Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

نشكر فونداساو دي أمبارو بيسكيسا دو استادو دي ساو باولو (FAPESP، من خلال غرانت تيماتيكو 2017/03489-1 إلى JK وزمالة إلى FLB 2018/05350-3) وConselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) لتمويل هذا البحث. نود أن نشكر الدكتور أدريان كراينر على توفير البلازميد pMTE1A وZerler وزملاؤه لعملهم في الاستنساخ E1A. كما نشكر البروفيسورة باتريسيا موريل، والأستاذة الدكتورة واندا بيريرا ألميدا، والبروفيسور الدكتور مارسيلو لانسيلوتي، والبروفيسورة الدكتورة كارينا كوغو كوغو مولر للسماح لنا باستخدام مساحة ومعدات مختبرهم.

1. الخلايا الطلاء
ملاحظة: في هذا البروتوكول الموصوف، HEK293 خطوط الخلايا مستقرة، ولدت سابقا للتعبير غير قابل للانستقراء من Nek4 استخدمت21،ومع ذلك، فإن البروتوكول نفسه هو مناسبة لكثير من خطوط الخلايا الأخرى، مثل HEK29322،HeLa23،24،</s...

<ol>
	<li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+Regulatory+Networks:+Functions,+Mechanisms,+and+Evolution.">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing.">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li><li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing:+a+new+dimension+of+the+human+genome.">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Misteli, T., C&#225;ceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo.">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li><li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins.">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li><li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells.">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).</li><li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells.">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li><li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis.">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li><li>Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer.">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li><li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells.">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li><li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts:+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3'+splice+site.">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li><li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins.">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li><li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties.">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li><li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs.">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li><li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusj&#228;rvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential.">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li><li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms:+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing.">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus.">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li><li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival.">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li><li>Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4.">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).</li><li>Jarn&#230;ss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+Factor+Arginine/Serine-rich+17A+(SFRS17A)+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments.">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li><li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+of+human+Ki-1/57+with+pre-mRNA+splicing+events.">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li><li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2.">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).</li><li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+gel:+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality.">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+3'+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF/SF2+and+hnRNP+A1.">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li><li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT/CGRP+precursor+mRNA.">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li></ol>

Minigenes هي أدوات هامة لتحديد الآثار في الربط البديل العالمي في الجسم الحي. وقد استخدمت adenoviral minigene E1A بنجاح لعقود لتقييم دور البروتينات عن طريقزيادة كميةهذه في الخلية 13,14. هنا، نقترح استخدام E1A minigene لتقييم الربط البديل بعد التعرض للعلاج الكيميائي. تم استخدام خط ...

