Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
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Ringraziamo Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, attraverso Grant Temático 2017/03489-1 a JK e borsa di studio a FLB 2018/05350-3) e con il Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) per il finanziamento di questa ricerca. Vorremmo ringraziare il Dott. Adrian Krainer per aver fornito il plasmide pMTE1A e Zerler e colleghi per il loro lavoro nella clonazione E1A. Ringraziamo anche la Dott.ssa Patrícia Moriel, la Dott.ssa Wanda Pereira Almeida, il Prof.

1. Cellule placcanti
NOTA: In questo protocollo descritto, le linee cellulari stabili HEK293, precedentemente generate per l'espressione induttibile stabile di Nek4, sono stateutilizzate 21, tuttavia, lo stesso protocollo è adatto a molte altre linee cellulari, come HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27</...

<ol>
	<li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+Regulatory+Networks:+Functions,+Mechanisms,+and+Evolution.">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. 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I minigeni sono strumenti importanti per determinare gli effetti nello splicing alternativo globale in vivo. Il minigene adenovirale E1A è stato utilizzato con successo per decenni per valutare il ruolo delle proteine aumentando la quantità di queste nella cellula13,14. Qui, proponiamo l'uso minigene E1A per valutare lo splicing alternativo dopo l'esposizione chemioterapeutica. Fu utilizzata una linea cellulare stabile che esprimeva l'isoforma 1 di Nek4, evitan...

