このプロトコルの全体的な目標は、グローバル mRNA スプライシングの変更を評価するためにミニジーン E1A2 を使用するための詳細なガイダンスを提供することです。これは、特別なレジームや実験室条件の必要なしに代替スプライシング規制でターゲットタンパク質の機能を評価するための迅速で安価で簡単なツールです。まず、目的の遺伝子の安定した発現を有するHEK 293細胞を培養すること。
0.25%トリプシンEDTAを使用して細胞を分割し、6ウェルプレートでウェルあたり300,000個の細胞をプレートし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間インキュベートします。24時間後、合流を確認し、70〜80%コンフルエントの場合にのみHEK 293安定細胞をトランスフェクトする。慎重にピペットで細胞培地を除去し、抗生物質なしで完全なDMEM培地の2ミリリットルを追加し、インキュベーターにプレートを戻します。
トランスフェクションバッファーを使用してチューブを調製し、次いで pMTE1A DNA の 2 マイクログラムを追加し、2 マイクロリットルのトランスフェクション試薬を追加します。再び渦を、室温で10分間インキュベートする。インキュベーターからプレートを取り出し、慎重にトランスフェクション混合物をドロップワイズで追加します。
トランスフェクションの6時間後、NEK4発現誘導のためのHEK 293安定細胞にテトラサイクリンを添加する。トランスフェクションの24時間後、蛍光顕微鏡を用いて細胞形態とトランスフェクション効率を検証します。ピペットを使用して細胞培養培地を除去し、次いで化学療法剤で細胞培養培地を添加する。
さらに24時間細胞をインキュベートする。RNAを収集するには、細胞培養培地を廃棄し、0.5~1ミリリットルのRNA抽出試薬を直接ウェルに添加する。ウェルが非常にコンフルエントである場合は、RNAの品質を向上させるために1ミリリットルのRNA抽出試薬を使用してください。
ピペットで細胞を均質化し、1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。すぐにRNA抽出に進むか、またはマイナス80°Cでサンプルを保存します。ヒュームフードでサンプルを解凍し、室温で5分間インキュベートします。
0.1~0.2ミリリットルのクロロホルムを加え、激しく攪拌し、室温で3分間インキュベートします。遠心分離機は12,000倍Gと摂氏4度で15分間、その後、上の水相を収集し、新しい1.5ミリリットル遠心管に移します。総容積の約60%を収集するが、DNAまたは有機相を収集しないでください。
0.25〜0.5ミリリットルのイソプロパノールを加え、反転によってサンプルを4回攪拌します。室温で10分間インキュベートし、その後12,000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離機を行い、上清を捨てます。RNAペレットをエタノールで2回洗浄し、遠心分離機を7、500倍Gで5分間洗浄し、エタノールを捨てます。
ペーパータオルでチューブを反転させて余分なエタノールを取り除き、チューブをヒュームフードの内側に開けてペレットを5~10分間部分的に乾燥させます。RNAペレットを15マイクロリットルのDEPC処理水で再懸濁します。230、260、280ナノメートルで吸光度を測定することで、全RNAを定量化し、RNAの品質を検証します。
RNAの全品質を確認するには、2.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液の1.2%を30分間前処理した1%のアガロースゲルを実行します。RNAの1~2マイクログラムを用いてcDNA合成を行います。RNA、オリゴd-Tの1マイクロリットル、DNTPの1マイクロリットル、ヌクレアーゼフリー水を12マイクロリットルに組み合わせます。
サーモサイクラーで反応を摂氏65度で5分間インキュベートします。サーモサイクラーからサンプルを取り出し、逆転写酵素バッファーの4マイクロリットル、DTTの2マイクロリットル、およびリボヌクレアーゼ阻害剤の1マイクロリットルを加える。摂氏37度で2分間インキュベートします。
熱安定性の逆転写酵素を1マイクロリットル加え、摂氏37度で50分間インキュベートします。70°Cで酵素を15分間不活性化します。テキスト原稿に記載されているとおりPCRを実行し、核酸染色を含む3%アガロースゲルにPCR産物20~25マイクロリットルをロードし、約1時間100ボルトで実行します。
任意のバンド飽和を避けてゲルを撮影し、画像処理ソフトウェアを使用してバンドを定量化します。631、493、および 156 塩基対のバンドは、それぞれ 13S、12S、および 9S アイソフォームに対応します。ソフトウェアの[ファイル]メニューから、イメージファイルを開き、グレースケールに変換します。
明るさとコントラストを調整し、必要に応じて外れ値のノイズを除去します。長方形選択ツールを使用して最初の車線の周囲に長方形を描き、[解析]、[ゲル]、および [最初の車線を選択]コマンドを使用するか、キーボード ショートカットを使用して選択します。マウスを使用して、最初の車線の長方形の中央をクリックして押さえた後、次のレーンにドラッグします。
[解析]、[ゲル]、および [次のレーン] を選択します。残りのすべてのレーンに対してこの手順を繰り返します。すべての車線がハイライト表示され、番号が付いた後、[解析]、[ゲル]、[プロット レーン] に移動して、各車線のプロファイル プロットを描画します。
直線選択ツールを使用して、各帯に対応する各ピークの底部に線を引き、バックグラウンドノイズを省きます。すべての車線からすべてのピークが閉じられた後、杖ツールを選択し、各ピーク内をクリックします。ハイライトされた各ピークの結果ウィンドウに測定値がポップアップ表示されます。
631、493、および 156 の基本ペア・バンドに対応する 13S、12S、および 9S のピークのみを考慮してください。スプレッドシート エディタの強度データをコピーし、各サンプルの 3 つのバンドすべてから強度を合計し、合計に対する各アイソフォームの割合を計算します。各アイソフォームのパーセンテージ、または未処理サンプルに対する割合の差をプロットします。
E1Aからミニジーンを含むプラスミドを用いて、生成した各アイソフォームからのmRNAの割合を評価することによって代替スプライシングに対する効果を観察した。E1Aアイソフォーム変異体の基底式発現は、E1A発現の細胞株および時間に依存した。HEK293安定細胞株、またはHEK 293リコンビナーゼ含有部位は、HeLa細胞と比較して13Sの高い発現を示したが、48時間後に同様のレベルの13Sおよび12Sアイソフォームを示した。
シスプラチンに曝露された細胞は、12S発現を支持する5つのプライムS-Sスプライシング選択におけるシフトを示した。この効果は、フラグ空ベクトルを安定的に発現させるHEK 293で観察された、ならびにNek4のアイソフォーム1と同様である。パクリタキセル処理後の代替スプライシングの変化は非常に慎重であったが、変化の方向はFlagおよびNek4発現細胞では反対であった。
このプロトコルを実行する場合、主にHEK 293細胞を使用する場合、内因性E1A発現との誤解を避けるために、未感染および非逆転写酵素コントロールを使用することが重要です。陽性の結果を得た後、化学療法応答に関連する特定の遺伝子の代替スプライシングを評価することができる。何らかの効果が観察されると、この単純なプロトコルは、タンパク質が化学療法応答における代替スプライシングを調節する役割を果たす、より一貫した経路のためにこれらの研究を指示することができる。
