Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
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我们感谢圣保罗埃斯塔多·安帕罗基金会（FAPESP， 通过格兰特·特梅蒂科 2017/03489-1 到 JK 和研究金 FLB 2018/05350-3） 和康塞略国家德森沃尔维托科学公司 （CNPq） 资助这项研究。我们要感谢阿德里安·克雷纳博士提供了pMTE1A质粒和泽勒及其同事在E1A克隆方面所做的工作。我们还要感谢帕特里西亚·莫里尔教授、万达·佩雷拉·阿尔梅达教授、马塞洛·兰斯洛蒂教授和卡琳娜·科戈·科戈·穆勒教授允许我们使用他们的实验室空间和设备。

1. 电镀细胞
注：在此描述的协议中，HEK293稳定细胞系，以前生成的稳定诱导表达Nek4被使用21，但是，相同的协议是适合许多其他细胞系，如HK29322，HeLa23，24，25，26，U-2OS27，COS728，SH-SY5Y29。?...

<ol>
	<li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+Regulatory+Networks:+Functions,+Mechanisms,+and+Evolution.">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. 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微基因是确定全球替代拼接在体内的影响的重要工具。腺微基因E1A已经成功地使用了几十年，通过增加这些在细胞13，14中的数量来评估蛋白质的作用。在这里，我们建议使用微型E1A来评估化疗暴露后的替代拼接。使用了表达Nek4等离子体1的稳定细胞线，避免了瞬态瞬态感染引起的过度表达。Nek4的同位素1在基础条件下的微基因E1A替代拼...

拼接是真核 mRNA 处理中最重要的步骤之一，同时发生到 5mRNA 封顶和 3mRNA 聚腺化，包括内电拆除，然后是外向结。拼接点 （SS） 的识别由拼接体， 核糖核蛋白复合物包含小核糖核蛋白 （snRNP U1， U2， U4 和 U6）， 小RNA （snRNA） 和几个调节蛋白1 是拼接的必要条件。
除了内电拆卸（构成拼接），在真核生物中，可以保留内子，可以排除外在，配置称为 mRNA 替代拼接 （AS） 的过程。替代的mRNA前拼接扩展了真核基因组的编码能力，允许从相对较少的基因中产生大量和多样化的蛋白质。据估计，95-100%的含有多个外在物的人类mRNA可以进行替代拼接2，3。这是神经元发育、凋亡活化和细胞应激反应4等生物过程的基础，为生物体提供了利用相同的基因来调节细胞功能的替代方案。
替代拼接所需的机械与构成拼接所用的机械相同，SS 的使用是替代拼接发生的主要决定因素。构成拼接与使用强拼接点有关，通常更类似于拼接体识别5的共识主题。
替代外显子通常比构成外显子识别效率低，一旦其 cis-监管元素，在 5 的 SS 和 3 的 SS 的序列侧翼这些外显子，显示对拼接体的低级绑定能力。mRNA 还包含位于外显子（外显电拼接增强剂 （ESEs） 和外显拼接消音器 （ESS） 和 introns（内电拼接增强器 （ISEs） 和内生拼接消音器 （ISS） 中的指定增强器或消音器的区域，分别增强或抑制外显子的使用。这些序列由跨监管元素或拼接因子 （SF） 识别。SF主要由两种蛋白质家族表示，血清/精氨酸丰富的拼接因子（SRSF）与ESE结合，异质核核核蛋白（hnRNPs）家族与ESS序列5结合。
替代拼接可以通过磷酸化/脱磷的跨因子改变相互作用伙伴和细胞定位拼接因子6，7，8调节。识别拼接因子的新调节器可以提供新的工具来调节拼接，从而提供一些癌症治疗。
Anufrieva等人在mRNA微阵列基因表达特征中观察到101个细胞系中拼接体成分水平和不同应激条件（铂基药物、伽马辐照、托波索酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和分类酶）后的一致变化。拼接模式与化疗疗效的关系已经在肺癌细胞中得到证明，肺癌细胞具有抗化疗作用，显示 caspase-9 变异率10的变化。HEK293细胞用化疗面板治疗显示，随着亲凋零变种的增加，拼接的变化。Gabriel 等人11观察了不同细胞系中经酸铂处理后至少 700 个拼接事件的变化，指出拼接通路受顺铂影响。拼接调制剂已经显示出抗肿瘤活性，表明拼接对肿瘤发育很重要，主要是化疗反应12。因此，描述细胞压力剂剂（如化疗）后调节拼接的新蛋白质对于发现新的治疗策略非常重要。
相互作用研究中替代拼接调节的线索，特别是对描述新蛋白质或非特异性蛋白质的功能非常重要，可能需要一种更通用、更简单的方法来验证蛋白质在AS中的实际作用。微基因是分析影响拼接调节的蛋白质的一般作用的重要工具。它们包含来自兴趣基因的片段，其中包含其他拼接和侧翼基因组区域13。使用微型工具可以分析体内拼接，具有若干优点，例如微小的微基因长度，因此不会限制放大反应：同一微基因可以在不同的细胞系中进行评估;所有细胞组件，主要是其调节后转化修改（磷化和细胞隔间的变化）都存在，可以解决13，14。此外，在细胞应激之后，可以观察到替代拼接模式的变化，并且，使用微型系统，可以识别由不同刺激调节的路径。
有几个迷你基因系统已经描述，这是针对不同类型的拼接事件13，14，然而，作为初步的测定，迷你基因E1A15是一个非常成熟的替代拼接记者系统，用于研究5的SS选择在体内。仅从一个基因，E1A，五个mRNA是由替代拼接的基础上，选择三个不同的5+拼接点和一个主要或一个小的3+拼接站点16，17，18。E1A变异的表达方式根据腺病毒感染期19、20而变化。
我们以前已经表明，Nek4等离子体与拼接因子（如 SRSF1 和 hnRNPA1）相互作用，虽然等形 2 改变了迷你基因 E1A 替代拼接，但等离子体 1 在这21中没有影响。由于等离子体1是最丰富的等形体，并改变化疗阻力和DNA损伤反应，我们评估它是否可以改变微基因E1A替代拼接在应力条件下。
Minigene 检测是一种简单、低成本和快速的方法，因为它只需要 RNA 提取、cDNA 合成、放大和阿加罗斯凝胶分析，并且可以成为一个有用的工具来评估，因为兴趣蛋白质对替代拼接的可能影响，直到不同处理对细胞替代拼接模式的影响。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

