Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Vi takker Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, gennem Grant Temático 2017/03489-1 til JK og stipendium til FLB 2018/05350-3) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) til finansiering af denne forskning. Vi vil gerne takke Dr. Adrian Krainer for at give pMTE1A plasmid og Zerler og kolleger for deres arbejde i E1A kloning. Vi takker også prof. Dr. Patrícia Moriel, prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, prof. Dr. Marcelo Lancellotti og prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller for at give os mulighed for at bruge deres laboratorieplads og udstyr.

1. Plating celler
BEMÆRK: I denne beskrevne protokol blev HEK293 stabile cellelinjer, der tidligere blev genereret til stabilt indukbelt udtryk for Nek4, brugt21, men den samme protokol er egnet til mange andre cellelinjer, såsom HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728...

<ol>
	<li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+Regulatory+Networks:+Functions,+Mechanisms,+and+Evolution.">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing.">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li><li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing:+a+new+dimension+of+the+human+genome.">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Misteli, T., C&#225;ceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo.">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li><li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins.">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li><li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells.">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).</li><li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells.">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li><li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis.">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li><li>Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer.">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li><li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells.">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li><li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts:+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3'+splice+site.">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li><li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins.">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li><li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties.">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li><li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs.">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li><li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusj&#228;rvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential.">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li><li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms:+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing.">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus.">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li><li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival.">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li><li>Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4.">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).</li><li>Jarn&#230;ss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+Factor+Arginine/Serine-rich+17A+(SFRS17A)+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments.">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li><li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+of+human+Ki-1/57+with+pre-mRNA+splicing+events.">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li><li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2.">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).</li><li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+gel:+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality.">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+3'+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF/SF2+and+hnRNP+A1.">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li><li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT/CGRP+precursor+mRNA.">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li></ol>

Minigener er vigtige værktøjer til at bestemme virkningerne i den globale alternative splejsning in vivo. Den adenoviral minigene E1A er blevet brugt med succes i årtier til at evaluere proteiners rolle ved at øge mængden af disse i celle13,14. Her foreslår vi minigene E1A brug til evaluering af alternativ splejsning efter kemoterapieksponering. En stabil cellelinje, der udtrykker Nek4 isoform 1, blev brugt, så man undgik artefakter af overekspression for?...

