Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Wir danken Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, durch Grant Temático 2017/03489-1 an JK und Stipendium an FLB 2018/05350-3) und dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) für die Finanzierung dieser Forschung. Wir danken Dr. Adrian Krainer für die Bereitstellung des pMTE1A-Plasmids und Zerler und Kollegen für ihre Arbeit im E1A-Klonen. Wir danken auch Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti und Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller, die uns die Nutzung ihrer Laborräume und -geräte ermöglichen.

1. Beschichtungszellen
HINWEIS: In diesem beschriebenen Protokoll wurden HEK293 stabile Zelllinien, die zuvor für eine stabile induzierbare Expression von Nek4 erzeugtwurden, 21verwendet, jedoch ist das gleiche Protokoll für viele andere Zelllinien geeignet, wie HEK29322,HeLa23,24,25,26,U-2 OS27,...

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Misteli, T., C&#225;ceres, J. F., Clement, J. 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Minigenes sind wichtige Werkzeuge, um die Auswirkungen beim globalen alternativen Spleißen in vivo zu bestimmen. Das adenovirale Minigen E1A wird seit Jahrzehnten erfolgreich eingesetzt, um die Rolle von Proteinen zu bewerten, indem die Menge dieser in der Zelle erhöht wird13,14. Hier schlagen wir das Minigen E1A zur Bewertung des alternativen Spleißens nach chemotherapeutischer Exposition vor. Es wurde eine stabile Zelllinie verwendet, die die Nek4-Isoform 1 ...

