Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

हम फंडाकाओ डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (एफएपीईपी, धन्यवाद देते हैं, इस शोध के वित्तपोषण के लिए ग्रांट टेमेटिको 2017/03489-1 के माध्यम से जेके और फैलोशिप को एफएलबी 2018/05350-3) और कॉन्सेल्हो नैसिनल डी डेसेवोल्विमेंटो सिएंटिको ई टेकनोलोजिको (सीएनपीक्यू) के माध्यम से। हम E1A क्लोनिंग में अपने काम के लिए pMTE1A प्लाज्मिड और Zerler और सहयोगियों को उपलब्ध कराने के लिए डॉ एड्रियन Krainer शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम प्रो डॉ पैट्रसिया मोरिएल, प्रो डॉ वांडा परेरा अलमेडा, प्रो डॉ मार्सेलो लांसलोट्टी और प्रो डॉ करीना कोगो कोगो मुलर को भी धन्यवाद देते हैं ताकि हमें उनकी प्रयोगशाला अंतरिक्ष और उपकरणों का उपयोग करने की अनुमति दी जा सके ।

1. चढ़ाना कोशिकाओं
नोट: इस वर्णित प्रोटोकॉल में, HEK293 स्थिर सेल लाइनों, पहले Nek4 की स्थिर प्रारंभिक अभिव्यक्ति के लिए उत्पन्न21का इस्तेमाल किया गया था, हालांकि, एक ही प्रोटोकॉल कई अन्य सेल ?...

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वीवो में वैश्विक वैकल्पिक स्प्लिसिंग में प्रभाव निर्धारित करने के लिए मिनीजीन महत्वपूर्ण उपकरण हैं। एडेनोवायरल मिनीजीन ई 1ए का उपयोग दशकों से कोशिका13,14में इनकी मात्रा में वृद्?...