Splejsning er blandt de vigtigste trin i eukaryote mRNA-behandling, der sker samtidigt til 5'mRNA-udjævning og 3'mRNA polyadenylering, bestående af intronfjernelse efterfulgt af exon-krydset. Det splejsningssteders (SS) anerkendelse af splejsningsstederne, et ribonukleoproteinkompleks, der indeholder små ribonukleoproteiner (snRNP U1, U2, U4 og U6), små RNA'er (snRNA'er) og flere regulerende proteiner1 er nødvendige for splejsning.
Ud over intronfjernelse (konstituerende splejsning) kan introner i eukaryoter bevares, og exoner kan udelukkes, hvilket konfigurerer processen kaldet mRNA-alternativ splejsning (AS). Den alternative præ-mRNA splejsning udvider kodning kapacitet eukaryote genomer gør det muligt at producere et stort og forskelligartet antal proteiner fra et relativt lille antal gener. Det anslås , at 95-100% af humane mRNA'er , der indeholder mere end én exon , kan gennemgå alternativ splejsning2,3. Dette er grundlæggende for biologiske processer som neuronal udvikling, apoptoseaktivering og cellulær stressrespons4, der giver organismens alternativer til at regulere cellefunktion ved hjælp af det samme repertoire af gener.
De maskiner, der er nødvendige for alternativ splejsning, er de samme, der anvendes til konstituerende splejsning, og brugen af SS er den vigtigste afgørende faktor for alternativ splejsning. Konstituerende splejsning er relateret til brugen af stærke splejsningssteder, som normalt mere ligner konsensusmotiver til splejsning afanerkendelse 5.
Alternative exons er typisk anerkendt mindre effektivt end konstituerende exons når dens cis-regulerendeelementer, sekvenserne i 5'SS og 3'SS flankerende disse exons, viser en ringere bindende kapacitet til splejsning. mRNA indeholder også regioner med navnet forstærkere eller lyddæmpere beliggende i exons (exonic splejsning forstærkere (ESEs) og exonic splejsning lyddæmpere (ESSs)) og introner (intronic splejsning forstærkere (ISEs) og intronic splejsning lyddæmpere (ISSs)), der forbedrer eller undertrykke exon brug, henholdsvis5. Disse sekvenser genkendes af transregulerende elementer eller splejsningsfaktorer (SF). SF'er repræsenteres hovedsageligt af to proteinfamilier, de serin-/argininrige splejsningsfaktorer (SRSF'er), der binder sig til EES og familien af heterogene nukleare ribonukleoproteiner (hnRNP'er), som binder sig til ESS-sekvenser5.
Alternativ splejsning kan moduleres ved fosforylering/ dephosphorylering af transfaktorer , der ændrer interaktionspartnerne , og cellulær lokalisering af splejsningsfaktorer6,7,8. Identifikation af nye regulatorer af splejsningsfaktorer kan give nye værktøjer til at regulere splejsning og dermed nogle kræftbehandlinger.
Anufrieva et al.9observerede i en mRNA-mikroarray-genekspressionsprofil konsekvente ændringer i niveauer af splejseosomale komponenter i 101 cellelinjer og efter forskellige stressforhold (platinbaserede lægemidler, gammabestråling, topoisomerase-hæmmere, tyrosinkinasehæmmere og taxanes). Forholdet mellem splejsning mønster og kemoterapi effekt er allerede blevet påvist i lungekræft celler, som er kemoterapi resistente, viser ændringer i caspase-9 varianter sats10. HEK293 celler behandlet med kemoterapeutiske panel viser ændringer i splejsning med en stigning i pro-apptotiske varianter. Gabriel et al.11 observerede ændringer i mindst 700 tilfælde af splejsning efter cisplatinbehandling i forskellige cellelinjer og påpegede, at splejsningsveje er cisplatin-påvirket. Splejsning modulatorer har allerede vist anti-tumoral aktivitet, viser, at splejsning er vigtigt at tumoral udvikling og, hovedsagelig, kemoterapi respons12. Derfor er det meget vigtigt at karakterisere nye proteiner, der regulerer splejsning efter cellulære stressfaktorer, som kemoterapeutik, for at opdage nye behandlingsstrategier.
Ledetrådene i alternativ splejsning regulering fra interactome undersøgelser, især vigtigt at karakterisere funktioner af nye eller ukarakteriserede proteiner, kan kræve en mere generel og enkel tilgang til at kontrollere den reelle rolle protein i AS. Minigener er vigtige værktøjer til analyse af den generelle rolle af et protein, der påvirker splejsning regulering. De indeholder segmenter af interessegen, der indeholder alternativt splejsede og flankerende genomiske regioner13. Ved hjælp af et minigenværktøj kan analysen af splejsning in vivo med flere fordele såsom længden af minigenet, som er mindre og derfor ikke er en begrænsning af forstærkningsreaktionen; den samme minigen kan evalueres i forskellige cellelinjer; alle cellulære komponenter, hovedsagelig deres regulerende post-translationelle modifikation (fosforylering og ændringer i cellerum) er til stede og kan behandles13,14. Desuden kan ændringer i alternativt splejsningsmønster observeres efter cellulær stress, og brugen af et minigensystem gør det muligt at identificere den vej, der moduleres af forskellige stimuli.
Der er flere minigene systemer, der allerede er beskrevet, som er specifikke for forskellige former for splejsning begivenheder13,14, men som en foreløbig analyse, minigene E1A15 er en meget veletableret alternativ splejsning reporter system til undersøgelse af 5's SS udvælgelse in vivo. Fra kun ét gen, E1A, fem mRNA'er er produceret af alternative splejsning baseret på udvælgelse af tre forskellige 5 'splejsning steder og en større eller en mindre 3 'splejsning site16,17,18. Udtrykket af E1A varianter ændres i henhold til perioden for Adenoviral infektion19,20.
Vi har tidligere vist, at både Nek4 isoformer interagerer med splejsningsfaktorer som SRSF1 og hnRNPA1, og mens isoform 2 ændrer minigen E1A alternativ splejsning, har isoform 1 ingen effekt i den21. Fordi isoform 1 er den mest rigelige isoform og ændrer kemoterapiresistens og DNA-skaderespons, vurderer vi, om det kan ændre minigen E1A alternativ splejsning i en stresstilstand.
Minigene assay er en enkel, billig og hurtig metode, da den kun har brug for RNA-ekstraktion, cDNA-syntese, forstærkning og agarosegelanalyser og kan være et nyttigt værktøj til at evaluere, da en mulig effekt på alternativ splejsning af et protein af interesser indtil virkningen af forskellige behandlinger på cellulært alternativt splejsningsmønster.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