Lo splicing è tra i passaggi più importanti nell'elaborazione dell'mRNA eucariotico che avviene simultaneamente alla tappatura a 5 mRNA e alla poliadenylazione di 3'mRNA, che comprende la rimozione dell'introne seguita dalla giunzione dell'esonero. Il riconoscimento dei siti di giunzione (SS) da parte dello spliceosoma, un complesso di ribonucleoproteine contenente piccole ribonucleoproteine (snRNP U1, U2, U4 e U6), piccoli RRNA (snRNA) e diverse proteineregolatorie 1 è necessario per la giunzione.
Oltre alla rimozione dell'introne (splicing costitutivo), negli eucarioti, gli introni possono essere conservati e gli esoni possono essere esclusi, configurando il processo chiamato mRNA alternative splicing (AS). Lo splicing alternativo pre-mRNA espande la capacità di codifica dei genomi eucarioti permettendo la produzione di un numero grande e diversificato di proteine da un numero relativamente piccolo di geni. Si stima che il 95-100% degli mRNA umani che contengono più di un esone possano subire giunzione alternativa2,3. Questo è fondamentale per processi biologici come lo sviluppo neuronale, l'attivazione dell'apoptosi e la risposta allo stress cellulare4, fornendo all'organismo alternative per regolare il funzionamento cellulare utilizzando lo stesso repertorio di geni.
La macchina necessaria per lo splicing alternativo è la stessa utilizzata per lo splicing costitutivo e l'uso delle SS è il principale fattore determinante per l'occorrenza di giunzione alternativa. Lo splicing costitutivo è correlato all'uso di forti siti di giunzione, che di solito sono più simili ai motivi di consenso per il riconoscimento spliceosoma5.
Gli esoni alternativi sono tipicamente riconosciuti in modo meno efficiente rispetto agli esoni costitutivi una volta che i suoi elementi regolatori cis-, le sequenze nelle SS di 5 e 3 che fiancheggiano questi esoni, mostrano una capacità di legame inferiore allo spliceosoma. mRNA contiene anche regioni denominate esaltatori o silenziatori situati in esoni (esaltatori di splicing esonici (ESE) e silenziatori di giunzione esonici (ESS)) e introni (esaltatori di giunzione intronica (ISE) e silenziatori di giunzione intronica (ISSS)) che migliorano o reprimeno l'uso dell'esonero,rispettivamente 5. Queste sequenze sono riconosciute da elementi transre normativi o fattori di splicing (SF). Le SFs sono rappresentate principalmente da due famiglie di proteine, i fattori di splicing ricchi di serina/arginina (SRSF) che si legano alle ESE e alla famiglia delle ribonucleoproteine nucleari eterogenee (hnRNP) che si legano alle sequenze ESS5.
Lo splicing alternativo può essere modulato mediante fosforilazione/ defosforilazione dei trans- fattori che modificano i partner delle interazioni e localizzazione cellulare dei fattori di giunzione6,7,8. L'identificazione di nuovi regolatori dei fattori di splicing può fornire nuovi strumenti per regolare lo splicing e, di conseguenza, alcuni trattamenti contro il cancro.
9, in un profilo di espressione genica del microarray di mRNA, ha osservato cambiamenti consistenti nei livelli di componenti spliceosomiali in 101 linee cellulari e dopo diverse condizioni di stress (farmaci a base di platino, irradiazione gamma, inibitori della topoisomerasi, inibitori della tirosina chinasi e taxani). La relazione tra il modello di giunzione e l'efficacia della chemioterapia è già stata dimostrata nelle cellule tumorali polmonari, che sono resistenti alla chemioterapia, mostrando cambiamenti nel tasso di varianti della caspasi-910. Le cellule HEK293 trattate con pannello chemioterapici mostrano cambiamenti nello splicing con un aumento delle varianti pro-apoptotiche. Gabriel et al.11 ha osservato cambiamenti in almeno 700 eventi di splicing dopo il trattamento con cisplatino in diverse linee cellulari, sottolineando che le vie di splicing sono influenzate dal cisplatino. I modulatori di giunzione hanno già dimostrato attività antitumorale, dimostrando che lo splicing è importante per lo sviluppo tumorale e, principalmente, la risposta chemioterapica12. Pertanto, caratterizzare nuove proteine che regolano lo splicing dopo agenti stressanti cellulari, come la chemioterapica, è molto importante per scoprire nuove strategie di trattamento.
Gli indizi di regolazione alternativa dello splicing dagli studi interactome, particolarmente importanti per caratterizzare funzioni di proteine nuove o non simple, possono richiedere un approccio più generale e semplice per verificare il ruolo reale della proteina in AS. I minigeni sono strumenti importanti per l'analisi del ruolo generale di una proteina che influisce sulla regolazione dello splicing. Contengono segmenti di un gene di interesse contenente regioni genomiche alternativamente spliced e affiancate13. L'utilizzo di uno strumento minigene consente l'analisi dello splicing in vivo con diversi vantaggi come la lunghezza del minigene che è minore e quindi non è una limitazione alla reazione di amplificazione; lo stesso minigene può essere valutato in diverse linee cellulari; tutti i componenti cellulari, principalmente la loro regolazione della modifica post-traslazionale (fosforilazione e cambiamenti nei compartimenti cellulari) sono presenti e possono essereaffrontati 13,14. Inoltre, i cambiamenti nel modello di splicing alternativo possono essere osservati dopo lo stress cellulare e, l'uso di un sistema minigene, consentono di identificare il percorso modulato da diversi stimoli.
Esistono diversi sistemi minigeni già descritti che sono specifici per diversi tipi di eventi di splicing13,14, tuttavia, come saggio preliminare, il minigene E1A15 è un sistema di reporter alternativo molto consolidato per lo studio della selezione delle SS 5 in vivo. Da un solo gene, E1A, cinque mRNA sono prodotti da splicing alternativo basato sulla selezione di tre diversi siti di giunzione 5 ′ e di uno o un sito di giunzione 3 ′ maggiore ominore 16,17,18. L'espressione delle varianti E1A cambia in base al periodo di infezione adenovirale19,20.
Abbiamo dimostrato in precedenza che entrambe le isoforme Nek4 interagiscono con fattori di giunzione come SRSF1 e hnRNPA1 e mentre isoforma 2 cambia minigene E1A splicing alternativo, isoforma 1 non ha alcun effetto inquel 21. Poiché l'isoforma 1 è l'isoforma più abbondante e cambia la resistenza alla chemioterapia e la risposta ai danni al DNA, valutiamo se potrebbe cambiare il minigene E1A alternativo in una condizione di stress.
Il test minigene è un metodo semplice, a basso costo e rapido, poiché ha solo bisogno di estrazione di RNA, sintesi cDNA, amplificazione e analisi del gel di agarosio, e può essere uno strumento utile per valutare poiché un possibile effetto sullo splicing alternativo da parte di una proteina di interessi fino all'effetto di diversi trattamenti sul modello di splicing alternativo cellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

L'elaborazione dell'mRNA prevede più passaggi simultanei per preparare l'mRNA per la traduzione, come 5'capping, aggiunta poli-A e splicing. Oltre allo splicing costitutivo, lo splicing alternativo dell'mRNA consente l'espressione di proteine multifunzionali da un unico gene. Poiché gli studi interactome sono generalmente la prima analisi per proteine nuove o sconosciute, l'associazione della proteina esca con fattori di splicing è un'indicazione che può partecipare al processo di splicing dell'mRNA, ma determinare in quale contesto o quali geni sono regolati è un processo empirico. Un buon punto di partenza per valutare questa funzione è l'utilizzo dello strumento minigene classico. Qui presentiamo l'uso del minigene Adenovirale E1A per valutare i cambiamenti di splicing alternativi dopo diversi stimoli di stress cellulare. Abbiamo valutato lo splicing del minigene E1A nella proteina Nek4 stabilmente sovraespressiva di HEK293 dopo diversi trattamenti stressanti. Il protocollo include la trasfezione minigene E1A, il trattamento cellulare, l'estrazione dell'RNA e la sintesi cDNA, seguita dall'analisi PCR e gel e dalla quantificazione delle varianti spliced E1A. L'uso di questo metodo semplice e consolidato combinato con trattamenti specifici è un punto di partenza affidabile per far luce sui processi cellulari o su quali geni possono essere regolati dallo splicing dell'mRNA.