स्प्लिसिंग यूकेरियोटिक एमआरएनए प्रसंस्करण में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है जो एक साथ 5'mRNA कैपिंग और 3'mRNA पॉलीडेनिलेशन होता है, जिसमें एक्सॉन जंक्शन के बाद इंट्रोन हटाने शामिल हैं। स्प्लिसियोसोम द्वारा स्प्लिस साइटों (एसएस) की मान्यता, छोटे राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (snRNP U1, U2, U4 और U6), छोटे आरएनए (snRNAs) और कई नियामक प्रोटीन1 युक्त एक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसर स्प्लिसिंग के लिए आवश्यक है।
यूकेरियोट्स में इंट्रॉन हटाने (संविलियन स्प्लिसिंग) के अलावा, इंट्रोन को बनाए रखा जा सकता है और एक्सॉन को बाहर रखा जा सकता है, इस प्रक्रिया को एमआरएनए वैकल्पिक स्प्लिसिंग (एएस) कहा जाता है। वैकल्पिक प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग यूकेरियोटिक जीनोम की कोडिंग क्षमता का विस्तार करता है जिससे अपेक्षाकृत कम संख्या में जीन से बड़ी और विविध संख्या में प्रोटीन का उत्पादन होता है। यह अनुमान लगाया गया है कि 95-100% मानव 100% जिनमें एक से अधिक एक्सोन होते हैं,वैकल्पिक स्प्लिसिंग2,3से गुजर सकते हैं। यह न्यूरोनल डेवलपमेंट, एपोप्टोसिस एक्टिवेशन और सेलुलर स्ट्रेस रिस्पांस4जैसी जैविक प्रक्रियाओं के लिए मौलिक है, जो जीन के एक ही प्रदर्शनों की सूची का उपयोग करके कोशिका कार्य को विनियमित करने के लिए जीव विकल्प प्रदान करता है।
वैकल्पिक स्प्लिसिंग के लिए आवश्यक मशीनरी का उपयोग संविलियन स्प्लिसिंग के लिए किया जाता है और एसएस का उपयोग वैकल्पिक स्प्लिसिंग घटना के लिए मुख्य निर्धारक है। संविलियन स्प्लिसिंग मजबूत स्प्लिसिंग साइटों के उपयोग से संबंधित है, जो आमतौर पर स्प्लिकोसोम मान्यता5के लिए आम सहमति रूपांकनों के समान होते हैं।
वैकल्पिक एक्सोन्स को आम तौर पर अपने सीआईएस-नियामकतत्वों के संविलियन एक्सन की तुलना में कम कुशलता से पहचाना जाता है, 5'SS और 3'SS में दृश्य इन एक्सॉन को फ्लैंक करते हैं, स्प्लिकोसोम के लिए एक अवर बाध्यकारी क्षमता दिखाते हैं। एमआरएनए में एक्सॉन्स (एक्सोनिक स्प्लिसिंग एन्हांसर्स (ईएसएस) और एक्सोनिक स्प्लिसिंग साइलेंसर (ईएसएस)) और इंट्रोनिक स्प्लिसिंग एन्हांसर्स (आईएसईएस) और इंट्रोनिक स्प्लिसिंग एन्लाइजर (आईएसएस) में स्थित एन्हांसर्स या साइलेंसर नाम के क्षेत्र भी शामिल हैं, जो क्रमशः5,विस्तार के उपयोग को बढ़ाते हैं या दमन करते हैं। इन दृश्यों को ट्रांस-नियामक तत्वों, या स्प्लिसिंग कारकों (एसएफ) द्वारा पहचाना जाता है। एसएफएस का प्रतिनिधित्व मुख्य रूप से प्रोटीन के दो परिवारों द्वारा किया जाता है, सेरीन/आर्जिनिन रिच स्प्लिसिंग फैक्टर्स (एसआरएफएस) जो ईएसएस और विषम परमाणु राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (एचएनआरआरपी) के परिवार को बांधते हैं जो ईएसएस दृश्यों5से बांधते हैं ।
वैकल्पिक स्प्लिसिंग को ट्रांस-कारकों के फॉस्फोरिलेशन/डीफोस्फोरिलेशन द्वारा संग्राहक किया जा सकता है जो इंटरैक्शन भागीदारों को संशोधित करता है और स्प्लिसिंग कारकों के सेलुलर स्थानीयकरण6,7,8। स्प्लिसिंग कारकों के नए नियामकों की पहचान करने से स्प्लिसिंग को विनियमित करने के लिए नए उपकरण प्रदान किए जा सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप, कुछ कैंसर उपचार।
एक एमआरएनए माइक्रोएरे जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में अनुफ्रीवा एट अल9,101 सेल लाइनों में स्प्लिकोसोमोमल घटकों के स्तर में लगातार परिवर्तन और विभिन्न तनाव स्थितियों (प्लेटिनम आधारित दवाओं, गामा विकिरण, टोपोसोमरैरेस अवरोधकों, टायरोसिन किनेज़ अवरोधकों और टैक्सेन) के बाद मनाया गया। स्प्लिसिंग पैटर्न और कीमोथेरेपी प्रभावकारिता के बीच संबंध पहले से ही फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया है, जो कीमोथेरेपी प्रतिरोधी हैं, कैस्पा-9 वेरिएंट दर10में परिवर्तन दिखा । कीमोथैरेपी पैनल के साथ इलाज की कोशिकाओं प्रो-एपोटोटिक वेरिएंट में वृद्धि के साथ स्प्लिसिंग में परिवर्तन दिखाते हैं। गेब्रियल एटअल. 11 ने विभिन्न सेल लाइनों में सिस्प्लैटिन उपचार के बाद स्प्लिसिंग की कम से कम 700 घटनाओं में परिवर्तन देखा, यह इंगित करता है कि स्प्लिसिंग रास्ते सिस्प्लैटिन-प्रभावित हैं। स्प्लिसिंग मॉड्यूलर ने पहले ही एंटी-ट्यूमरल गतिविधि का प्रदर्शन किया है, जिसमें यह दर्शाया गया है कि स्प्लिसिंग ट्यूमर के विकास के लिए महत्वपूर्ण है और मुख्य रूप से कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया12। इसलिए, नए प्रोटीन की विशेषता है जो कीमोथेरेपी जैसे सेलुलर स्ट्रेसर्स एजेंटों के बाद स्प्लिसिंग को विनियमित करते हैं, उपचार की नई रणनीतियों की खोज करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।
इंटरैक्टोम अध्ययनों से वैकल्पिक स्प्लिसिंग विनियमन के सुराग, विशेष रूप से नए या अस्वाभाविक प्रोटीन के कार्यों की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण, एएस में प्रोटीन की वास्तविक भूमिका को सत्यापित करने के लिए अधिक सामान्य और सरल दृष्टिकोण की मांग कर सकते हैं। मिनीजीन स्प्लिसिंग विनियमन को प्रभावित करने वाले प्रोटीन की सामान्य भूमिका के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। इनमें रुचि के जीन से लेकर वैकल्पिक रूप से कटा हुआ और जीनोमिक क्षेत्रों में13से अधिक के खंड होते हैं . एक मिनीजीन उपकरण का उपयोग करने से वीवो में स्प्लिसिंग के विश्लेषण की अनुमति मिलती है, जैसे कि मिनीजीन की लंबाई जो मामूली है और इसलिए प्रवर्धन प्रतिक्रिया की सीमा नहीं है; एक ही मिनीजीन का मूल्यांकन विभिन्न सेल लाइनों में किया जा सकता है; सभी सेलुलर घटक, मुख्य रूप से उनके विनियमन पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन (फॉस्फोरिलेशन और सेल डिब्बों में परिवर्तन) मौजूद हैं और13,14को संबोधित किया जा सकता है . इसके अलावा, सेलुलर तनाव के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग पैटर्न में परिवर्तन देखा जा सकता है और, एक मिनीजीन प्रणाली का उपयोग, विभिन्न उत्तेजनाओं द्वारा संग्राहक किए जा रहे मार्ग की पहचान करने की अनुमति देता है।
पहले से ही वर्णित कई मिनीजीन प्रणालियां हैं जो विभिन्न प्रकार की स्प्लिसिंग घटनाओं के लिए विशिष्ट हैं13,14,हालांकि, प्रारंभिक परख के रूप में, मिनीजीन ई1ए 15 वीवो में 5 के एसएस चयन के अध्ययन के लिए एक बहुत अच्छी तरह से स्थापित वैकल्पिक स्प्लिसिंग रिपोर्टर सिस्टम है। केवल एक जीन, E1A, पांच mRNAs से तीन अलग-अलग 5 'स्प्लिस साइटों और एक प्रमुख या एक छोटे से 3' स्प्लिस साइट16, 17, 18के चयन के आधार पर वैकल्पिक स्प्लिसिंग द्वारा उत्पादित कियाजाताहै। ई 1ए वेरिएंट की अभिव्यक्ति एडेनोवायरल संक्रमण19,20की अवधि के अनुसार बदलती है ।
हमने पहले दिखाया है कि दोनों Nek4 आइसोफॉर्म SRSF1 और hnRNPA1 जैसे स्प्लिसिंग कारकों के साथ बातचीत करते हैं और जबकि आइसोफॉर्म 2 परिवर्तन मिनीजीन E1A वैकल्पिक स्प्लिसिंग, आइसोफॉर्म 1 का उस21में कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। क्योंकि आइसोफॉर्म 1 सबसे प्रचुर मात्रा में आइसोफॉर्म है और कीमोथेरेपी प्रतिरोध और डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में परिवर्तन करता है, हम मूल्यांकन करते हैं कि क्या यह तनाव की स्थिति में मिनीजीन E1A वैकल्पिक स्प्लिसिंग बदल सकता है।
मिनीजीन परख एक सरल, कम लागत और तेजी से विधि है, क्योंकि यह केवल आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, प्रवर्धन और agarose जेल विश्लेषण की जरूरत है, और सेलुलर वैकल्पिक स्प्लिसिंग पैटर्न पर विभिन्न उपचारों के प्रभाव तक हितों के प्रोटीन द्वारा वैकल्पिक स्प्लिसिंग पर संभावित प्रभाव के बाद से मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