mRNA-behandling involverer flere samtidige trin til at forberede mRNA til oversættelse, såsom 5'udjævning, poly-A-tilsætning og splejsning. Udover konstituerende splejsning giver alternativ mRNA-splejsning mulighed for at udtrykke multifunktionelle proteiner fra et gen. Da interactome-undersøgelser generelt er den første analyse af nye eller ukendte proteiner, er foreningen af agnproteinet med splejsningsfaktorer et tegn på, at det kan deltage i mRNA-splejsningsproces, men at bestemme, i hvilken sammenhæng eller hvilke gener der reguleres, er en empirisk proces. Et godt udgangspunkt for at evaluere denne funktion er at bruge det klassiske minigene værktøj. Her præsenterer vi adenoviral E1A minigene brug for evaluering af alternative splejsning ændringer efter forskellige cellulære stress stimuli. Vi vurderede splejsning af E1A minigene i HEK293 stably overexpressing Nek4 protein efter forskellige stressende behandlinger. Protokollen omfatter E1A minigentransfekt, cellebehandling, RNA-ekstraktion og cDNA-syntese efterfulgt af PCR- og gelanalyse og kvantificering af E1A-splejsede varianter. Brugen af denne enkle og veletablerede metode kombineret med specifikke behandlinger er et pålideligt udgangspunkt for at kaste lys over cellulære processer, eller hvilke gener der kan reguleres af mRNA-splejsning.

En 5 'splejsning steder assay ved hjælp af E1A minigene blev udført for at evaluere ændringer i splejsning profil i celler efter kemoterapi redegørelse. Nek4 - isoform 1's rolle i AS-regulering i HEK293 stabile celler efter paclitaxel eller cisplatinbehandling blev evalueret.
Adenoviral E1A-regionen er ansvarlig for produktionen af tre hovedmRNA'er fra en RNA-prækursor på grund af brugen af forskellige splejsedonorer. De d...

Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Denne protokol præsenterer et hurtigt og nyttigt værktøj til evaluering af et proteins rolle med ukarakteriseret funktion i alternativ splejsningsregulering efter kemoterapeutisk behandling.