mRNA 处理涉及多个同时步骤，为翻译准备 mRNA，例如 5'封顶、多 A 添加和拼接。除了构成拼接外，替代mRNA拼接还允许从一个基因中表达多功能蛋白质。由于相互作用研究通常是对新蛋白质或未知蛋白质的第一次分析，诱饵蛋白与拼接因子的关联表明它可以参与mRNA拼接过程，但确定在什么情况下或在什么情况下调节基因是一个经验过程。评估此功能的良好起点是使用经典的迷你基因工具。在这里，我们介绍腺卵巢E1A微型基因的用法，用于评估不同细胞应激刺激后的替代拼接变化。我们评估了E1A微基因在 HEK293 中拼接，经过不同的应力处理后，稳定过度表达 Nek4 蛋白质。该协议包括E1A微基因转染、细胞治疗、RNA提取和cDNA合成，然后是PCR和凝胶分析和E1A拼接变种的量化。使用这种简单和成熟的方法与特定的治疗相结合是一个可靠的起点，可以揭示细胞过程或哪些基因可以通过mRNA拼接调节。

使用E1A迷你基因进行了5'拼接位点检测，以评估化疗后细胞拼接轮廓的变化。在评估了 Paclitaxel 或顺铂治疗后，Nek4 - 等形 1 在 HEK293 稳定细胞中的 AS 调节中的作用。
腺体E1A地区负责从一个RNA前体生产三个主要的mRNA，因为使用不同的拼接捐赠者。它们共享共同的 5' 和 3' 术语，但其消费税的大小不同。腺素 E1A mRNA 是根据沉积系?...

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Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