एमआरएनए प्रसंस्करण में अनुवाद के लिए एमआरएनए तैयार करने के लिए कई एक साथ कदम शामिल हैं, जैसे कि 5'कैपिंग, पॉली-ए अतिरिक्त और स्प्लिसिंग। संविलियन स्प्लिसिंग के अलावा, वैकल्पिक एमआरएनए स्प्लिसिंग एक जीन से बहुआयामी प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। चूंकि इंटरैक्टोम अध्ययन आम तौर पर नए या अज्ञात प्रोटीन के लिए पहला विश्लेषण होता है, इसलिए स्प्लिसिंग कारकों के साथ चारा प्रोटीन का संबंध एक संकेत है कि यह एमआरएनए स्प्लिसिंग प्रक्रिया में भाग ले सकता है, लेकिन यह निर्धारित करने के लिए कि किस संदर्भ में या जीन को विनियमित किया जाता है, एक अनुभवजन्य प्रक्रिया है। इस फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु शास्त्रीय मिनीजीन उपकरण का उपयोग कर रहा है। यहां हम विभिन्न सेलुलर तनाव उत्तेजनाओं के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए एडेनोवायरल E1A मिनीजीन उपयोग प्रस्तुत करते हैं। हमने विभिन्न तनाव वाले उपचारों के बाद नेक 4 प्रोटीन को स्थिर रूप से HEK293 में E1A मिनीजीन के स्प्लिसिंग का मूल्यांकन किया। प्रोटोकॉल में E1A मिनीजीन ट्रांसफैक्शन, सेल ट्रीटमेंट, आरएनए एक्सट्रेक्शन और सीडीएनए संश्लेषण शामिल हैं, जिसके बाद पीसीआर और जेल विश्लेषण और E1A स्प्लिट वेरिएंट का परिमाणीकरण शामिल है। विशिष्ट उपचारों के साथ संयुक्त इस सरल और अच्छी तरह से स्थापित विधि का उपयोग सेलुलर प्रक्रियाओं पर प्रकाश डालने के लिए एक विश्वसनीय प्रारंभिक बिंदु है या क्या जीन को एमआरएनए स्प्लिसिंग द्वारा विनियमित किया जा सकता है।