Brug af E1A Minigene Tool til at studere mRNA-splejsningsændringer

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

Det overordnede mål med denne protokol er at give detaljerede retningslinjer for at bruge minigene E1A2 til evaluering af globale mRNA-splejsningsændringer. Dette er et hurtigt, billigt og enkelt værktøj til vurdering af målproteinets funktion i alternativ splejsningsregulering uden behov for særlige regimer eller laboratorieforhold. Begynd med at dyrke HEK 293 celler med stabilt udtryk for interessegenet.Split cellerne ved hjælp af 0,25% trypsin EDTA, derefter plade 300.000 celler pr godt i seks-brønds plader og inkubere dem i 24 timer ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid. Efter 24 timer skal du kontrollere sammenløbet og kun transfekte HEK 293 stabile celler, når 70 til 80% sammenflydende. Fjern forsigtigt cellekulturmediet med en pipette, tilsæt derefter to milliliter komplet DMEM-medium uden antibiotika og læg pladen tilbage i inkubatoren.Forbered et rør med transfektbufferen, tilsæt derefter to mikrogram pMTE1A DNA, vortex, og tilsæt to mikroliter transfektreagens. Vortex igen og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern pladerne fra inkubatoren og tilsæt forsigtigt transfektblandingen dråbevis.Seks timer efter transfekten tilsættes tetracyklin til HEK 293 stabile celler til Nek4-ekspressionsintuktion. 24 timer efter transfekten skal du kontrollere cellemorfologi og transfektureeffektivitet ved hjælp af et fluorescerende mikroskop. Brug en pipette til at fjerne cellekulturmediet, og tilsæt derefter cellekulturmediet med kemoterapeuterne.Inkuber cellerne i yderligere 24 timer. For at indsamle RNA skal du kassere cellekulturmediet og tilføje 0,5 til 1 milliliter RNA-ekstraktionsreagens direkte til brønden. Hvis brøndene er meget sammenflydende, skal du bruge en milliliter RNA-ekstraktionsreagens for at forbedre RNA-kvaliteten.Homogeniser cellerne med en pipette og overfør dem til et 1,5 milliliter centrifugerør. Fortsæt straks til RNA-ekstraktionen, eller opbevar prøverne ved minus 80 grader Celsius. Prøverne optøs i en røghætte og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur.Tilsæt 0,1 til 0,2 milliliter kloroform og omrør kraftigt, og inkubter derefter i tre minutter ved stuetemperatur. Centrifuge i 15 minutter ved 12.000 gange G og fire grader Celsius, derefter indsamle den øverste vandige fase og overføre den til en ny 1,5 milliliter centrifuge rør. Indsamle omkring 60% af det samlede volumen, men ikke indsamle DNA eller den organiske fase.Der tilsættes 0,25 til 0,5 milliliter isopropanol, og prøven omrøres ved inversion fire gange. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur, og centrifuger derefter ved 12.000 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius og kassér supernatanten. Vask RNA pellet to gange med ethanol, og centrifuge ved 7.500 gange G i fem minutter, og kassér derefter ethanolen.Fjern overskydende ethanol ved at vende røret på et køkkenrulle, og lad derefter røret stå åbent inde i en røghætte for delvist at tørre pelleten i fem til 10 minutter. Ophæng RNA-pellet'en igen i 15 mikroliter DEPC-behandlet vand. Kvantificere den samlede RNA og kontrollere RNA-kvaliteten ved at måle absorbans ved 230, 260 og 280 nanometer.For at kontrollere den samlede RNA-kvalitet skal du køre en 1%agarose gel forbehandlet med 1,2% af en 2,5%natriumhypochloritopløsning i 30 minutter. Udfør cDNA-syntese ved hjælp af et til to mikrogram total RNA. Kombiner RNA, en mikroliter oligo d-T, en mikroliter DNTP og nukleasefrit vand til 12 mikroliter.Inkubat reaktionen i Thermo Cycler i fem minutter ved 65 grader Celsius. Fjern prøver fra Thermo Cycler, og tilsæt fire mikroliter af omvendt transskriptionsbuffer, to mikroliter DTT og en mikroliter ribonuklease-hæmmer. Inkuber ved 37 grader Celsius i to minutter.Tilsæt en mikroliter af termo-stabil omvendt transskriptionase, og inkuber ved 37 grader Celsius i 50 minutter. Inaktiver enzymet ved 70 grader Celsius i 15 minutter. Udfør PCR som beskrevet i tekstmanuskriptet, læg derefter 20 til 25 mikroliter pcr-produktet på en 3%agarose gel indeholdende nukleinsyreplet, og kør ved 100 volt i cirka en time.Foto