как показано на рисунке 2b, хроматин может быть успешно осажден антителами H3K4me3, H3K27ac (модификации, связанные с активными генами) и H3K27me3 (модификация, связанная с молчаливыми генами). Открытая рамка считывания хромосомы 1 43 (C1orf43), протеасома 20S субъединицы бета 2 (PSMB2) и промоторные области глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (mGapdh) были обогащены H3K4me3 и H3K27ac по сравнению с промоторными областями гомеобокса C13 (HOXC13), гомеобокса C12 (HOXC12) и промотора миелинового фактора транскрипции 1 мыши (mMyt1) (таблица 1). Это связано с тем, что C1orf43, PSMB2 и mGapdh конститутивно транскрибируются в печени, в то время как HOXC13, HOXC12 и mMyt1 подавляются. H3K27me3 демонстрирует противоположное поведение, подтверждающее успех анализа ChIP. Тот факт, что печень этих мышей является химерой, позволил проанализировать как мышиный, так и человеческий хроматин. Кроме того, тот же хроматин может быть успешно использован для экспериментов ChIP-seq. После этапа секвенирования чтения были выровнены по индексу, состоящему как из мышиного, так и из человеческого геномов, чтобы уменьшить количество невыровненных фрагментов. Впоследствии показания были разделены по видам и дополнительно проанализированы с помощью EaSeq22. Затем интенсивность сигнала измеряли в месте начала транскрипции (TSS) каждого гена, и результат сортировали по интенсивности сигнала H3K4me3. На рисунках 3a и 3c показано заметное присутствие H3K4me3 и H3K27ac в TSS для значительной части генов как в мышином, так и в человеческом хроматине. Кроме того, H3K27me3 антикоррелирует с H3K4me3/H3K27ac. H3K27me3 присутствует на всей длине гена, а не только в TSS, как ожидается от этого PTM. На рисунках 3b и 3d показан кластер HOXC/HoxC, известный тем, что он обогащен H3K27me3 и транскрипционно неактивен как в печени мышей, так и в печени человека. Профилирование H3K4me3 и H3K27ac показывает пики для этих двух PTM, в то время как интенсивность сигнала H3K27me3 имеет тенденцию быть ниже и более распределенной.
Из-за сложности подготовки хроматина может произойти чрезмерная фиксация, время лизиса или обработки ультразвуком может быть неоптимальным, скопления больших клеток могут сохраняться или неадекватное обращение с образцом может быть неадекватным. Это все события, влияющие на качество препарата. В некоторых случаях обогащение фрагментов хроматина в пределах правильного размера все еще будет присутствовать или будет смещено к большему размеру. В других случаях может произойти потеря материала из-за преждевременного лизиса или неудачной резки. На рисунке 4 показаны некоторые примеры таких отрицательных и неоптимальных результатов. Полосы 3 и 4 показывают обогащение размера фрагмента от 200 до 800.н. Однако ясно, что размер фрагмента колеблется от 100 до >10 000.н. В полосах 5 и 6 наблюдается обогащение в диапазоне 100-250.н. с явной потерей материала во время подготовки. Это может объяснить, почему обработка ультразвуком произвела меньшие фрагменты. Полоса 7 показывает немного неоптимальную подготовку с увеличенным диапазоном фрагментов, в то время как полоса 8 показывает почти полную потерю материала. Это может быть вызвано преждевременным ядерным лизисом или недостаточной диссоциацией тканей с последующей потерей после этапа 5.5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig01.jpg"> Рисунок 1: Обзор протокола приготовления хроматина. Снимки были сделаны после измельчения тканей (а), дополнительной ручной гомогенизации (б), после ядерного лизиса (с) и после обработки ультразвуком (до центрифугирования) (d). Ядерное окрашивание проводили с помощью Hoechst 33258/DAPI. Масштабная линейка = 200 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig02.