Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
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我々は、フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP、グラント・テマティコ2017/03489-1を通じて、JKとFLB 2018/05350-3へのフェローシップ)とコンセルホ・ナシオナル・デ・デセンボルメント・チエンティフィコ・エ・デセンボルメント・チエンティフィコ・エ・デセンボルメント・チエンティフィコ・エ・ココモ(この資金)に感謝します。私たちは、PMTE1AプラスミドとZerlerとE1Aクローニングでの彼らの仕事のためにpMTE1AプラスミドとZerlerと同僚を提供してくれたエイドリアン・クレイナー博士に感謝したいと思います。また、パトリシア・モリエル教授、ワンダ・ペレイラ・アルメイダ博士、マルセロ・ランチェロッティ教授、カリーナ・コゴ・コゴ・ミュラー教授の研究室スペースと機器の使用に感謝します。

1. めっき細胞
注: このプロトコルでは、以前に Nek4 の安定な誘導発現のために生成された HEK293 安定セルラインが21を使用したが、HEK293 22、HeLa23、24、25、26、U-2OS27、COS728、SH-SY5Y29のような他の多くの細胞株に適した同じプロ...

<ol>
	<li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+Regulatory+Networks:+Functions,+Mechanisms,+and+Evolution.">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing.">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li><li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing:+a+new+dimension+of+the+human+genome.">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Misteli, T., C&#225;ceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo.">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li><li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins.">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li><li>Anufrieva, K. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells.">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li><li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis.">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li><li>Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer.">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties.">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li><li>Berk, A. J., Sharp, P. 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C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms:+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing.">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus.">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li><li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival.">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li><li>Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4.">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).</li><li>Jarn&#230;ss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+Factor+Arginine/Serine-rich+17A+(SFRS17A)+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments.">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li><li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+of+human+Ki-1/57+with+pre-mRNA+splicing+events.">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li><li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2.">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).</li><li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+gel:+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality.">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+3'+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF/SF2+and+hnRNP+A1.">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li><li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT/CGRP+precursor+mRNA.">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li></ol>

ミニ遺伝子は、生体内のグローバル代替スプライシングの効果を決定するための重要なツールです。このアデノウイルスミニジーンE1Aは、細胞13,14におけるこれらの量を増加させることによってタンパク質の役割を評価するために何十年も正常に使用されてきた。ここでは、化学療法曝露後の代替スプライシングを評価するためのミニジーンE1Aの使...