gelen, undgå enhver bandmætning, og kvantificere båndene ved hjælp af en billedbehandlingssoftware. Båndene ved 631, 493 og 156 basispar svarer til henholdsvis 13S, 12S og 9S isoforme. Åbn billedfilen i menuen Filer i softwaren, og konverter den til grå skala.Juster lysstyrke og kontrast, og fjern dereftervigende støj, hvis det er nødvendigt. Tegn et rektangel rundt om den første vognbane med rektangelmarkeringsværktøjet, og marker det ved hjælp af kommandoen Analyser, Geler og Vælg første vognbane eller ved hjælp af tastaturgenvejen. Brug musen til at klikke og holde i midten af rektanglet på den første vognbane, og træk den over til næste vognbane.Gå til Analyser, Geler og Vælg næste vognbane. Gentag dette trin for alle resterende baner. Når alle banerne er fremhævet og nummereret, skal du gå til Analyser, Geler og Plot Lanes for at tegne en profilplot af hver vognbane.Brug værktøjet til lige stregmarkering til at tegne en streg hen over bunden af hver top, der svarer til hvert bånd, og udelade baggrundsstøjen. Når alle toppe fra hver vognbane er blevet lukket, skal du vælge staveværktøjet og klikke inde i hver top. Målingerne skal vises i resultatvinduet for hver fremhævet top.Overvej kun 13S-, 12S- og 9S-toppe svarende til 631, 493 og 156 baseparbånd. Kopier intensitetsdata for et regnearkseditor, og summer intensiteten fra alle tre bånd for hvert eksempel, og beregn derefter procentdelen for hver isoform i forhold til totalen. Angiv procentdelen af hver isoform eller forskellene i procenten i forhold til de ubehandlede prøver.En plasmid indeholdende minigenet fra E1A blev anvendt til at observere effekten på alternativ splejsning ved at vurdere andelen af mRNA fra hver produceret isoform. Basalt udtryk for E1A isoforme varianter afhang af cellelinjen og tidspunktet for E1A-udtrykket. Hek 293 stabil celle linje, eller HEK 293 rekombiner indeholdende site, viste et højere udtryk på 13S i forhold til HeLa celler, men viste lignende niveauer af 13S og 12S isoformer efter 48 timers E1A udtryk.Celler udsat for cisplatin viste et skift i fem prime S-S splejsning udvælgelse favorisere 12S udtryk. Denne effekt blev observeret i HEK 293 stably udtrykke Flag tomme vektor, samt isoform en af Nek4. Ændringer i alternativ splejsning efter paclitaxel behandling var meget diskret, men anvisningerne for ændringerne var modsat i Flag og Nek4 udtrykke celler.Når du udfører denne protokol, er det vigtigt at bruge ikke-transponerede og ikke-omvendte transskriptionskontroller for at undgå fejlfortolkning med endogenT E1A-udtryk, hovedsageligt når du bruger HEK 293-celler. Efter at have opnået positive resultater kan den alternative splejsning af specifikke gener relateret til den kemoterapeutiske respons evalueres. Når en vis effekt observeres, kan denne enkle protokol lede disse undersøgelser for mere konsekvente veje, hvor proteinet spiller en rolle, der regulerer alternativ splejsning i kemoterapirespons, for eksempel.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Betinget Knockdown af genekspression i kræft cellelinjer til at studere ansættelse af monocytter/makrofager at Tumor mikromiljø

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Ved hjælp af Dot analyse til at analysere Migration af celle ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Tørrede blod og Serum steder som et nyttigt redskab for prøven Storage til at evaluere kræft biomarkører

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Udnytte 18F-FDG PET/CT billeddannelse og kvantitative histologi at måle dynamiske ændringer i glukose stofskifte i musemodeller af lungekræft

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En Syngeneic bugspytkirtelkræft musen Model til at studere virkningerne af irreversibel elektroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analyse for at studere tumor-makrofag interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Brug af kylling chorioallantoic membran i Vivo Model til at studere gynækologiske og urologiske kræftformer

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Portal veneinjektion af kolorektal cancer organoider til at studere levermetastasen Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...