कीमोथेरेपी प्रदर्शनी के बाद कोशिकाओं में स्प्लिसिंग प्रोफाइल में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए E1A मिनीजीन का उपयोग करके एक 5 ' स्प्लिस साइटों परख किया गया था। Paclitaxel या सिस्प्लैटिन उपचार ?...

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Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

यह प्रोटोकॉल कीमोथैरेपी उपचार के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग विनियमन में अस्वाभाविक कार्य के साथ प्रोटीन की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से और उपयोगी उपकरण प्रस्तुत करता है।

एमआरएनए स्प्लिसिंग परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए E1A मिनीजीन टूल का उपयोग करना

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य वैश्विक एमआरएनए स्प्लिसिंग परिवर्तनों के मूल्यांकन के लिए मिनीजीन E1A2 का उपयोग करने के लिए विस्तृत मार्गदर्शन प्रदान करना है। यह विशेष व्यवस्थाओं या प्रयोगशाला स्थितियों की आवश्यकता के बिना वैकल्पिक स्प्लिसिंग विनियमन में लक्ष्य प्रोटीन के कार्य का आकलन करने के लिए एक त्वरित, सस्ती और सरल उपकरण है। ब्याज के जीन की स्थिर अभिव्यक्ति के साथ HEK 293 कोशिकाओं को खेती से शुरू करें।0.25% ट्राइप्सिन EDTA का उपयोग करके कोशिकाओं को विभाजित करें, फिर छह-अच्छी प्लेटों में 300, 000 कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्लेट करें और उन्हें 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। 24 घंटे के बाद, संगम की जांच करें, और एचईके 293 स्थिर कोशिकाओं को तभी स्थानांतरित करें जब 70 से 80% कॉन्फ्लूंट करें। एक पिपेट के साथ सेल कल्चर मीडियम को सावधानी से हटा दें, फिर एंटीबायोटिक्स के बिना पूर्ण डीएमईएम माध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ें और प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस डाल दें।ट्रांसफेक्शन बफर के साथ एक ट्यूब तैयार करें, फिर दो माइक्रोग्राम PMTE1A डीएनए, भंवर जोड़ें, और ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर फिर से और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। इन्मेंटेटर से प्लेट्स निकालें और सावधानी से ट्रांसफेक्शन मिश्रण को ड्रॉप वार डालें।ट्रांसफेक्शन के छह घंटे बाद, नेक 4 अभिव्यक्ति प्रेरण के लिए एचईके 293 स्थिर कोशिकाओं में टेट्रासाइक्लिन जोड़ें। ट्रांसफैक्शन के 24 घंटे बाद, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल आकृति विज्ञान और ट्रांसफैक्शन दक्षता को सत्यापित करें। सेल कल्चर मीडियम को हटाने के लिए पिपेट का इस्तेमाल करें, फिर कीमोथैरेपी के साथ सेल कल्चर मीडियम डालें।कोशिकाओं को एक और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। आरएनए इकट्ठा करने के लिए, सेल कल्चर मीडियम को त्यागें, और आरएनए एक्सट्रेक्शन रिएजेंट के 0.5 से 1 मिलीलीटर को सीधे कुएं में जोड़ें। यदि कुओं बहुत ढुलमुल हैं, आरएनए की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए आरएनए निष्कर्षण अभिवाक के एक मिलीलीटर का उपयोग करें ।कोशिकाओं को पिपेट के साथ समरूप करें और उन्हें 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। आरएनए निष्कर्षण के लिए तुरंत आगे बढ़ें, या नमूनों को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एक धुएं हुड में नमूनों गल और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट ।क्लोरोफॉर्म के 0.1 से 0.2 मिलीलीटर जोड़ें और सख्ती से उत्तेजित करें, फिर कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 12, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, तो ऊपरी जलीय चरण इकट्ठा और यह एक नया १.५ मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए हस्तांतरण । कुल मात्रा का लगभग 60% एकत्र करें, लेकिन डीएनए या कार्बनिक चरण एकत्र न करें।आइसोप्रोपेनॉल के 0.25 से 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और चार बार उलटा करके नमूना आंदोलन करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट, तो चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र और सुपरनैंट त्यागें । आरएनए गोली को इथेनॉल के साथ दो बार धोएं, और पांच मिनट के लिए 7, 500 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें, फिर इथेनॉल को त्यागें।एक कागज तौलिया पर ट्यूब उलटा द्वारा अतिरिक्त इथेनॉल निकालें, तो एक धुएं हुड के अंदर खुला ट्यूब छोड़ने के लिए आंशिक रूप से पांच से 10 मिनट के लिए गोली सूखी । डीईपीसी-उपचारित पानी के 15 माइक्रोलीटर में आरएनए गोली को फिर से निलंबित करें। कुल आरएनए की मात्रा निर्धारित करें और 230, 260 और 280 नैनोमीटर पर अवशोषण को मापकर आरएनए गुणवत्ता को सत्यापित करें।कुल आरएनए गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए, 30 मिनट के लिए 2.