Das Spleißen gehört zu den wichtigsten Schritten in der eukaryotischen mRNA-Verarbeitung, die gleichzeitig mit dem 5'mRNA-Capping und der 3'mRNA-Polyadenylierung erfolgt, bestehend aus Intronentfernung gefolgt von Exon-Junction. Die Erkennung der Spleißstellen (SS) durch das Spleißosom, einen Ribonukleoproteinkomplex, der kleine Ribonukleoproteine (snRNP U1, U2, U4 und U6), kleine RNAs (snRNAs) und mehrere regulatorische Proteine1 enthält, ist für das Spleißen notwendig.
Neben der Intronentfernung (konstitutives Spleißen) können in Eukaryoten Introns zurückgehalten und Exons ausgeschlossen werden, wodurch der Prozess namens mRNA Alternatives Spleißen (AS) konfiguriert wird. Das alternative Pre-mRNA-Spleißen erweitert die Kodierungskapazität eukaryotischer Genome und ermöglicht die Produktion einer großen und vielfältigen Anzahl von Proteinen aus einer relativ kleinen Anzahl von Genen. Es wird geschätzt, dass 95-100% der menschlichen mRNAs, die mehr als ein Exon enthalten, einem alternativen Spleißenunterzogenwerden können2,3. Dies ist grundlegend für biologische Prozesse wie neuronale Entwicklung, Apoptose-Aktivierung und zelluläre Stressreaktion4, die dem Organismus Alternativen zur Regulierung der Zellfunktion mit dem gleichen Repertoire an Genen bieten.
Die für das alternative Spleißen erforderliche Maschine ist die gleiche, die für das konstitutive Spleißen verwendet wird, und die Verwendung des SS ist die Hauptdeterminante für das Auftreten alternativer Spleißen. Konstitutives Spleißen ist mit der Verwendung von starken Spleißstellen verbunden, die in der Regel Konsensmotiven für die Spleißosomerkennung ähnlicher sind5.
Alternative Exons werden typischerweise weniger effizient erkannt als konstitutive Exons, sobald ihre cis-regulatorischenElemente, die Sequenzen in 5'SS und 3'SS, die diese Exons flankieren, eine geringere Bindungskapazität an das Spleißosom aufweisen. mRNA enthält auch Regionen namens Enhancer oder Schalldämpfer, die sich in Exons (Exonic Splicing Enhancers (ESEs) und Exonic Splicing Silencers (ESSs)) und Introns (Intronic Splicing Enhancers (ISEs) und Intronic Splicing Silencers (ISSs)) befinden, die die Exonnutzung verbessern oder unterdrücken, bzw.5. Diese Sequenzen werden durch transregulatorische Elemente oder Spleißfaktoren (SF) erkannt. SFs werden hauptsächlich durch zwei Proteinfamilien repräsentiert, die Serin/Arginin-reichen Spleißfaktoren (SRSFs), die an ESEs binden, und die Familie der heterogenen nuklearen Ribonukleoproteine (hnRNPs), die an ESS-Sequenzen binden5.
Alternatives Spleißen kann durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung von Transfaktoren moduliert werden, wodurch die Interaktionspartner und die zelluläre Lokalisation der Spleißfaktoren6,7,8modifizieren. Die Identifizierung neuer Regulatoren von Spleißfaktoren kann neue Werkzeuge zur Regulierung des Spleißens und folglich einiger Krebsbehandlungen bieten.
Anufrieva et al. 9 beobachteten ineinemmRNA-Microarray-Genexpressionsprofil konsistente Veränderungen der Spiegel spleißosomaler Komponenten in 101 Zelllinien und nach verschiedenen Stressbedingungen (platinbasierte Medikamente, Gammabestrahlung, Topoisomerase-Inhibitoren, Tyrosinkinase-Inhibitoren und Taxane). Der Zusammenhang zwischen Spleißmuster und Chemotherapie-Wirksamkeit wurde bereits in Lungenkrebszellen nachgewiesen, die chemotherapieresistent sind und Veränderungen in der Caspase-9-Variantenrate10zeigen. HEK293-Zellen, die mit Chemotherapeutika behandelt wurden, zeigen Veränderungen beim Spleißen mit einer Zunahme pro-apoptotischer Varianten. Gabriel et al.11 beobachteten Veränderungen bei mindestens 700 Spleißereignissen nach Cisplatin-Behandlung in verschiedenen Zelllinien und weisen darauf hin, dass Spleißwege cisplatin-beeinflusst sind. Spleißmodulatoren haben bereits eine antitumorale Aktivität gezeigt und gezeigt, dass das Spleißen für die Tumorentwicklung und vor allem für das Ansprechen auf die Chemotherapie wichtig ist12. Daher ist die Charakterisierung neuer Proteine, die das Spleißen nach zellulären Stressoren wie Chemotherapeutika regulieren, sehr wichtig, um neue Behandlungsstrategien zu entdecken.
Die Hinweise auf alternative Spleißregulation aus Interaktomstudien, die besonders wichtig sind, um Funktionen neuer oder uncharakterisierter Proteine zu charakterisieren, können einen allgemeineren und einfacheren Ansatz erfordern, um die tatsächliche Rolle des Proteins bei AS zu überprüfen. Minigenes sind wichtige Werkzeuge für die Analyse der allgemeinen Rolle eines Proteins, das die Spleißregulation beeinflusst. Sie enthalten Segmente aus einem interessierenden Gen, das alternativ gespleißte und flankierende genomische Regionen13enthält. Die Verwendung eines Minigen-Tools ermöglicht die Analyse des Spleißens in vivo mit mehreren Vorteilen, wie z. B. der Länge des Minigens, die geringfügig ist und daher keine Beschränkung auf die Amplifikationsreaktion darstellt; das gleiche Minigen kann in verschiedenen Zelllinien bewertet werden; alle zellulären Komponenten, hauptsächlich ihre regulierende post-translationale Modifikation (Phosphorylierung und Veränderungen in Zellkompartimenten) vorhanden sind und angesprochen werden können13,14. Darüber hinaus können Veränderungen des alternativen Spleißmusters nach zellulärem Stress beobachtet werden und die Verwendung eines Minigensystems ermöglicht es, den durch verschiedene Reize modulierten Signalweg zu identifizieren.
Es gibt bereits mehrere Minigensysteme, die spezifisch für verschiedene Arten von Spleißereignissensind 13,14,jedoch ist das Minigen E1A15 als vorläufiger Assay ein sehr gut etabliertes alternatives Spleiß-Reportersystem für die Untersuchung der 5'SS-Selektion in vivo. Aus nur einem Gen, E1A, werden fünf mRNAs durch alternatives Spleißen erzeugt, basierend auf der Auswahl von drei verschiedenen 5' Spleißstellen und einer großen oder einer kleineren 3' Spleißstelle16,17,18. Die Expression von E1A-Varianten ändert sich entsprechend der Periode der adenoviralen Infektion19,20.
Wir haben bereits gezeigt, dass beide Nek4-Isoformen mit Spleißfaktoren wie SRSF1 und hnRNPA1 interagieren, und während Isoform 2 das Minigen E1A alternative Spleißen ändert, hat Isoform 1 keine Wirkung in diesem21. Da Isoform 1 die am häufigsten vorkommende Isoform ist und die Chemotherapieresistenz und die DNA-Schadensreaktion verändert, bewerten wir, ob sie das alternative Spleißen des Minigens E1A in einem Stresszustand verändern könnte.
Der Minigene-Assay ist eine einfache, kostengünstige und schnelle Methode, da er nur RNA-Extraktion, cDNA-Synthese, Amplifikation und Agarose-Gel-Analysen benötigt und ein nützliches Werkzeug sein kann, um eine mögliche Wirkung auf das alternative Spleißen durch ein Protein von Interesse bis zur Wirkung verschiedener Behandlungen auf das zelluläre alternative Spleißmuster zu bewerten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

