Name: myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays
Uploaded: 2021-02-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays at JoVE.com

हम इस डेटा को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले रिएजेंट्स को तैयार करने के साथ तकनीकी सहायता के लिए डॉ फेंग झांग को धन्यवाद देते हैं । इस काम को एनएचएलबीआई/एनआईएच इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम फंड्स एचएल001786 ने जेआर एस को सपोर्ट किया ।

1. प्रोटीन शुद्धि
<ol><li>सेल लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण<ol>
<li>टेबल1 के आधार पर 1.5x एक्सट्रैक्लट्रेक्शन बफर तैयार करें। फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।</li>
		<li>बर्फ पर सेल छर्रों विगलन शुरू करते ?...

यहां प्रस्तुत मायोसिन 5ए और नॉनमस्कल मायोसिन 2बी के शुद्धिकरण और इन विट्रो लक्षण वर्णन के लिए एक कार्यप्रवाह है। प्रयोगों का यह सेट शुद्ध मायोसिन निर्माणों के मशीनोकेमिकल गुणों को तेज और प्रजनन तरीके ...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M CaCl2 Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M MgCl2 Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl Solution</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGE-3270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>984303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amyl Acetate</td>
			<td>Ladd Research Industries</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated G-Actin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>AB07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bPEG-silane</td>
			<td>Laysan Bio, Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin</td>
			<td></td>
			<td>PMID: 2985564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Filter Paper - Gliding Assay</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular Filter Paper - Inverted Assay</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5056489001</td>
			<td>This should be stored at 4 &#176;C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 &#176;C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating Tubes (100,000 MWCO)</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>The MWCO of the tube is not necessarily &#34;one size fits all,&#34; as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Rack</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z688568-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips: Gliding Acting Filament Assay</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips: Inverted Motility Assay</td>
			<td>Azer Scientific</td>
			<td>ES0107052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>08-670-5A</td>
			<td>The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-Sided Tape</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>909955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Peptide</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>RP10586</td>
			<td>This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 &#176;C as 300 &#181;L aliquots.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>761-1550</td>
			<td>These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4&#176; C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin</td>
			<td></td>
			<td>PMID: 4254541</td>
			<td>G-actin stock can be stored at 200 &#956;M in liquid N2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-295018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Orifice Pipet Tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-707-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin Protease Inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark12 Unstained Standard Ladder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MX0482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP308-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-silane</td>
			<td>Laysan Bio, Inc</td>
			<td>MPEG-SIL-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain Kinase</td>
			<td></td>
			<td>PMID: 23148220</td>
			<td>FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Ladd Research Industries</td>
			<td>10800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>78830</td>
			<td>PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 &#176;C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>397492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 &#956;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12658-027</td>
			<td>This should be stored at 4&#176; C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish - Gliding Assay</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td>Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish - Inverted Assay</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth-sided 200 &#181;L Pipette Tips</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1158U38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Environmental Control Box</td>
			<td>Tokai HIT</td>
			<td>Custom Thermobox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mid Bench Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model: CR3i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misonix Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td>XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Cleaner</td>
			<td>Diener electronic GmbH + Co. KG</td>
			<td>System Type: Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Probe (3.2 mm)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>Model: 56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waverly Tube Mixer</td>
			<td>Waverly</td>
			<td>TR6E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ FIJI</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST (Version 1.01)</td>
			<td>http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements</td>
			<td>FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Stabilizer Plugin</td>
			<td>https://imagej.net/Image_Stabilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ TrackMate</td>
			<td>https://imagej.net/TrackMate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Software</td>
			<td>NIS Elements (AR package)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>File:TrackMate-manual.pdf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>https://github.com/turalaksel/FASTrack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays

मायोसिन प्रोटीन फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) के साथ बांधते हैं और बातचीत करते हैं और फिलोजेनेटिक पेड़ के पार जीवों में पाए जाते हैं। उनकी संरचना और एंजाइमेटिक गुणों को उन विशेष कार्य के लिए अनुकूलित किया जाता है जो वे कोशिकाओं में निष्पादित करते हैं। मायोसिन 5ए कोशिकाओं में मेलानोसोम और वेसिकल्स के परिवहन के लिए एफ-ऐक्टिन पर चलता है। इसके विपरीत, नॉनमस्कल मायोसिन 2बी लगभग 30 अणुओं वाले द्विध्रुवी फिलामेंट के रूप में संचालित होता है। यह फिलामेंट के केंद्र की ओर विपरीत ध्रुवता के एफ-ऐक्टिन को स्थानांतरित करता है, जहां मायोसिन अणु ऐक्टिन को बांधने, पावर स्ट्रोक प्रदान करने और चक्र दोहराने से पहले अलग करने के लिए अतुल्यकालिक रूप से काम करते हैं। नॉनमस्कल मायोसिन 2बी, इसके अन्य नॉनमस्कल मायोसिन 2 आइसोफॉर्म के साथ, ऐसी भूमिकाएं हैं जिनमें सेल आसंजन, साइटोकिन्सिस और तनाव रखरखाव शामिल हैं। शुद्ध प्रोटीन का उपयोग करके विट्रो मोटिविटी परखों में प्रदर्शन करके मायोसिन के मशीनीमिस्ट्री का अध्ययन किया जा सकता है। ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख में, मायोसिन एक माइक्रोस्कोप कवरलिप सतह से बंधे होते हैं और फ्लोरोसेंट रूप से एफ-ऐक्टिन लेबल होते हैं, जिन्हें ट्रैक किया जा सकता है। एकल अणु/पहनावा गतिशीलता परख में, हालांकि, एफ-ऐक्टिन एक कवरस्लिप से बंधा हुआ है और एफ-ऐक्टिन पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले मायोसिन अणुओं की आवाजाही देखी जाती है । इस रिपोर्ट में, एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके एसएफ 9 कोशिकाओं से रिकॉम्बिनेंट मायोसिन 5ए की शुद्धि रेखांकित की गई है। इसके बाद, हम दो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित परख की रूपरेखा तैयार करते हैं: ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख और उल्टे गतिशीलता परख। इन परखों से, ऐक्टिन ट्रांसलोकेशन वेग और एकल अणु रन लंबाई और वेग जैसे मापदंडों को छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निकाला जा सकता है। इन तकनीकों को गैरमस्कल मायोसिन 2 आइसोफॉर्म के एकल तंतुओं के आंदोलन का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, जो यहां गैरमुस्कल मायोसिन 2बी के संदर्भ में चर्चा की गई थी। यह कार्यप्रवाह एक प्रोटोकॉल और मात्रात्मक उपकरणों का एक सेट का प्रतिनिधित्व करता है जिसका उपयोग गैर-संगीत के एकल अणु और कलाकारों की टुकड़ी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

मायोसिन के शुद्धिकरण का मूल्यांकन सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट-पॉलीएक्रिलेमाइड (एसडीएस-पेज) जेल-इलेक्ट्रोफोरेसिस को कम करके किया जा सकता है जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है । हालांकि यह आंकड़ा अ...

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Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

यहां प्रस्तुत एक प्रक्रिया को व्यक्त करने और अपने लक्षण वर्णन की चर्चा के बाद मायोसिन 5a शुद्ध है, दोनों कलाकारों की टुकड़ी और विट्रो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित परख में एकल अणु का उपयोग कर, और कैसे इन तरीकों nonmuscle myosin 2b के लक्षण वर्णन के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

इन विट्रो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित गतिशीलता परख के मायोसिन-विशिष्ट अनुकूलन