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के 1.2% के साथ 1% एगरस्ड जेल प्रीट्रीड चलाएं। कुल आरएनए के एक से दो माइक्रोग्राम का उपयोग कर सीडीएनए संश्लेषण प्रदर्शन करें। आरएनए, ओलिगो डी-टी का एक माइक्रोलीटर, डीएनटीपी का एक माइक्रोलीटर और नाभिक मुक्त पानी को 12 माइक्रोलीटर में मिलाएं।थर्मो साइकिलर में प्रतिक्रिया को पांच मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। थर्मो साइकिलर से नमूने निकालें, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस बफर के चार माइक्रोलीटर, डीटीटी के दो माइक्रोलीटर और राइबोन्यूक्लिक्स अवरोधक का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। दो मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।थर्मो-स्थिर रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट का एक माइक्रोलीटर जोड़ें, और 50 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एंजाइम को 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित पीसीआर करें, फिर न्यूक्लिक एसिड दाग वाले 3% एगर उठे जेल पर पीसीआर उत्पाद के 20 से 25 माइक्रोलीटर लोड करें, और लगभग एक घंटे तक 100 वोल्ट पर चलाएं।जेल की तस्वीर, किसी भी बैंड संतृप्ति से परहेज, और एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बैंड की मात्रा । 631, 493, और 156 आधार जोड़े में बैंड क्रमशः 13S, 12S और 9S आइसोफॉर्म के अनुरूप हैं। सॉफ्टवेयर के फाइल मेन्यू से इमेज फाइल खोलें और उसे ग्रे स्केल में कन्वर्ट करें।चमक और इसके विपरीत समायोजित करें, फिर यदि आवश्यक हो तो बाहरी शोर को हटा दें। आयत चयन उपकरण के साथ पहली लेन के चारों ओर एक आयत ड्रा, और विश्लेषण, जैल, और पहली लेन कमान का चयन करें, या कीबोर्ड शॉर्टकट का उपयोग करके। क्लिक करें और पहली लेन पर आयत के बीच में पकड़ करने के लिए माउस का प्रयोग करें, और इसे अगले लेन पर खींचें ।विश्लेषण करने के लिए जाओ, जैल, और अगले लेन का चयन करें । शेष सभी गलियों के लिए इस कदम को दोहराएं। सभी लेन हाइलाइट और गिने जाने के बाद, प्रत्येक लेन के प्रोफाइल प्लॉट को आकर्षित करने के लिए विश्लेषण, जैल और प्लॉट लेन पर जाएं।प्रत्येक चोटी के आधार पर एक लाइन आकर्षित करने के लिए सीधी रेखा चयन उपकरण का उपयोग करें, प्रत्येक बैंड के अनुरूप, पृष्ठभूमि शोर को छोड़कर। हर लेन से सभी चोटियों को बंद कर दिया गया है के बाद, छड़ी उपकरण का चयन करें और प्रत्येक चोटी के अंदर क्लिक करें। माप प्रत्येक हाइलाइट किए गए शिखर के लिए परिणाम विंडो में पॉप अप करना चाहिए।631, 493 और 156 बेस जोड़े बैंड के अनुरूप केवल 13S, 12S और 9S चोटियों पर विचार करें। स्प्रेडशीट संपादक के लिए तीव्रता डेटा कॉपी करें, और प्रत्येक नमूने के लिए सभी तीन बैंड से तीव्रता का योग करें, फिर कुल के सापेक्ष प्रत्येक आइसोफॉर्म के लिए प्रतिशत की गणना करें। प्रत्येक आइसोफॉर्म के प्रतिशत, या अनुपचारित नमूनों के सापेक्ष प्रतिशत में अंतर की साजिश करें।E1A से मिनीजीन युक्त एक प्लाज्मिड का उपयोग उत्पादित प्रत्येक आइसोफॉर्म से एमआरएनए के अनुपात का मूल्यांकन करके वैकल्पिक स्प्लिसिंग पर प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। E1A आइसोफॉर्म वेरिएंट की बेसल अभिव्यक्ति E1A अभिव्यक्ति की सेल लाइन और समय पर निर्भर करती है। HEK 293 स्थिर सेल लाइन, या एचईके 293 साइट युक्त पुनर्संयोजन, हेला कोशिकाओं की तुलना में 13S की एक उच्च अभिव्यक्ति दिखाया, लेकिन E1A अभिव्यक्ति के 48 घंटे के बाद 13S और 12S आइसोफॉर्म के समान स्तर दिखाया।सिस्प्लैटिन के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं ने 12S अभिव्यक्ति के पक्ष में पांच प्राइम एस-एस स्प्लिसिंग चयन में बदलाव दिखाया। यह प्रभाव एचईके 293 में देखा गया था जो फ्लैग खाली वेक्टर को व्यक्त करता है, साथ ही नेक 4 में से एक को आइसोफॉर्म करता है। paclitaxel उपचार के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग में परिवर्तन बहुत विचारशील थे, लेकिन परिवर्तनों की दिशाएं फ्लैग और नेक 4 एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं में विपरीत थीं।इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय, मुख्य रूप से एचईके 293 कोशिकाओं का उपयोग करते समय, अंतर्जात E1A अभिव्यक्ति के साथ गलत व्याख्या से बचने के लिए असंक्रमित और गैर-रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस नियंत्रण का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने के बाद, कीमोथैरेपी प्रतिक्रिया से संबंधित विशिष्ट जीन के वैकल्पिक स्प्लिसिंग का मूल्यांकन किया जा सकता है। जब कुछ प्रभाव देखा जाता है, तो यह सरल प्रोटोकॉल इन अध्ययनों को अधिक सुसंगत रास्तों के लिए निर्देशित कर सकता है, जहां प्रोटीन कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया में वैकल्पिक स्प्लिसिंग को विनियमित करने की भूमिका निभाता है, उदाहरण के लिए।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Assays अध्ययन करने के लिए ग्लयोब्लास्टोमा आक्रमण की बृहतभक्षककोशिका और Microglia उत्तेजना