Die mRNA-Verarbeitung umfasst mehrere gleichzeitige Schritte, um mRNA für die Translation vorzubereiten, wie z. B. 5'Capping, Poly-A-Addition und Spleißen. Neben dem konstitutiven Spleißen ermöglicht das alternative mRNA-Spleißen die Expression multifunktionaler Proteine aus einem Gen. Da Interkonomstudien in der Regel die erste Analyse für neue oder unbekannte Proteine sind, ist die Assoziation des Köderproteins mit Spleißfaktoren ein Hinweis darauf, dass es am mRNA-Spleißprozess teilnehmen kann, aber zu bestimmen, in welchem Kontext oder welche Gene reguliert werden, ist ein empirischer Prozess. Ein guter Ausgangspunkt, um diese Funktion zu evaluieren, ist die Verwendung des klassischen Minigene-Tools. Hier stellen wir die adenovirale E1A-Minigenverwendung zur Bewertung der alternativen Spleißveränderungen nach verschiedenen zellulären Stressreizen vor. Wir untersuchten das Spleißen von E1A-Minigen in HEK293, das das Nek4-Protein nach verschiedenen Stressbehandlungen stabil überexprimiert. Das Protokoll umfasst E1A-Minigentransfektion, Zellbehandlung, RNA-Extraktion und cDNA-Synthese, gefolgt von PCR- und Gelanalyse und Quantifizierung der E1A-Spleißvarianten. Der Einsatz dieser einfachen und etablierten Methode in Kombination mit spezifischen Behandlungen ist ein zuverlässiger Ausgangspunkt, um zelluläre Prozesse zu beleuchten oder welche Gene durch mRNA-Spleißen reguliert werden können.

Ein 5'-Spleißstellen-Assay mit E1A-Minigen wurde durchgeführt, um Veränderungen des Spleißprofils in Zellen nach Chemotherapie-Exposition zu bewerten. Die Rolle von Nek4 - Isoform 1 bei der AS-Regulation in HEK293-stabilen Zellen nach Paclitaxel- oder Cisplatin-Behandlung wurde untersucht.
Die adenovirale E1A-Region ist aufgrund der Verwendung verschiedener Spleißspender für die Produktion von drei Haupt-mRNAs aus einem RN...

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Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Dieses Protokoll stellt ein schnelles und nützliches Werkzeug zur Bewertung der Rolle eines Proteins mit uncharakterisierter Funktion bei der alternativen Spleißregulation nach chemotherapeutischer Behandlung dar.