الربط هو من بين أهم الخطوات في معالجة الحمض النووي الريبي eukaryotic الذي يحدث في وقت واحد إلى 5'mRNA توج و3'mRNA polyadenylation، تتألف من إزالة intron تليها تقاطع exon. الاعتراف مواقع الربط (SS) من قبل الربط، وهو مجمع ريبونوكليوبروتين تحتوي على البروتينات الريبونوكليوبروتين الصغيرة (snRNP U1، U2، U4 و U6)، والحمض النووي الريبي الصغيرة (snRNAs) والعديد من البروتينات التنظيمية1 ضروري للربط.
إلى جانب إزالة intron (الربط التأسيسي) ، في eukaryotes ، يمكن الاحتفاظ introns ويمكن استبعاد exons ، وتكوين عملية تسمى mRNA الربط البديل (AS). توسيع الربط البديل قبل مرنا القدرة على الترميز من الجينوم eukaryotic السماح لإنتاج عدد كبير ومتنوع من البروتينات من عدد قليل نسبيا من الجينات. وتشير التقديرات إلى أن 95-100٪ من mRNAs الإنسان التي تحتوي على أكثر من exon واحد يمكن أن تخضع للصق بديل2،3. وهذا أمر أساسي للعمليات البيولوجية مثل تطوير الخلايا العصبية، وتنشيط موت الخلايا المبرمج واستجابة الإجهاد الخلوي4،وتوفير بدائل الكائن الحي لتنظيم عمل الخلية باستخدام نفس ذخيرة الجينات.
الآلات اللازمة للربط البديل هي نفسها المستخدمة في الربط التأسيسي واستخدام SS هو المحدد الرئيسي لحدوث الربط البديل. الربط التأسيسي يرتبط باستخدام مواقع الربط القوية ، والتي عادة ما تكون أكثر تشابها مع الزخارف التوافقية للاعتراف باللصق5.
وعادة ما يتم التعرف على exons البديلة أقل كفاءة من exons التأسيسية مرة واحدة في رابطة الدول المستقلة- العناصر التنظيمية ، وتسلسل في 5 SS و 3 SS يحيط هذه exons ، وتظهر قدرة ملزمة أدنى إلى الربط. يحتوي مرنا أيضا على مناطق تسمى القدرة أو كواتم الصوت الموجودة في exons (معززات الربط exonic (ESEs) وكاتم الصوت اللصق exonic (ESSs)) و introns (القدرة على الربط intronic (ISEs) وكاتم الصوت الربط intronic (ISSs)) التي تعزز أو قمع استخدام exon، على التوالي5. يتم التعرف على هذه التسلسلات من خلال العناصر العابرة للتنظيم، أو عوامل الربط (SF). يتم تمثيل SFs بشكل رئيسي من قبل عائلتين من البروتينات ، وعوامل الربط الغنية بالسرين / الأرجينين (SRSFs) التي ترتبط ب ESEs وعائلة البروتينات الريبونوكليوبروتية النووية غير المتجانسة (hnRNPs) التي ترتبط بتسلسل ESSs5.
يمكن تعديل الربط البديل عن طريق الفوسفور / إزالة الفوسفور من العوامل العابرة لتعديل شركاء التفاعلات والتوطين الخلوي لعوامل الربط6و7و8. ويمكن أن يوفر تحديد منظمين جدد لعوامل الربط أدوات جديدة لتنظيم الربط، وبالتالي بعض علاجات السرطان.
أنوفرييفا وآخرون.9, في صورة التعبير الجيني ميكروراي مرنا, لاحظت تغييرات متسقة في مستويات المكونات اللصق في 101 خطوط الخلية وبعد ظروف الإجهاد المختلفة (الأدوية القائمة على البلاتين, تشعيع غاما, مثبطات توبويسوميراز, مثبطات كيناز التيروزين والتكسير). العلاقة بين نمط الربط وفعالية العلاج الكيميائي وقد ثبت بالفعل في خلايا سرطان الرئة, التي هي مقاومة للعلاج الكيميائي, تظهر تغييرات في المتغيرات caspase-9 معدل10. تظهر خلايا HEK293 المعالجة بلوحة العلاج الكيميائي تغييرات في الربط مع زيادة في المتغيرات المؤيدة للبوبتوتيك. ولاحظ غابرييل وآخرون11 تغيرات في ما لا يقل عن 700 حدث من أحداث الربط بعد علاج سيسبلاتين في خطوط الخلايا المختلفة، مشيرا إلى أن مسارات الربط تتأثر سيسبلاتين. وقد أظهرت التشكيلات الربط بالفعل النشاط المضاد للورم، مما يدل على أن الربط مهم للتنمية الورمية، وأساسا، استجابة العلاج الكيميائي12. وبالتالي ، فإن توصيف البروتينات الجديدة التي تنظم الربط بعد عوامل الإجهاد الخلوية ، مثل العلاج الكيميائي ، مهم جدا لاكتشاف استراتيجيات جديدة للعلاج.
يمكن أن تتطلب أدلة تنظيم الربط البديل من دراسات interactome ، ذات الأهمية الخاصة لتوصيف وظائف البروتينات الجديدة أو غير المكصرة ، نهجا أكثر عمومية وبساطة للتحقق من الدور الحقيقي للبروتين في AS. Minigenes هي أدوات هامة لتحليل الدور العام للبروتين التي تؤثر على تنظيم الربط. أنها تحتوي على أجزاء من جين الفائدة التي تحتوي على مناطق الجينوم مقسمة بدلا من ذلك ويحيط13. استخدام أداة minigene يسمح تحليل الربط في الجسم الحي مع العديد من المزايا مثل طول minigene الذي هو طفيف، وبالتالي ليس قيدا على رد فعل تضخيم; يمكن تقييم نفس المينيجين في خطوط الخلايا المختلفة؛ جميع المكونات الخلوية، وأساسا تعديل ما بعد الترجمة تنظيم (الفوسفور والتغيرات في مقصورات الخلية) موجودة ويمكن معالجتها13،14. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة التغيرات في نمط الربط البديل بعد الإجهاد الخلوي، واستخدام نظام مينيجين، تسمح لتحديد المسار الذي يتم تحويره من قبل محفزات مختلفة.
هناك العديد من أنظمة minigene الموصوفة بالفعل والتي هي محددة لأنواع مختلفة من الأحداث الربط13،14، ومع ذلك ، كخبار أولي ، فإن minigene E1A15 هو نظام مراسل الربط البديل الراسخ للغاية لدراسة اختيار 5 SS في الجسم الحي. من جين واحد فقط، E1A، يتم إنتاج خمسة mRNAs بواسطة الربط البديل على أساس اختيار ثلاثة مواقع مختلفة 5' لصق واحد رئيسي أو واحد طفيفة 3' لصق الموقع16،17،18. التعبير عن المتغيرات E1A يتغير وفقا لفترة العدوى الغدية19،20.
لقد أظهرنا سابقا أن كلا من isoforms Nek4 تتفاعل مع عوامل الربط مثل SRSF1 وhnRNPA1 وعلى الرغم من isoform 2 التغييرات minigene E1A الربط البديل، isoform 1 ليس له أي تأثير في ذلك21. لأن isoform 1 هو isoform الأكثر وفرة ويغير مقاومة العلاج الكيميائي والاستجابة للتلف الحمض النووي، ونحن تقييم ما إذا كان يمكن تغيير الربط البديل E1A minigene في حالة الإجهاد.
الفحص مينيجين هو بسيط، منخفضة التكلفة وطريقة سريعة، لأنه يحتاج فقط استخراج الحمض النووي الريبي، توليف cDNA، تضخيم وجل agarose التحليلات، ويمكن أن يكون أداة مفيدة لتقييم منذ تأثير محتمل على الربط البديل من قبل بروتين المصالح حتى تأثير العلاجات المختلفة على نمط الربط البديل الخلوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