Un test di siti di giunzione da 5' utilizzando il minigene E1A è stato eseguito per valutare i cambiamenti nel profilo di giunzione nelle cellule dopo l'esposizione della chemioterapia. Il ruolo di Nek4 - isoforma 1 nella regolazione AS nelle cellule stabili HEK293 dopo il trattamento con paclitaxel o cisplatino è stato valutato.
La regione Adenovirale E1A è responsabile della produzione di tre mRNA principali da un precursor...

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Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Questo protocollo presenta uno strumento rapido e utile per valutare il ruolo di una proteina con funzione insolita nella regolazione dello splicing alternativo dopo il trattamento chemioterapico.

Utilizzo dello strumento Minigene E1A per studiare le modifiche allo splicing dell'mRNA

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire indicazioni dettagliate per utilizzare il minigene E1A2 per valutare le modifiche globali allo splicing dell'mRNA. Questo è uno strumento rapido, economico e semplice per valutare la funzione della proteina bersaglio nella regolazione dello splicing alternativo senza la necessità di regimi speciali o condizioni di laboratorio. Inizia coltivando cellule HEK 293 con espressione stabile del gene di interesse.Dividere le cellule utilizzando lo 0,25% di tripside EDTA, quindi placcare 300.000 cellule per pozzo in piastre a sei pozzi e incubarle per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Dopo 24 ore, controllare la confluenza e trasfetto le celle stabili HEK 293 solo quando il 70-80% è confluente. Rimuovere con cura il mezzo di coltura cellulare con una pipetta, quindi aggiungere due millilitri di mezzo DMEM completo senza antibiotici e rimettere la piastra nell'incubatrice.Preparare un tubo con il tampone di trasfezione, quindi aggiungere due microgrammi di DNA, vortice e aggiungere due microlitri di reagente di trasfezione. Vortice di nuovo e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere le piastre dall'incubatrice e aggiungere con cura la miscela di trasfezione per quanto riguarda la goccia.Sei ore dopo la trasfezione, aggiungere la tetraciclina alle celle stabili HEK 293 per l'induzione dell'espressione Nek4. 24 ore dopo la trasfezione, verificare la morfologia cellulare e l'efficienza di trasfezione utilizzando un microscopio fluorescente. Utilizzare una pipetta per rimuovere il mezzo di coltura cellulare, quindi aggiungere il mezzo di coltura cellulare con la chemioterapica.Incubare le cellule per altre 24 ore. Per raccogliere l'RNA, scartare il mezzo di coltura cellulare e aggiungere da 0,5 a 1 millilitro di reagente di estrazione dell'RNA direttamente al pozzo. Se i pozzi sono molto confluenti, utilizzare un millilitro di reagente di estrazione dell'RNA per migliorare la qualità dell'RNA.Omogeneizzare le cellule con una pipetta e trasferirle in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Procedere immediatamente all'estrazione dell'RNA o conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Scongelare i campioni in una cappa aspirante e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Aggiungere da 0,1 a 0,2 millilitri di cloroformio e agitare vigorosamente, quindi incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Centrifugare per 15 minuti a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius, quindi raccogliere la fase acquosa superiore e trasferirla in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Raccogliere circa il 60% del volume totale, ma non raccogliere il DNA o la fase organica.Aggiungere da 0,25 a 0,5 millilitri di isopropanolo e agitare il campione per inversione quattro volte. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 12.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Lavare il pellet di RNA due volte con etanolo e centrifugare a 7.500 volte G per cinque minuti, quindi scartare l'etanolo.Rimuovere l'etanolo in eccesso invertendo il tubo su un tovagliolo di carta, quindi lasciare il tubo aperto all'interno di una cappa aspirante per asciugare parzialmente il pellet per cinque-10 minuti. Sospendere di nuovo il pellet di RNA in 15 microlitri di acqua trattata con DEPC. Quantificare l'RNA totale e verificare la qualità dell'RNA misurando l'assorbanza a 230, 260 e 280 nanometri.Per verificare la qualità totale dell'RNA, eseguire un gel di agarosio dell'1% pretrattato con l'1,2% di una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5% per 30 minuti. Eseguire la sintesi di cDNA utilizzando da uno a due microgrammi di RNA totale. Unire l'RNA, un microlitro di oligo d-T, un microlitro di DNTP e acqua priva di nucleasi a 12 microlitri.Incubare la reazione nel Termociclometro per cinque minuti a 65 gradi Celsius. Rimuovere i campioni dal Thermo Cycler e aggiungere quattro microlitri di tampone di trascrittasi inversa, due microlitri di DTT e un microliter di inibitore della ribonucleasi. Incubare a 37 gradi Celsius per due minuti.Aggiungere un microlitro di trascrittasi inversa termo