スプライシングは、5'mRNAキャッピングと3'mRNAポリアデニル化に同時に発生する真核生物mRNA処理における最も重要なステップの一つです。スプライセオソームによるスプライシング部位(SS)の認識には、小さなリボヌクレオタンパク質(snRNP U1、U2、U4およびU6)を含むリボヌクレオタンパク質複合体、小さなRNA(snRNA)およびいくつかの調節タンパク質1 がスプライシングに必要である。
イントロン除去(構成スプライシング)に加えて、真核生物では、イントロンを保持することができ、エキソンを除外することができ、mRNA代替スプライシング(AS)と呼ばれるプロセスを構成する。代替プレmRNAスプライシングは、真核生物ゲノムのコード容量を拡大し、比較的少数の遺伝子から多数のタンパク質を産生することを可能にする。複数のエキソンを含むヒトmRNAの95〜100%が代替スプライシング2,3を受けることができると推定される。これは、神経細胞の発達、アポトーシス活性化および細胞ストレス応答4のような生物学的プロセスの基本であり、同じレパートリー遺伝子を使用して細胞機能を調節する生物の代替手段を提供する。
代替スプライシングに必要な機械は、構成スプライシングに使用されるのと同じであり、SSの使用は、代替スプライシングの発生のための主要な決定要因です。構成スプライシングは、強いスプライシング部位の使用に関連しており、これは通常、スプライセソーム認識のためのコンセンサスモチーフに類似している5。
代替エキソンは、典型的には、その シス−調節要素の一度構成エキソンよりも効率が低く認識され、これらのエキソンに隣接する5'SSおよび3'SSの配列は、スプライセソームに対する劣った結合能力を示す。mRNAはまた、エキソン(エキソニックスプライシングエンハンサー(ESE)およびエキソニックスプライシングサイレンサー(ESS))およびイントロン(イントロニックスプライシングエンハンサー(ISE)およびイントロニックスプライシングサイレンサー(ISS))に位置するエンハンサーまたはサイレンサーと名付けられた領域を含み、それぞれ5。これらの配列は、トランス調節要素、またはスプライシング因子(SF)によって認識される。SFは、主に、ESEsに結合するセリン/アルギニンリッチスプライシング因子(SRSF)とESSs配列5に結合する異種核リボヌクレオタンパク質(hnRNP)ファミリーの2つのファミリーのタンパク質によって表される。
代替スプライシングは、スプライシング因子6、7、8の相互作用パートナーおよび細胞局在化を修飾するトランス因子のリン酸化/脱リン酸化によって変調することができる。スプライシング因子の新しい調節因子を同定することは、スプライシングを調節するための新しいツールを提供することができ、その結果、いくつかの癌治療。
Anufrievaら 9は、mRNAマイクロアレイ遺伝子発現プロファイルにおいて、101細胞株および異なるストレス状態(白金系薬物、ガンマ照射、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびタキサン)におけるスプライセソーム成分のレベルにおける一貫した変化を観察した。スプライシングパターンと化学療法効果の関係は、化学療法耐性である肺癌細胞において既に実証されており、カスパーゼ-9変異体の変化率10を示す。化学療法パネルで治療されたHEK293細胞は、プロアポトーシス変異体の増加に伴うスプライシングの変化を示す。Gabriel et al.11 は、異なる細胞株におけるシスプラチン処理後のスプライシングの少なくとも700の事象の変化を観察し、スプライシング経路がシスプラチンに影響を受けていることを指摘した。スプライシングモジュレーターは既に抗腫瘍活性を実証しており、スプライシングが腫瘍の発達にとって重要であることを示し、主に化学療法応答12.したがって、化学療法薬のような細胞ストレッサー剤の後にスプライシングを調節する新しいタンパク質を特徴付けることは、治療の新しい戦略を発見するために非常に重要です。
相互作用研究からの代替スプライシング調節の手がかりは、特に新しいまたは特徴のないタンパク質の機能を特徴付けるために重要であり、ASにおけるタンパク質の実際の役割を検証するためのより一般的で簡単なアプローチを要求することができる。ミニ遺伝子は、スプライシング調節に影響を与えるタンパク質の一般的な役割の分析のための重要なツールです。それらは、代わりにスプライスおよび横たわるゲノム領域13を含む目的の遺伝子からのセグメントを含む。ミニジーンツールを使用すると、マイナーであり、したがって増幅反応に制限されないミニジーンの長さなどのいくつかの利点を持つin vivoのスプライシングの分析が可能になります。同じミニ遺伝子を異なる細胞株で評価することができます。すべての細胞成分は、主に翻訳後修飾(リン酸化および細胞区画の変化)の調節が存在し、13,14に対処することができる。さらに、代替スプライシングパターンの変化は、細胞ストレス後に観察され、かつ、ミニ遺伝子系を用いることで、異なる刺激によって変調される経路を同定することを可能にする。
スプライシングイベント13,14の異なる種類に特異的なミニジーンシステムが既にいくつか存在するが、予備的なアッセイとして、ミニジーンE1A15は、生体内での5'SS選択の研究のための非常に確立された代替スプライシングレポーターシステムである。1つの遺伝子のみから、E1A、5つのmRNAは、3つの異なる5′スプライス部位の選択に基づいて代替スプライシングによって生成され、1つの主要なまたは1つのマイナーな3′スプライス部位16、17、18の。E1A変異体の発現は、アデノウイルス感染の期間19、20に従って変化する。
我々は、両方のNek4アイソフォームがSRSF1およびhnRNPA1などのスプライシング因子と相互作用することを以前に示しており、アイソフォーム2はミニジーンE1A代替スプライシングを変化させるが、アイソフォーム1はその21では効果を有さない。アイソフォーム1は最も豊富なアイソフォームであり、化学療法抵抗とDNA損傷応答を変化させるため、ストレス状態でミニジーンE1A代替スプライシングを変えることができるかどうかを評価します。
Minigeneアッセイは、単純で低コストで迅速な方法であり、RNA抽出、cDNA合成、増幅およびアガロースゲル分析のみが必要であり、細胞代替スプライシングパターンに対する異なる治療法の影響まで、興味のあるタンパク質による代替スプライシングに対する効果が得られるため、評価に有用なツールとなり得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