تتضمن معالجة الحمض النووي الريبي خطوات متعددة في وقت واحد لإعداد مرنا للترجمة، مثل 5'capping، إضافة متعددة A والربط. وإلى جانب الربط التأسيسي، يسمح الربط البديل من الحمض النووي الريبي بالتعبير عن البروتينات متعددة الوظائف من جين واحد. كما دراسات interactome عموما التحليل الأول للبروتينات الجديدة أو غير معروفة، وارتباط بروتين الطعم مع عوامل الربط هو مؤشر على أنه يمكن أن تشارك في عملية الربط ميرنا، ولكن لتحديد في أي سياق أو ما هي الجينات التي تنظم هي عملية تجريبية. نقطة انطلاق جيدة لتقييم هذه الوظيفة هو استخدام أداة مينيجين الكلاسيكية. هنا نقدم استخدام مينيجين E1A أدينوفيرالي لتقييم التغييرات الربط البديلة بعد محفزات الإجهاد الخلوية المختلفة. قمنا بتقييم الربط من E1A minigene في HEK293 الإفراط في التعبير عن بروتين Nek4 بعد علاجات الإجهاد المختلفة. ويشمل البروتوكول E1A minigene transfection، والعلاج الخلوي، واستخراج الحمض النووي الريبي وتوليف cDNA، تليها PCR وتحليل هلام وتكميم المتغيرات E1A مقسمة. استخدام هذه الطريقة البسيطة والراسخة جنبا إلى جنب مع علاجات محددة هو نقطة انطلاق موثوقة لتسليط الضوء على العمليات الخلوية أو ما هي الجينات التي يمكن تنظيمها عن طريق الربط ميرنا.

تم إجراء فحص مواقع الربط 5 'باستخدام E1A minigene لتقييم التغيرات في ملف تعريف الربط في الخلايا بعد معرض العلاج الكيميائي. تم تقييم دور Nek4 - isoform 1 في تنظيم AS في خلايا HEK293 المستقرة بعد علاج باكليتاكسيل أو سيسبلاتين.
11- تعتبر منطقة أدينوفيرالي E1A مس?...

Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

يقدم هذا البروتوكول أداة سريعة ومفيدة لتقييم دور البروتين مع وظيفة غير مطهرة في تنظيم الربط البديل بعد العلاج الكيميائي.