stabile e incubare a 37 gradi Celsius per 50 minuti. Inattivare l'enzima a 70 gradi Celsius per 15 minuti. Eseguire la PCR come descritto nel manoscritto di testo, quindi caricare da 20 a 25 microlitri del prodotto PCR su un gel di agarosio al 3% contenente macchia di acido nucleico e correre a 100 volt per circa un'ora.Fotografa il gel, evitando qualsiasi saturazione della banda e quantifica le bande utilizzando un software di elaborazione delle immagini. Le bande a 631, 493 e 156 coppie di basi corrispondono rispettivamente alle isoforme 13S, 12S e 9S. Dal menu File del software aprire il file di immagine e convertirlo in scala di grigi.Regolare luminosità e contrasto, quindi rimuovere il rumore outlier, se necessario. Disegnare un rettangolo intorno alla prima corsia con lo strumento di selezione del rettangolo e selezionarlo tramite il comando Analizza, Gel e Seleziona prima corsia oppure utilizzando la scelta rapida da tastiera. Usare il mouse per fare clic e tenere premuto nel mezzo del rettangolo sulla prima corsia e trascinarlo sulla corsia successiva.Passare ad Analizza, Gel e Selezionare Corsia successiva. Ripetere questo passaggio per tutte le corsie rimanenti. Dopo che tutte le corsie sono evidenziate e numerate, vai ad Analyze, Gels e Plot Lanes per disegnare un grafico di profilo di ogni corsia.Utilizzare lo strumento di selezione della linea retta per disegnare una linea attraverso la base di ogni picco, corrispondente a ciascuna banda, tralascio il rumore di fondo. Dopo che tutte le cime di ogni corsia sono state chiuse, selezionare lo strumento bacchetta e fare clic all'interno di ogni picco. Le misurazioni devono apparire nella finestra dei risultati per ogni picco evidenziato.Si consideri solo i picchi 13S, 12S e 9S corrispondenti a 631, 493 e 156 bande di coppie di basi. Copiare i dati sull'intensità per un editor di fogli di calcolo e sommare l'intensità di tutte e tre le bande per ogni campione, quindi calcolare la percentuale per ogni isoforma relativa al totale. Tracciare le percentuali di ogni isoforma o le differenze nella percentuale rispetto ai campioni non trattati.Un plasmide contenente il minigene di E1A è stato utilizzato per osservare l'effetto sullo splicing alternativo valutando la proporzione di mRNA di ogni isoforma prodotta. L'espressione basale delle varianti di isoforme E1A dipendeva dalla linea cellulare e dal tempo dell'espressione E1A. La linea cellulare stabile HEK 293, o sito contenente ricombinazione HEK 293, mostrava un'espressione più alta di 13S rispetto alle cellule HeLa, ma mostrava livelli simili di isoforme 13S e 12S dopo 48 ore di espressione E1A.Le cellule esposte al cisplatino mostravano uno spostamento in cinque prime selezioni di splicing S-S favorendo l'espressione 12S. Questo effetto è stato osservato in HEK 293 che esprime stabilmente il vettore vuoto flag, così come l'isoforma di Nek4. I cambiamenti nello splicing alternativo dopo il trattamento paclitaxel erano molto discreti, ma le direzioni dei cambiamenti erano opposte nelle cellule che esprimevano Flag e Nek4.Quando si esegue questo protocollo, è importante utilizzare controlli transcriptasi non traslattati e non inversi per evitare interpretazioni errate con espressione E1A endogena, principalmente quando si utilizzano celle HEK 293. Dopo aver ottenuto risultati positivi, è possibile valutare lo splicing alternativo di specifici geni correlati alla risposta chemioterapeutica. Quando si osserva qualche effetto, questo semplice protocollo può indirizzare questi studi per percorsi più coerenti, dove la proteina svolge un ruolo regolando lo splicing alternativo nella risposta chemioterapica, per esempio.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Ricerca

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Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Atterramento condizionale dell'espressione genica in linee cellulari del cancro per studiare il reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale

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Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

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Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

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Utilizzando 18F-FDG PET/CT Imaging e l'istologia quantitativa per misurare i cambiamenti dinamici nel metabolismo del glucosio in modelli murini di cancro ai polmoni

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Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Analisi Live Cell Imaging Studio Glioblastoma cerebrale tumore cellule staminali migrazione e invasione

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In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

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Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Iniezione di vena porta di organoidi del cancro del colon-retto per studiare le metastasi epatiche Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...