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रोटीन स्तर पर गैर-मांसपेशी मायोसिन गतिशीलता की विशेषता के लिए किया जा सकता है, जो कोशिकाओं में उनकी भूमिकाओं में योगदान करने वाले मोती गुणों को सूचित कर सकता है। यह एक तेज, प्रजनन योग्य और अत्यधिक नियंत्रित विधि है जिसका उपयोग मायोसिन मोटिविटी पर विभिन्न नियामक स्थितियों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो उनके सेलुलर व्यवहारों को सूचित करता है। इन तकनीकों का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि गैर-मांसपेशी मायोसिन में रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तन एकल अणु और कलाकारों की टुकड़ी के स्तर पर उनके व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं।इसकी कार्यप्रणाली के सामान्य दृष्टिकोण को विभिन्न अन्य साइटोस्केलेल प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि शुद्ध किनेसिन और माइक्रोट्यूबुल्स के साथ डायनेन का लक्षण वर्णन। इस प्रोटोकॉल की बहुमुखी प्रतिभा सवाल उठा सकती है जिसके बारे में फ्लोरोफोरेस और रासायनिक स्थितियां सबसे उपयुक्त हैं, लेकिन विधि को अपेक्षाकृत जल्दी अनुकूलित किया जा सकता है। यह समझना कि प्रवाह कक्षों को कैसे स्थापित और कोट करना है, यह एक मजबूत नींव है जिस पर कोई भी इन प्रयोगों के लिए विभिन्न परिस्थितियों के अनुकूल हो सकता है।शुरू करने के लिए, एमिल एसीटेट में एक प्रतिशत नाइट्रोसेल्यूलोस समाधान तैयार करें और एक ऊतक संस्कृति प्लेट के नीचे 125 मिलीमीटर व्यास के साथ एक गोलाकार फ़िल्टर पेपर रखें। लोड आठ वर्ग कवर एक रैक पर फिसल जाता है और अच्छी तरह से उन्हें 200 प्रूफ इथेनॉल के लगभग दो से पांच मिलीलीटर के साथ धोने के बाद आसुत पानी के दो से पांच मिलीलीटर। फिर फ़िल्टर की गई एयर लाइन या नाइट्रोजन लाइन का उपयोग करके कवर स्लिप को पूरी तरह से ड्राइव करें।धीरे-धीरे एक कवर स्लिप के एक किनारे के साथ एक प्रतिशत नाइट्रोसेल्यूलोस समाधान के 10 माइक्रोलीटर पिपेट करें। एक चिकनी गति में एक 200 माइक्रोलिटर पिपेट टिप के पक्ष का उपयोग करके इसे बाकी कवर स्लिप में धुंधला करें। फिर इस कवर स्लिप को टिशू कल्चर डिश पर नाइट्रोसेल्यूलोज साइड अप के साथ रखें।शेष कवर स्लिप के लिए इसे दोहराएं और उन्हें सूखने दें। बड़े मलबे को साफ करने के लिए ऑप्टिकल लेंस पेपर के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड को मिटा दें। डबल-तरफा टेप के दो टुकड़े काटें, लंबाई में लगभग दो सेंटीमीटर, और माइक्रोस्कोप स्लाइड के लंबे किनारे के बीच में एक टुकड़ा रखें।टेप के दूसरे टुकड़े को टेप के पहले टुकड़े के नीचे लगभग दो मिलीमीटर रखें जैसे कि दोनों समानांतर एक प्रवाह कक्ष बना रहे हैं जो समाधान के लगभग 10 माइक्रोलीटर पकड़ सकता है। ध्यान से टेप पर नाइट्रोसेल्यूलोस कवर स्लिप में से एक छड़ी ताकि नाइट्रोसेल्यूलोस के साथ लेपित पक्ष टेप के साथ सीधा संपर्क कर रहा है। एक पिपेट टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे स्लाइड टेप इंटरफेस पर दबाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कवर स्लिप स्लाइड का ठीक से पालन किया जाए।फिर एक रेजर ब्लेड के साथ स्लाइड के किनारे पर लटक अतिरिक्त टेप काट। मायोसिन 5ए के लिए समाधान तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें। स्लाइड फ्लो चैंबर के माध्यम से मायोसिन 5ए के 10 माइक्रोलीटर में प्रवाह करें और एक मिनट तक प्रतीक्षा करें।