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативный сдвиг хроматина и его качество, оцененное с помощью ХИП-кПЦР . 1% агарозный гель с фрагментированными образцами хроматина по протоколам из разных препаратов хроматина. Добавляется контроль несрезанного хроматина, чтобы заранее убедиться в отсутствии деградации хроматина / ДНК (а). Срезанный хроматин был протестирован на качество с помощью анализа ChIP-qPCR. Антитела H3K4me3, H3K27ac и H3K27me3 использовали для осаждения свежеприготовленного хроматина. (b ) анализ кПЦР проводили на активных промоторах человека (C1orf43 и PSMB2), мышей (Gapdh) и неактивных промоторах человека (HOXC13, HOXC12), мышей (Myt1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig03.jpg"> Рисунок 3: Репрезентативный анализ ChIP-seq. Показания были выровнены с индексом, созданным как с геномами человека, так и с геномами мыши (hg19 и mm10). После выравнивания человеческие и мышиные показания были разделены и дополнительно проанализированы. Тепловая карта генов человека, где сигнал был количественно определен в TSS и показан в порядке убывания интенсивности H3K4me3 (a). Пример кластера генов человека с подавленными генами (кластер HOX), окруженного активными генами (b). Тепловая карта мышиных генов, где сигнал был количественно определен в TSS и показан в порядке убывания интенсивности H3K4me3 (c). Пример мышиного генного кластера подавленных генов (Hox-кластер), окруженного активными генами (d). Все показанные данные были нормализованы EaSeq на миллион прочтений. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig04.jpg"> Рисунок 4: Субоптимальные и неудачные препараты хроматина. 1% Агарозный гель с фрагментированными образцами хроматина по протоколу. На рисунке показан несрезанный хроматин, используемый в качестве контроля (полоса 2), неоптимальная резка (полоса 3-4), оптимальная резка с явными потерями материала (полоса 5-6), субоптимальная резка (полоса 7) и обширные потери материала (полоса 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Название букваря</td>
			<td></td>
			<td>Последовательность</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Промотор C1orf43</td>
			<td>Вперёд</td>
			<td>AGTGGGTGGAGAATGCAGAC</td>
		</tr><tr><td>Обратный</td>
			<td>GAGATTACCCCACCCCCCCCCCCC</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Промоутер PSMB2</td>
			<td>Вперёд</td>
			<td>CTTATTCAACCCCCGACAAA</td>
		</tr><tr><td>Обратный</td>
			<td>ГАТГААГГАГГГГГГГТГАГГА</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Дистальный промотор HOXC13</td>
			<td>Вперёд</td>
			<td>GAGCCCGAGATTCCAAC</td>
		</tr><tr><td>Обратный</td>
			<td>TTATGCCCAGTTTGGGGTA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Дистальный промотор HOXC12</td>
			<td>Вперёд</td>
			<td>AAAGCTTCCCACTGCAAAGA</td>
		</tr><tr><td>Обратный</td>
			<td>AAATCTGGGGGCGAACTACT</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Промоутер mGAPDH</td>
			<td>Вперёд</td>
			<td>GGTCCAAAGAGAGGGAGGAG</td>
		</tr><tr><td>Обратный</td>
			<td>GCCCTGCTTATCCAGTCCTA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Промоутер mMYT</td>
			<td>Вперёд</td>
			<td>CAGCCCAATTCTAGCCACAT</td>
		</tr><tr><td>Обратный</td>
			<td>CCAAAGCAGGGGAGTAGGAG</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Список праймеров кПЦР для активных и неактивных генов, используемых для анализов ChIP-qPCR.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis at JoVE.com