استخدام أداة E1A Minigene لدراسة تغييرات الربط مرنا

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

الهدف العام لهذا البروتوكول هو تقديم إرشادات مفصلة لاستخدام E1A2 minigene لتقييم التغييرات العالمية في الربط بين الحمض النووي الريبي. هذه أداة سريعة وغير مكلفة وبسيطة لتقييم وظيفة البروتين المستهدف في تنظيم الربط البديل دون الحاجة إلى أنظمة خاصة أو ظروف مختبرية. ابدأ بزراعة خلايا HEK 293 مع تعبير مستقر عن جين الاهتمام.تقسيم الخلايا باستخدام 0.25٪ تريبسين EDTA، ثم لوحة 300، 000 الخلايا لكل بئر في لوحات ست آبار واحتضانها لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة، تحقق من التقاء، وخلايا مستقرة HEK 293 transfect فقط عندما التقاء 70 إلى 80٪. إزالة بعناية وسط ثقافة الخلية مع ماصة، ثم إضافة اثنين من ملليلتر من المتوسط DMEM كاملة دون المضادات الحيوية ووضع لوحة مرة أخرى في الحاضنة.إعداد أنبوب مع العازلة transfection، ثم إضافة ميكروغرام اثنين من الحمض النووي pMTE1A، دوامة، وإضافة اثنين من ميكرولتر من كاشف العدوى. دوامة مرة أخرى واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة لوحات من الحاضنة وإضافة بعناية خليط العدوى قطرة الحكمة.بعد ست ساعات من العدوى، أضف التتراسيكلين إلى خلايا HEK 293 المستقرة لتحريض تعبير Nek4. بعد 24 ساعة من العدوى، تحقق من مورفولوجيا الخلايا وكفاءة العدوى باستخدام المجهر الفلوري. استخدام ماصة لإزالة الخلايا ثقافة المتوسطة، ثم إضافة خلية الثقافة المتوسطة مع العلاج الكيميائي.احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. لجمع الحمض النووي الريبي، تجاهل الخلايا ثقافة المتوسطة، وإضافة 0.5 إلى 1 ملليلتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة إلى البئر. إذا كانت الآبار التقاء جدا، استخدم ملليلتر واحد من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي لتحسين جودة الحمض النووي الريبي.تجانس الخلايا مع ماصة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. انتقل على الفور إلى استخراج الحمض النووي الريبي، أو تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية. إذابة العينات في غطاء الدخان واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.أضف 0.1 إلى 0.2 ملليلتر من الكلوروفورم وحرض بقوة، ثم احتضن لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12، 000 مرة G وأربع درجات مئوية، ثم جمع المرحلة المائية العليا ونقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد 1.5 ملليلتر. جمع حوالي 60٪ من الحجم الإجمالي، ولكن لا تجمع الحمض النووي أو المرحلة العضوية.إضافة 0.25 إلى 0.5 ملليلتر من ايزوبروبانول وتهيج العينة عن طريق عكس أربع مرات. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي في 12،000 مرة G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية والتخلص من supernatant. غسل بيليه الحمض النووي الريبي مرتين مع الإيثانول، والطرد المركزي في 7، 500 مرة G لمدة خمس دقائق، ثم التخلص من الإيثانول.إزالة الإيثانول الزائد عن طريق عكس الأنبوب على منشفة ورقية، ثم ترك الأنبوب مفتوحا داخل غطاء الدخان لتجفيف جزئيا بيليه لمدة خمس إلى 10 دقائق. إعادة تعليق بيليه الحمض النووي الريبي في 15 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC. قياس إجمالي الحمض النووي الريبي والتحقق من جودة الحمض النووي الريبي عن طريق قياس الامتصاص عند 230 و260 و280 نانومتر.للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي الكلي، قم بتشغيل جل 1٪ agarose المعالج مسبقا مع 1.2٪ من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 2.5٪ لمدة 30 دقيقة. إجراء توليف cDNA باستخدام واحد إلى اثنين ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الكلي. الجمع بين الجيش الملكي النيبالي، واحد ميكرولتر من أوليغو d-T، ميكرولتر واحد من DNTP، والمياه الخالية من النيوكليز إلى 12 ميكرولتر.احتضان رد الفعل في الدورة الحرارية لمدة خمس دقائق في 65 درجة مئوية. إزالة عينات من دورة الحرارية، وإضافة أربعة ميكرولترات من العازلة النسخ العكسي، واثنين من microliters من DTT، وميكرليتر واحد من مثبط ريبونوكليز. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.