फिर डीटीटी के साथ गतिशीलता बफर में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर बीएसए के 10 माइक्रोलीटर में प्रवाहित करें। इसे दो बार दोहराएं और तीसरे वॉश के बाद एक मिनट इंतजार करें। प्रवाह कक्ष से बाहर निकलने पर धीरे से कागज के कोने रखकर चैनल के माध्यम से समाधान बाती करने के लिए एक ऊतक कागज या फिल्टर कागज के कोने का उपयोग करें ।फिर डीटीटी के साथ मोटिविटी बफर के 10 माइक्रोलीटर से धोएं। एक मिलीलीटर सिरिंज और एक 27 गेज सुई के साथ काले ऐक्टिन समाधान को चैंबर में उस समाधान को पेश करने से पहले ऐक्टिन फिलामेंट्स कतरनी के साथ पिपेट करें। एक मिलीमोलर डीटीटी के साथ 50 मिलीमोलर एमबी में एक मिलीमोलर एटीपी की मौजूदगी में ब्लैक ऐक्टिन को चैंबर में जोड़ें।इसके बाद, मुक्त ऐक्टिन फिलामेंट्स के चैंबर को समाप्त करने के लिए डीटीटी और एक मिलीमोलर एटीपी के साथ गतिशीलता बफर के 50 माइक्रोलीटर में प्रवाहित करें। किसी भी एटीपी के कक्ष को समाप्त करने के लिए तीन बार डीटीटी के साथ गतिशीलता बफर के 10 माइक्रोलीटर के साथ धोएं। डीटीटी के साथ गतिशीलता बफर युक्त 20 नैनोमोलर आरएच ऐक्टिन समाधान के 10 माइक्रोलीटर में प्रवाह करें और कवर स्लिप की सतह से जुड़े मायोसिन 5ए को ऐक्टिन फिलामेंट्स की कठोरता बाध्यकारी की अनुमति देने के लिए एक मिनट की प्रतीक्षा करें।अनबाउंड आरएच ऐक्टिन फिलामेंट्स को हटाने के लिए डीटीटी के साथ दो बार 50 मिलीमोलर मोटिविटी बफर के 10 माइक्रोलीटर से धोएं। अंतिम बफर के 30 माइक्रोलीटर में प्रवाह। आरएच ऐक्टिन की कल्पना करने के लिए 561 नैनोमीटर की उत्तेजन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर छवियों को रिकॉर्ड करें।मायोसिन 5ए उल्टे गतिशीलता परख के लिए समाधान तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें। उन्हें डीटीटी के साथ गतिशीलता बफर के 10 माइक्रोलीटर के साथ चैंबर धोएं। डीटीटी के साथ गतिशीलता बफर में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर बीएसए के 10 माइक्रोलीटर में प्रवाह।इसे दो बार दोहराएं, तीसरे धोने के बाद एक मिनट इंतजार करें। प्रवाह कक्ष से बाहर निकलने पर धीरे से कागज के कोने रखकर चैनल के माध्यम से समाधान बाती करने के लिए ऊतक या फिल्टर कागज का उपयोग करें । इसके बाद तीन बार डीटीटी के साथ मोटिविटी बफर के 10 माइक्रोलीटर से चैंबर धोएं।डीटीटी के साथ मोटिविटी बफर में न्यूट्राडिन सॉल्यूशन के 10 माइक्रोलीटर में फ्लो करें और एक मिनट तक इंतजार करें। फिर उस समाधान के 10 माइक्रोलीटर से तीन बार धोएं। बीआरएच ऐक्टिन के 10 माइक्रोलीटर में प्रवाह जिसमें डीटीटी के साथ गतिशीलता बफर होता है जो एक बड़े-ऊब पिपेट टिप का उपयोग करके।और एक मिनट तक इंतजार करें। फिर, तीन बार डीटीटी के साथ गतिशीलता बफर के 10 माइक्रोलीटर से धोएं। 10 नैनोमोलर मायोसिन 5ए के साथ अंतिम बफर के 30 माइक्रोलीटर में प्रवाह।और तुरंत कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर लोड करें। एक बार TIRF इमेजिंग के लिए इष्टतम ध्यान पाया जाता है रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं । गैर-मांसपेशी मायोसिन 2बी, आवश्यक प्रकाश श्रृंखला, और नियामक प्रकाश श्रृंखलाओं के शुद्धिकरण के साथ-साथ मायोसिन 5ए और शांत-एसडीएस-पेज का मूल्यांकन किया गया था।