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Этот протокол фокусируется на получении хроматина из замороженных тканей и подходит для иммунопреципитации сшивающего хроматина (X-ChIP) с последующим количественным анализом ПЦР (X-ChIP-qPCR) или подходами к секвенированию следующего поколения (X-ChIP-seq).

Экстракция хроматина из замороженной химерной ткани печени для анализа иммунопреципитации хроматина

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Этот протокол приводит к воспроизводимой и надежной экстракции хроматина из замороженных образцов печени для экспериментов по иммунопреципитации хроматина. Для начала поместите пробирку с замороженной тканью в ступку и оставьте ее там на пять минут. Затем надавите на образец с помощью предварительно охлажденного пестика до тех пор, пока не исчезнут твердые крошки.Извлеките пробирку с образцом из раствора. Добавьте 950 микролитров ледяного PBS с необходимыми ингибиторами и аккуратно пипеткой вверх и вниз, пока образец полностью не ресуспендируется. Немедленно перенесите тканевую суспензию в гомогенизатор и нанесите от 20 до 30 ударов пестиком А, чтобы получить более тонкую суспензию.Избегайте перемещения пестика за пределы жидкой фазы, чтобы предотвратить пенообразование. Переложите гомогенат в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра, предварительно охлажденную на льду. Затем центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при температуре 1,300 G и четырех градусах Цельсия.Осторожно удалите надосадочную жидкость и полностью ресуспендируйте гранулы в 950 микролитрах PBS комнатной температуры путем осторожного пипетирования. Затем добавьте 63,6 микролитра 16%-ного формальдегида, не содержащего метанола, до получения конечной концентрации 1%Немедленно поверните пробирку на 10 минут при комнатной температуре. После вращения добавьте 113 микролитров 1,25 молярного глицина при комнатной температуре, чтобы получить конечную концентрацию 125 ммоляр, и вращайте пробирку еще пять минут.Затем центрифугируют образец при температуре 1 300 г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от надосадочной жидкости и осторожно ресуспендируйте гранулы, пипетируя 950 микролитров ледяного PBS с необходимыми ингибиторами. Снова центрифугируйте образец и ресуспендируйте гранулу, как показано ранее.Повторите этап центрифугирования еще раз и сразу же приступайте к процедуре выделения хроматина. Добавьте в гранулу 950 микролитров буфера А с необходимыми ингибиторами и аккуратно перемешайте пипеткой до тех пор, пока гранула полностью не ресуспендируется. Затем вращайте трубку в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.После вращения центрифугируют образец при 2 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и осторожно удаляют надосадочную жидкость. Добавьте в гранулу 950 микролитров буфера B с необходимыми ингибиторами и аккуратно перемешайте пипеткой до полного ресуспендирования гранулы. Затем вращайте трубку в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.После вращения снова центрифугируйте образец. Удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте 300 микролитров буфера С комнатной температуры с необходимыми ингибиторами в гранулу и энергично пипетку.Встряхните образец в течение 15-30 секунд. Затем ненадолго покрутите тюбик, чтобы собрать капли на крышке. После обработки ультразвуком образца хроматина добавьте 30 микролитров 10% раствора Triton X-100 и встряхните в течение пяти-10 секунд.Центрифугируют образец при 16 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. И переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра, предварительно охлажденную на льду. Перенесите от 10 до 25 микролитров измельченного хроматина в новую пробирку и добавьте буфер C, чтобы достичь конечного объема в 200 микролитров.Аликвота и шок заморозьте остаток хроматина при температуре минус 80 градусов по Цельсию до дальнейшего использования. Добавьте восемь микролитров пятимолярного хлорида натрия и выдерживайте не менее шести часов при температуре 65 градусов Цельсия в нагревательном блоке, встряхивая при 1,000 об/мин. По возможности продлите инкубацию на ночь.После того, как образцы остынут при комнатной температуре в течение пяти минут, добавьте два микролитра РНКазы А и инкубируйте в течение одного часа при 37 градусах Цельсия, встряхивая при 1000 об/мин. Извлеките образцы из нагревательного блока и добавьте семь микролитров 300 миллимоляров хлорида кальция и два микролитра протеиназы К. Инкубируйте образцы в нагревательном блоке при температуре 56 градусов Цельсия в течение 30 минут, встряхивая при 1 000 об/мин. Между тем, подготовьте одну пробирку для разделения фаз для каждого образца, центрифугируя их до 16 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.