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur Verwendung des Minigens E1A2 zur Bewertung globaler mRNA-Spleißänderungen bereitzustellen. Dies ist ein schnelles, kostengünstiges und einfaches Werkzeug zur Beurteilung der Funktion des Zielproteins bei der alternativen Spleißregulation, ohne dass spezielle Regime oder Laborbedingungen erforderlich sind. Beginnen Sie mit der Kultivierung von HEK 293-Zellen mit stabiler Expression des interessierenden Gens.Teilen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin EDTA, dann platten Sie 300.000 Zellen pro Vertiefung in Sechs-Well-Platten und inkubieren Sie sie für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Überprüfen Sie nach 24 Stunden den Zusammenfluss und transfizieren Sie HEK 293 stabile Zellen nur, wenn 70 bis 80% konfluent sind. Entfernen Sie vorsichtig das Zellkulturmedium mit einer Pipette, fügen Sie dann zwei Milliliter vollständiges DMEM-Medium ohne Antibiotika hinzu und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.Bereiten Sie ein Röhrchen mit dem Transfektionspuffer vor, fügen Sie dann zwei Mikrogramm pMTE1A-DNA, Wirbel und zwei Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu. Erneut Wirbel und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und fügen Sie die Transfektionsmischung vorsichtig tropfenweise hinzu.Sechs Stunden nach der Transfektion wird Tetracyclin zu den stabilen HEK 293-Zellen für die Nek4-Expressionsinduktion hinzugefügt. Überprüfen Sie 24 Stunden nach der Transfektion die Zellmorphologie und Transfektionseffizienz mit einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie eine Pipette, um das Zellkulturmedium zu entfernen, und fügen Sie dann Zellkulturmedium mit den Chemotherapeutika hinzu.Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Um RNA zu sammeln, verwerfen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 0,5 bis 1 Milliliter RNA-Extraktionsreagenz direkt in den Brunnen hinzu. Wenn Brunnen sehr konfluent sind, verwenden Sie einen Milliliter RNA-Extraktionsreagenz, um die RNA-Qualität zu verbessern.Homogenisieren Sie die Zellen mit einer Pipette und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen über. Fahren Sie sofort mit der RNA-Extraktion fort oder lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius. Die Proben in einem Abzug auftauen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Fügen Sie 0,1 bis 0,2 Milliliter Chloroform hinzu und rühren Sie kräftig, dann drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie für 15 Minuten bei 12.000 mal G und vier Grad Celsius, sammeln Sie dann die obere wässrige Phase und übertragen Sie sie in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr. Sammeln Sie etwa 60% des Gesamtvolumens, aber sammeln Sie nicht die DNA oder die organische Phase.Fügen Sie 0,25 bis 0,5 Milliliter Isopropanol hinzu und rühren Sie die Probe viermal durch Inversion. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann bei 12.000 mal G 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Waschen Sie das RNA-Pellet zweimal mit Ethanol und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 7.500 mal G und entsorgen Sie es dann.Entfernen Sie überschüssiges Ethanol, indem Sie das Röhrchen auf einem Papiertuch umkehren, und lassen Sie das Rohr dann in einem Abzug offen, um das Pellet fünf bis 10 Minuten lang teilweise zu trocknen. Suspendieren Sie das RNA-Pellet in 15 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser. Quantifizieren Sie die Gesamt-RNA und verifizieren Sie die RNA-Qualität, indem Sie die Absorption bei 230, 260 und 280 Nanometern messen.Um die Gesamt-RNA-Qualität zu überprüfen, führen Sie 30 Minuten lang ein 1% Agarose-Gel aus, das mit 1,2% einer 2,5% igen Natriumhypochloritlösung vorbehandelt wurde. Führen Sie die cDNA-Synthese mit ein bis zwei Mikrogramm Gesamt-RNA durch. Kombinieren Sie RNA, einen Mikroliter Oligo d-T, einen Mikroliter DNTP und nukleasefreies Wasser zu 12 Mikrolitern.Inkubieren Sie die Reaktion im Thermo Cycler fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Entfernen Sie Proben aus dem Thermo Cycler und fügen Sie vier Mikroliter Reverse Transkriptase-Puffer, zwei Mikroliter DTT und ein Mikroliter Ribonuklease-Inhibitor hinzu. Bei 37 Grad Celsius zwei Minuten lang inkubieren.Fügen Sie einen Mikroliter thermostabile Reverse Transkriptase hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten. Inaktivieren Sie das Enzym bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten. Führen Sie die PCR wie im Textmanuskript beschrieben durch, laden Sie dann 20 bis 25 Mikroliter des PCR-Produkts auf ein 3%iges Agarosegel, das Nukleinsäurefleck enthält, und