ग्लाइडिंग ऐक्टिवमेंट परख एक आदर्श और ट्रैक करने योग्य फिल्म की विशेषताओं को दर्शाता है जिसमें लेबल किए गए ऐक्टिन फिलामेंट्स के चिकनी आंदोलनों की विशेषता होती है। ब्लैक ऐक्टिन वॉश ने यह सुनिश्चित किया कि मृत मायोसिन सिर को माप क्षेत्र से हटा दिया गया और ऐक्टिन फिलामेंट्स के समग्र चिकनी आंदोलन में योगदान दिया गया। फास्ट ट्रैक प्रोग्राम से फिलामेंट ट्रैकिंग आउटपुट छवियां गैर-मांसपेशी मायोसिन 2बी और मायोसिन 5ए के लिए प्राप्त की गई थीं।एक प्रतिनिधि हिस्टोग्राम से पता चलता है कि Actomyosin 2b ग्लाइडिंग वेग प्रति सेकंड ७७ नैनोमीटर है । और Actomyosin 5a की है कि प्रति सेकंड ५१५ नैनोमीटर है । मिथाइलसेल्यूलोस की अनुपस्थिति में, ऐक्टिन फिलामेंट्स मायोसिन-लेपित सतह से निकटता से जुड़े नहीं रहते हैं, जिससे यह गैर-मांसपेशी मायोसिन 2बी-लेपित कवर स्लिप की सतह के करीब फ्लॉपिंग होता है।Myosin आंदोलन उल्टे गतिशीलता परख का उपयोग कर सतह-सीमित फ्लोरोसेंट ऐक्टिन फिलामेंट्स पर देखा गया था। ब्लैक ऐक्टिन वॉश के लिए फ्लो सेल में पेश करने से पहले अवेलेबल ऐक्टिन को कतरनी जरूरी है जो ऐक्टिन के स्मूथ ट्रांसलोकेशन की अनुमति देगा। अतिरिक्त प्रयोग इस बात की जांच कर सकते हैं कि मायोसिन म्यूटेशन, लोड-उत्प्रेरण प्रोटीन, आयनिक ताकत और नियामक प्रोटीन से मायोसिन मोटिविटी कैसे प्रभावित होती है।भविष्य के अध्ययनों के लिए विभिन्न सेलुलर स्थितियों का पुनर्गठन किया जा सकता है। ये विधियां जैव रासायनिक और जैव भौतिक जांचों के लिए अनुमति देती हैं कि कैसे विभिन्न मायोसिन आइसोफॉर्म एकल अणु और कलाकारों की टुकड़ी के स्तर पर उनके मोती और यांत्रिक गुणों में भिन्न होते हैं।

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Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

स्वचालित ध्वनिक शक्ति निर्धारण assays में पेप्टाइड agonists के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए वितरण

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

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छोटे पैमाने पर वर्णमिति की परख Intracellular स्तनपान और पाइरूवेट में निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस

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Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

विट्रो में हाइपोपिग्मेंटेशन गतिविधि का प्रमाणन

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

शारीरिक रूप से सक्रिय Thylakoids के अलगाव और ऊर्जा पर निर्भर प्रोटीन परिवहन परख में उनके उपयोग

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

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A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

प्राकृतिक उत्पादों के बायोमोड्यूलिंग गुणों को मापने के लिए एक प्लैनेरियन मोटिविटी परख

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

मानव कोशिकाओं में अंतर्जात फॉस्फोराइलेटेड स्टेट प्रोटीन के मापन के लिए समय-हल Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण Assays

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर के लिए स्क्रीन करने के लिए निरंतर फ्लोरेसेंस-आधारित एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित डीएनए मिथाइलेशन परख

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

इन विट्रो विश्लेषणात्मक, पुल-डाउन और चैपरोनिंग परख का उपयोग करके हिस्टोन चैपरोन का लक्षण वर्णन

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...