本协议提供了一个快速和有用的工具，用于评估化疗后在替代拼接调节中具有非同寻常功能的蛋白质的作用。

使用 E1A 微型工具研究 mRNA 拼接更改

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

本协议的总体目标是提供详细的指导，以便使用微型 E1A2 来评估全球 mRNA 拼接变化。这是一个快速、廉价和简单的工具，用于评估目标蛋白在替代拼接调节中的功能，而无需特殊制度或实验室条件。首先培养具有稳定表达兴趣基因的 HEK 293 细胞。使用0.25%的EDTA将细胞分割，然后在6井板中每井镀30万个细胞，在37摄氏度的5%二氧化碳中孵育24小时。24 小时后，检查汇合，并在 70 到 80% 汇合时转染 HEK 293 稳定细胞。用移液器小心地去除细胞培养介质，然后加入两毫升完整的DMEM介质，不含抗生素，并将板放回孵化器中。用透射缓冲器准备一根管子，然后加入两微克pMTE1A DNA、涡流，并加入两微升转染试剂。再次漩涡，在室温下孵育10分钟。从孵化器中取出板，小心地加入转染混合物。转染后六小时，将四环素添加到 HEK 293 稳定细胞中，用于 Nek4 表达感应。转染后24小时，使用荧光显微镜验证细胞形态和转染效率。使用移液器去除细胞培养介质，然后使用化疗添加细胞培养介质。再孵育细胞24小时。要收集RNA，丢弃细胞培养基，并直接向井中加入0.5至1毫升RNA提取试剂。如果油井非常汇合，请使用一毫升RNA提取试剂来改善RNA质量。用移液器使细胞同质化，并将其转移到1.5毫升离心机管中。立即进行RNA提取，或将样品储存在零下80摄氏度。将样品解冻在烟气罩中，在室温下孵育五分钟。加入0.1至0.2毫升氯仿，大力搅拌，然后在室温下孵育3分钟。离心机在12，000倍G和4摄氏度下15分钟，然后收集上水相并转移到一个新的1.5毫升离心机管。收集约60%的总体积，但不收集DNA或有机相。加入0.25至0.5毫升的等丙醇，通过倒置四次搅拌样品。在室温下孵育10分钟，然后在12，000次G下离心，在4摄氏度下孵化10分钟，并丢弃超高纳特。用乙醇清洗RNA颗粒两次，离心机用7，500次G清洗5分钟，然后丢弃乙醇。将多余的乙醇倒置在纸巾上，然后将管子放在烟罩内打开，将颗粒部分干燥5至10分钟。将RNA颗粒重新悬浮在DEPC处理水的15微升中。通过测量 230、260 和 280 纳米的吸收量来量化总RNA 并验证 RNA 质量。为了验证RNA总质量，使用2.5%的次氯酸钠溶液的1.2%预处理1%的玫瑰凝胶，持续30分钟。使用总RNA的一到两微克执行 cDNA 合成。将RNA、一个寡头d-T微升、一个DNTP微升和无核酸酶水组合到12微升。在65摄氏度的温度下，在热循环器中孵化反应5分钟。从热循环器中取出样品，加入四个反转录酶缓冲器的微升、DTT 的两个微升和核素酶抑制剂的一个微升。在37摄氏度下孵育两分钟。加入一微升热稳定反转录酶，在37摄氏度下孵育50分钟。在 70 摄氏度下灭活酶 15 分钟。执行文本手稿中描述的 PCR，然后将 PCR 产品的 20 到 25 微升加载到含有核酸污渍的 3%玫瑰凝胶上，然后以 100 伏特的速度运行约一小时。拍摄凝胶，避免任何带饱和，并使用图像处理软件量化带。631、493 和 156 基对的波段分别对应于 13S、12S 和 9S 等同形。从软件的文件菜单，打开图像文件，并将其转换为灰色刻度。调整亮度和对比度，必要时消除离群值噪声。使用矩形选择工具在第一车道周围绘制矩形，然后通过分析、凝胶和选择第一车道命令或使用键盘快捷方式选择它。使用鼠标单击并按住第一车道上的矩形中间，然后将其拖至下一条车道。去分析，凝胶，并选择下一个车道。对于所有剩余车道重复此步骤。在突出显示和编号所有车道后，请前往分析、凝胶和情节车道，绘制每个车道的轮廓图。使用直线选择工具绘制一条线穿过每个峰值的基座，对应于每个波段，排除背景噪声。在关闭所有车道的峰值后，选择魔杖工具并单击每个峰值内。每个高亮峰值的结果窗口中应弹出测量结果窗口。仅考虑 13S、12S 和 9S 峰值，对应于 631、493 和 156 基对频段。复制电子表格编辑器的强度数据，并汇总每个样本的所有三个频段的强度，然后计算每个等形体相对于总数的百分比。绘制每个等形的百分比，或相对于未经处理的样本的百分比差异。含有E1A微基因的质粒用于通过评估每个同位素产生的mRNA比例来观察对替代拼接的影响。E1A 等形变异的基础表达取决于 E1A 表达的细胞线和时间。HEK 293 稳定细胞系（HEK 293 重组包含站点）与 HeLa 细胞相比显示较高的 13S 表达，但在 E1A 表达 48 小时后显示类似级别的 13S 和 12S 等形。暴露在顺铂下的细胞显示，5个优质S-S拼接选择的转变有利于12S表达。这种效果在 HEK 293 中观察到稳定地表示旗空矢量，以及 Nek4 中的等形之一。在帕利塔塞尔治疗后，替代拼接的变化是非常谨慎的，但变化的方向在旗和Nek4表达细胞相反。执行此协议时，使用未翻译和非反向转录酶控制以避免对内源性 E1A 表达的误解非常重要，主要是在使用 HEK 293 细胞时。获得阳性结果后，可以评估与化疗反应相关的特定基因的替代拼接。观察到某些效果后，这种简单的协议可以引导这些研究获得更一致的通路，例如，蛋白质在调节化疗反应中的替代拼接方面发挥作用。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

共培养化验，以研究胶质母细胞瘤入侵的巨噬细胞和小胶质细胞刺激

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

科研

癌症研究

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

肿瘤细胞系基因表达的条件性击倒研究单核/巨噬细胞在微环境中的招募

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

用点法分析细胞板的迁移

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

干血和血清斑点作为样品贮存的有用工具, 用于评估肿瘤生物标志物

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

利用18f-葡萄糖 PET/CT 成像和定量组织学测量肺癌小鼠模型葡萄糖代谢的动态变化

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

自体胰腺癌小鼠模型研究不可逆电穿孔的影响

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

活体细胞成像技术研究胶质瘤脑干细胞的迁移和侵袭

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

体外测定研究肿瘤-巨噬菌体相互作用

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

利用活体中鸡胆膜研究妇科和泌尿癌

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

门静脉注射结直肠癌类器官研究肝转移基质

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...