führen Sie es etwa eine Stunde lang mit 100 Volt aus.Fotografieren Sie das Gel, vermeiden Sie eine Bandsättigung und quantifizieren Sie die Bänder mit einer Bildverarbeitungssoftware. Die Bänder bei 631, 493 und 156 Basenpaaren entsprechen den Isoformen 13S, 12S und 9S. Öffnen Sie im Menü Datei der Software die Bilddatei und konvertieren Sie sie in Graustufen.Passen Sie Helligkeit und Kontrast an und entfernen Sie bei Bedarf Ausreißerrauschen. Zeichnen Sie mit dem Rechteckauswahlwerkzeug ein Rechteck um die erste Spur, und wählen Sie es mit den Befehlen Analysieren, Gele und Erste Spur auswählen oder mithilfe der Tastenkombination aus. Klicken und halten Sie mit der Maus in der Mitte des Rechtecks auf der ersten Spur und ziehen Sie es auf die nächste Spur.Gehen Sie zu Analysieren, Gele und Wählen Sie Nächste Spur aus. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle verbleibenden Fahrspuren. Nachdem alle Lanes hervorgehoben und nummeriert wurden, wechseln Sie zu Analyze, Gels und Plot Lanes, um ein Profildiagramm für jede Lane zu zeichnen.Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug für gerade Linien, um eine Linie über die Basis jedes Peaks zu zeichnen, die jedem Band entspricht, wobei das Hintergrundrauschen weggelassen wird. Nachdem alle Spitzen von jeder Spur gesperrt wurden, wählen Sie das Zauberstabwerkzeug und klicken Sie in jede Spitze. Messungen sollten im Ergebnisfenster für jeden hervorgehobenen Peak angezeigt werden.Betrachten Sie nur die 13S-, 12S- und 9S-Peaks, die den Basenpaarbändern 631, 493 und 156 entsprechen. Kopieren Sie Intensitätsdaten für einen Tabellenkalkulationseditor, summieren Sie die Intensität aus allen drei Bändern für jede Stichprobe, und berechnen Sie dann den Prozentsatz für jede Isoform relativ zur Gesamtsumme. Zeichnen Sie die Prozentsätze jeder Isoform oder die Unterschiede im Prozentsatz relativ zu den unbehandelten Proben auf.Ein Plasmid, das das Minigen aus E1A enthielt, wurde verwendet, um die Wirkung auf das alternative Spleißen zu beobachten, indem der Anteil an mRNA aus jeder produzierten Isoform bewertet wurde. Die basale Expression von E1A-Isoformen-Varianten hing von der Zelllinie und dem Zeitpunkt der E1A-Expression ab. Die stabile HeK 293-Zelllinie oder HEK 293-Rekombinase-haltige Stelle zeigte eine höhere Expression von 13S im Vergleich zu HeLa-Zellen, zeigte jedoch nach 48 Stunden E1A-Expression ähnliche Konzentrationen von 13S- und 12S-Isoformen.Zellen, die Cisplatin ausgesetzt waren, zeigten eine Verschiebung in der Selektion von fünf Primzahlen von S-S-Spleißen, die die 12S-Expression begünstigten. Dieser Effekt wurde in HEK 293 beobachtet, das den leeren Flag-Vektor stabil ausdrückte, sowie die Isoform eines von Nek4. Veränderungen im alternativen Spleißen nach der Paclitaxel-Behandlung waren sehr diskret, aber die Richtungen der Veränderungen waren in Flag- und Nek4-exprimierenden Zellen entgegengesetzt.Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, nicht transfizierte und nicht-reverse Transkriptase-Kontrollen zu verwenden, um Fehlinterpretationen mit endogener E1A-Expression zu vermeiden, hauptsächlich bei der Verwendung von HEK 293-Zellen. Nach Erhalt positiver Ergebnisse kann das alternative Spleißen bestimmter Gene im Zusammenhang mit dem chemotherapeutischen Ansprechen bewertet werden. Wenn ein Effekt beobachtet wird, kann dieses einfache Protokoll diese Studien für konsistentere Wege lenken, bei denen das Protein eine Rolle bei der Regulierung des alternativen Spleißens spielt, zum Beispiel bei der Chemotherapie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Bedingte Knockdown von Genexpression in Krebs-Zell-Linien, die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung zu studieren

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Getrocknete Blut und Serum Spots als ein nützliches Werkzeug für die Lagerung der Probe, Cancer Biomarkers zu bewerten

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Nutzung von 18F-FDG-PET/CT-Bildgebung und quantitativer Histologie, dynamische Veränderungen in der Glukose-Stoffwechsel in Mausmodellen von Lungenkrebs zu messen

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Ein Phänomen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen der Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Verwendung des Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Modells zur Untersuchung gynäkologischer und urologischer Krebsarten

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Portalveneninjektion von Darmkrebs-Organoiden zur Untersuchung der Lebermetastasierung Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...