mRNA処理には、5'キャッピング、ポリA付加、スプライシングなどの翻訳用mRNAを準備するための複数の同時ステップが必要です。構成的なスプライシングに加えて、代替mRNAスプライシングは、1つの遺伝子から多機能タンパク質の発現を可能にする。相互作用研究は一般的に新しいまたは未知のタンパク質に対する最初の分析であるため、餌タンパク質とスプライシング因子との関連は、mRNAスプライシングプロセスに参加できることを示すが、どのような文脈で、またはどの遺伝子が調節されているかを決定することは経験的プロセスである。この関数を評価する良い出発点は、古典的なミニジーンツールを使用することです。ここでは、異なる細胞ストレス刺激後の代替スプライシング変化を評価するためのアデノウイルスE1Aミニジーンの使用法を提示する。異なるストレス処理の後に、HEK293におけるE1Aミニジーンのスプライシングを安定的に過剰発現させるNek4タンパク質のスプライシングを評価した。このプロトコルは、E1Aミニジーントランスフェクション、細胞処理、RNA抽出およびcDNA合成、続いてPCRおよびゲル分析およびE1Aスプライス変異体の定量化を含む。特定の治療法と組み合わせたこのシンプルで確立された方法の使用は、細胞プロセスやmRNAスプライシングによって調節できる遺伝子に光を当てる信頼できる出発点です。

E1Aミニジーンを用いた5'スプライス部位アッセイを行い、化学療法博覧会後の細胞におけるスプライシングプロファイルの変化を評価した。パクリタキセルまたはシスプラチン処理後のHEK293安定細胞におけるAS調節におけるNek4-アイソフォーム1の役割を評価した。
アデノウイルスE1A領域は、異なるスプライスドナーの使用?...

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Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