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

कैंसर कोशिका लाइनों में जीन अभिव्यक्ति की सशर्त पछाड़ना के लिए Monocytes/मैक्रोफेज की भर्ती का अध्ययन करने के लिए ट्यूमर Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

कक्ष पत्रकों के माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए डॉट परख का उपयोग करना

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

सूखे रक्त और सीरम स्पॉट नमूना भंडारण के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में कैंसर के लिए मार्क्स का मूल्यांकन

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

उपयोग 18F-FDG पीईटी/सीटी इमेजिंग और मात्रात्मक प्रोटोकॉल में ग्लूकोज चयापचय में गतिशील परिवर्तन को मापने के लिए माउस मॉडल फेफड़ों के कैंसर

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

एक Syngeneic अग्नाशय के कैंसर माउस मॉडल अपरिवर्तनीय Electroporation के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

लाइव सेल इमेजिंग परख ग्लियोब्लास्टोमा ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल प्रवासन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

इन विट्रो परख से अध्ययन ट्यूमर-मैक्रोफेज इंटरेक्शन

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

स्त्री रोग और यूरोलॉजिकल कैंसर का अध्ययन करने के लिए वीवो मॉडल में चिकन कोरिओलांटोइक झिल्ली का उपयोग करना

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

लिवर मेटास्टेसिस स्ट्रोमा का अध्ययन करने के लिए कोलोरेक्टल कैंसर ऑर्गेनोइड्स के पोर्टल वेन इंजेक्शन

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...