أضف ميكرولتر واحد من النسخ العكسي المستقر حراريا، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. تعطيل الانزيم في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. نفذ PCR كما هو موضح في المخطوطة النصية، ثم قم بتحميل 20 إلى 25 ميكرولتر من منتج PCR على هلام agarose بنسبة 3٪ يحتوي على وصمة عار حمض النيوكليك، وتشغيله بسرعة 100 فولت لمدة ساعة تقريبا.تصوير الجل ، وتجنب أي تشبع الفرقة ، وتحديد النطاقات باستخدام برنامج معالجة الصور. العصابات في 631، 493، و 156 أزواج قاعدة تتوافق مع 13S، 12S، و 9S isoforms على التوالي. من قائمة ملف البرنامج، افتح ملف الصورة وحوله إلى مقياس رمادي.ضبط السطوع والتباين، ثم إزالة الضوضاء المتطرفة إذا لزم الأمر. رسم مستطيل حول المسار الأول باستخدام أداة تحديد المستطيل، وحدده من خلال الأمر تحليل، وGels، وحدد المسار الأول، أو باستخدام اختصار لوحة المفاتيح. استخدام الماوس للنقر مع الاستمرار في منتصف المستطيل على الممر الأول، واسحبه إلى حارة المقبل.انتقل إلى تحليل، والمواد الهلامية، وحدد حارة التالي. كرر هذه الخطوة لجميع الممرات المتبقية. بعد أن يتم تمييز جميع الممرات ورقمها ، انتقل إلى تحليل ، وGels ، و Plot Lanes لرسم مؤامرة ملف شخصي لكل حارة.استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لرسم خط عبر قاعدة كل قمة ، مقابلة لكل نطاق ، مما يترك ضوضاء الخلفية. بعد أن تم إغلاق جميع القمم من كل حارة ، حدد أداة العصا وانقر داخل كل قمة. يجب أن تظهر القياسات في نافذة النتائج لكل قمة مميزة.ولنتأمل هنا فقط قمم 13S و12S و9S التي تتوافق مع نطاقات أزواج 631 و493 و156 قاعدة. نسخ بيانات كثافة محرر جدول بيانات، وتلخيص كثافة من كافة النطاقات الثلاثة لكل عينة، ثم حساب النسبة المئوية لكل isoform نسبة إلى الإجمالي. رسم النسب المئوية لكل isoform، أو الاختلافات في النسبة المئوية بالنسبة للعينات غير المعالجة.تم استخدام البلازميد الذي يحتوي على مينيجين من E1A لمراقبة التأثير على الربط البديل من خلال تقييم نسبة الحمض النووي الريبي من كل isoform المنتجة. التعبير القاعدي للمتغيرات ISOFORMS E1A تعتمد على خط الخلية والوقت للتعبير E1A. خط الخلية المستقر HEK 293 ، أو HEK 293 recombinase الذي يحتوي على موقع ، أظهر تعبيرا أعلى عن 13S بالمقارنة مع خلايا HeLa ، ولكنه أظهر مستويات مماثلة من 13S و 12S isoforms بعد 48 ساعة من التعبير E1A.وأظهرت الخلايا المعرضة لcisplatin تحولا في خمسة رئيس S-S الربط اختيار لصالح التعبير 12S. وقد لوحظ هذا التأثير في HEK 293 التعبير عن ستابلي ناقلات العلم فارغة، فضلا عن isoform واحدة من Nek4. كانت التغييرات في الربط البديل بعد علاج باكليتاكسيل متحفظة للغاية ، ولكن اتجاهات التغييرات كانت معاكسة في Flag و Nek4 تعبر عن الخلايا.عند تنفيذ هذا البروتوكول، من المهم استخدام عناصر تحكم النسخ غير المصابة وغير العكسية لتجنب سوء التفسير مع التعبير E1A الذاتية، وذلك بشكل رئيسي عند استخدام خلايا HEK 293. بعد الحصول على نتائج إيجابية، يمكن تقييم الربط البديل لجينات محددة تتعلق بالاستجابة للعلاج الكيميائي. عندما يلاحظ بعض التأثير، يمكن لهذا البروتوكول البسيط توجيه هذه الدراسات إلى مسارات أكثر اتساقا، حيث يلعب البروتين دورا في تنظيم الربط البديل في استجابة العلاج الكيميائي، على سبيل المثال.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

الشرطي ضربة قاضية للتعبير الجيني في خطوط خلايا السرطان لدراسة توظيف حيدات/الضامة إلى ورم المكروية

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

باستخدام المقايسة دوت لتحليل هجرة أوراق الخلية

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

تجفف الدم والبقع المصل كأداة مفيدة لتخزين نموذج لتقييم المؤشرات الحيوية السرطان

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

استخدام التصوير PET/CT فدج و 18والأنسجة الكمية لقياس التغيرات الدينامية في استقلاب الجلوكوز في نماذج الماوس من سرطان الرئة

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

نموذج سرطان البنكرياس سينجينيك ماوس دراسة آثار انهانسر لا رجعة فيه

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

استخدام غشاء Chorioallantoic الدجاج في نموذج Vivo لدراسة أمراض النساء وسرطان المسالك البولية

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

حقن الوريد البابي لسرطان القولون والمستقيم العضوي لدراسة سدى ورم خبيث في الكبد

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...