Вынув пробирки из нагревательного блока и дав им уравновеситься при комнатной температуре в течение трех минут, перенесите 400 микролитров образца в предварительно центрифугированную пробирку для разделения фаз. Затем добавьте 400 микролитров раствора изоамилового спирта фенолхлороформа и встряхните в течение пяти секунд. Центрифугируйте пробирку при 16 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Затем добавьте 400 микролитров хлороформа и встряхните в течение пяти секунд. Центрифугируйте пробирку еще пять минут и перенесите 400 микролитров верхней фазы в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра, которая содержит 24 микролитра пятимолярного хлорида натрия и 0,75 микролитра гликогена. Затем ненадолго закрутите трубку.Добавьте 1 055 микролитров 100% этанола. Затем тщательно перемешайте и инкубируйте образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение одного часа или при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение ночи. После завершения инкубации центрифугируют образец при 16 000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и осторожно удаляют надосадочную жидкость, не вывихивая гранулы.Добавьте 500 микролитров холодного 70% этанола и осторожно наклоните трубку, чтобы гранулы были промыты. Центрифугируйте пробирку при 16 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно удалите всю надосадочную жидкость и дайте гранулам высохнуть при комнатной температуре.Кроме того, инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия для более быстрого высыхания. Добавьте 50 микролитров раствора Tris-EDTA и поместите трубку на нагревательный блок на пять-10 минут при встряхивании при 300 об/мин. Затем проанализируйте ДНК на 1%-ном агарозном геле.После декросслинкинга хроматина и визуализации ДНК на агарозном геле успешный сдвиг можно распознать по наличию фрагментов в диапазоне от 100 до 300 пар оснований. Хроматин был успешно осажден антителами триметилирования H3K4, ацетилирования H3K27 и триметилирования H3 K27 и дальнейшего анализа с помощью кПЦР. Хромосома одна открытая рамка считывания 43, субъединица протеасомы 20S бета два и области промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, которые активно транскрибируются в печени, показали обогащение триметилированием H3K4 и ацетилированием H3K27.Для сравнения, гомеобокс С13, гомеобокс С12 и промоторные области промотора фактора транскрипции миелина мыши, которые подавляются в печени, не были обогащены, как ожидалось. Триметилирование H3 K27 демонстрирует противоположное поведение, тем самым подтверждая успех иммунопреципитации хроматина или анализа ChIP. Хроматин был успешно подвергнут ChIP-Seq.После секвенирования тростник выравнивали по заранее подготовленному индексу и разделяли по видам. Триметилирование H3K4 и осаждение ацетилирования H3K27 в начальных сайтах транскрипции генов, как и ожидалось, антагонизировалось с осаждением триметилирования H3K27. Кластер Hox C известен тем, что транскрипционно неактивен как в печени мышей, так и в печени человека.Профилирование триметилирования H3K4 и ацетилирования H3K27 показывает пики для этих двух посттрансляционных модификаций за пределами кластера, в то время как интенсивность сигнала триметилирования H3K27 имеет тенденцию увеличиваться в кластере генов. Экстракция хроматина из замороженных образцов тканей имеет высокую внутреннюю изменчивость, сильно зависящую от тонкости клеточной суспензии и температуры во время сшивания. Обеспечение фиксированных лабораторных условий помогает поддерживать воспроизводимость диапазона размеров фрагментов.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Хроматин Пробирной по правам ткани мозга

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Хроматин Иммунопреципитация из человеческих эмбриональных стволовых клеток

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Хроматин Иммунопреципитация (чип) с Пробирной Динамический гистонов Внесение изменений в Активированный экспрессии генов в клетках человека

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Хроматин Иммунопреципитация Пробирной для тканеспецифические Гены использованием ранней стадии эмбрионы мыши

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Хроматин иммунопреципитации (чип) использование Drosophila Ткани

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Хроматина анализ взаимодействия с парными-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) для карт хроматина Взаимодействие и понимание регуляции транскрипции

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Эффективное использование Иммунопреципитация хроматина Ограничение количество биомассы

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Генерация высших шаблона ДНК хроматина Качество Иммунопреципитация для высокопроизводительного секвенирования (чип-след)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Биохимические анализы для анализа деятельности АТФ-зависимых ферментов хроматина

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...