このプロトコルは、化学療法治療後の代替スプライシング調節において特徴のない機能を有するタンパク質の役割を評価するための迅速かつ有用なツールを提示する。

E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

このプロトコルの全体的な目標は、グローバル mRNA スプライシングの変更を評価するためにミニジーン E1A2 を使用するための詳細なガイダンスを提供することです。これは、特別なレジームや実験室条件の必要なしに代替スプライシング規制でターゲットタンパク質の機能を評価するための迅速で安価で簡単なツールです。まず、目的の遺伝子の安定した発現を有するHEK 293細胞を培養すること。0.25%トリプシンEDTAを使用して細胞を分割し、6ウェルプレートでウェルあたり300,000個の細胞をプレートし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間インキュベートします。24時間後、合流を確認し、70〜80%コンフルエントの場合にのみHEK 293安定細胞をトランスフェクトする。慎重にピペットで細胞培地を除去し、抗生物質なしで完全なDMEM培地の2ミリリットルを追加し、インキュベーターにプレートを戻します。トランスフェクションバッファーを使用してチューブを調製し、次いで pMTE1A DNA の 2 マイクログラムを追加し、2 マイクロリットルのトランスフェクション試薬を追加します。再び渦を、室温で10分間インキュベートする。インキュベーターからプレートを取り出し、慎重にトランスフェクション混合物をドロップワイズで追加します。トランスフェクションの6時間後、NEK4発現誘導のためのHEK 293安定細胞にテトラサイクリンを添加する。トランスフェクションの24時間後、蛍光顕微鏡を用いて細胞形態とトランスフェクション効率を検証します。ピペットを使用して細胞培養培地を除去し、次いで化学療法剤で細胞培養培地を添加する。さらに24時間細胞をインキュベートする。RNAを収集するには、細胞培養培地を廃棄し、0.5~1ミリリットルのRNA抽出試薬を直接ウェルに添加する。ウェルが非常にコンフルエントである場合は、RNAの品質を向上させるために1ミリリットルのRNA抽出試薬を使用してください。ピペットで細胞を均質化し、1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。すぐにRNA抽出に進むか、またはマイナス80°Cでサンプルを保存します。ヒュームフードでサンプルを解凍し、室温で5分間インキュベートします。0.1~0.2ミリリットルのクロロホルムを加え、激しく攪拌し、室温で3分間インキュベートします。遠心分離機は12,000倍Gと摂氏4度で15分間、その後、上の水相を収集し、新しい1.5ミリリットル遠心管に移します。総容積の約60%を収集するが、DNAまたは有機相を収集しないでください。0.25〜0.5ミリリットルのイソプロパノールを加え、反転によってサンプルを4回攪拌します。室温で10分間インキュベートし、その後12,000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離機を行い、上清を捨てます。RNAペレットをエタノールで2回洗浄し、遠心分離機を7、500倍Gで5分間洗浄し、エタノールを捨てます。ペーパータオルでチューブを反転させて余分なエタノールを取り除き、チューブをヒュームフードの内側に開けてペレットを5~10分間部分的に乾燥させます。RNAペレットを15マイクロリットルのDEPC処理水で再懸濁します。230、260、280ナノメートルで吸光度を測定することで、全RNAを定量化し、RNAの品質を検証します。RNAの全品質を確認するには、2.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液の1.2%を30分間前処理した1%のアガロースゲルを実行します。RNAの1~2マイクログラムを用いてcDNA合成を行います。RNA、オリゴd-Tの1マイクロリットル、DNTPの1マイクロリットル、ヌクレアーゼフリー水を12マイクロリットルに組み合わせます。サーモサイクラーで反応を摂氏65度で5分間インキュベートします。サーモサイクラーからサンプルを取り出し、逆転写酵素バッファーの4マイクロリットル、DTTの2マイクロリットル、およびリボヌクレアーゼ阻害剤の1マイクロリットルを加える。摂氏37度で2分間インキュベートします。熱安定性の逆転写酵素を1マイクロリットル加え、摂氏37度で50分間インキュベートします。70°Cで酵素を15分間不活性化します。テキスト原稿に記載されているとおりPCRを実行し、核酸染色を含む3%アガロースゲルにPCR産物20~25マイクロリットルをロードし、約1時間100ボルトで実行します。任意のバンド飽和を避けてゲルを撮影し、画像処理ソフトウェアを使用してバンドを定量化します。631、493、および 156 塩基対のバンドは、それぞれ 13S、12S、および 9S アイソフォームに対応します。ソフトウェアの[ファイル]メニューから、イメージファイルを開き、グレースケールに変換します。明るさとコントラストを調整し、必要に応じて外れ値のノイズを除去します。長方形選択ツールを使用して最初の車線の周囲に長方形を描き、[解析]、[ゲル]、および [最初の車線を選択]コマンドを使用するか、キーボード ショートカットを使用して選択します。マウスを使用して、最初の車線の長方形の中央をクリックして押さえた後、次のレーンにドラッグします。[解析]、[ゲル]、および [次のレーン] を選択します。残りのすべてのレーンに対してこの手順を繰り返します。すべての車線がハイライト表示され、番号が付いた後、[解析]、[ゲル]、[プロット レーン] に移動して、各車線のプロファイル プロットを描画します。直線選択ツールを使用して、各帯に対応する各ピークの底部に線を引き、バックグラウンドノイズを省きます。すべての車線からすべてのピークが閉じられた後、杖ツールを選択し、各ピーク内をクリックします。ハイライトされた各ピークの結果ウィンドウに測定値がポップアップ表示されます。631、493、および 156 の基本ペア・バンドに対応する 13S、12S、および 9S のピークのみを考慮してください。スプレッドシート エディタの強度データをコピーし、各サンプルの 3 つのバンドすべてから強度を合計し、合計に対する各アイソフォームの割合を計算します。各アイソフォームのパーセンテージ、または未処理サンプルに対する割合の差をプロットします。E1Aからミニジーンを含むプラスミドを用いて、生成した各アイソフォームからのmRNAの割合を評価することによって代替スプライシングに対する効果を観察した。E1Aアイソフォーム変異体の基底式発現は、E1A発現の細胞株および時間に依存した。HEK293安定細胞株、またはHEK 293リコンビナーゼ含有部位は、HeLa細胞と比較して13Sの高い発現を示したが、48時間後に同様のレベルの13Sおよび12Sアイソフォームを示した。シスプラチンに曝露された細胞は、12S発現を支持する5つのプライムS-Sスプライシング選択におけるシフトを示した。この効果は、フラグ空ベクトルを安定的に発現させるHEK 293で観察された、ならびにNek4のアイソフォーム1と同様である。パクリタキセル処理後の代替スプライシングの変化は非常に慎重であったが、変化の方向はFlagおよびNek4発現細胞では反対であった。このプロトコルを実行する場合、主にHEK 293細胞を使用する場合、内因性E1A発現との誤解を避けるために、未感染および非逆転写酵素コントロールを使用することが重要です。陽性の結果を得た後、化学療法応答に関連する特定の遺伝子の代替スプライシングを評価することができる。何らかの効果が観察されると、この単純なプロトコルは、タンパク質が化学療法応答における代替スプライシングを調節する役割を果たす、より一貫した経路のためにこれらの研究を指示することができる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

ドットの試金を使用して細胞シートの移行を分析するには

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

がんバイオ マーカーを評価するサンプル貯蔵のための便利なツールとして血液や血清スポットを乾燥

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

肺癌のマウスモデルにおける糖代謝の動的変化を測定する18F-FDG PET/CT イメージングと定量組織学を活用

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウス モデル

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

生体内における鶏絨毛性膜モデルを用いて婦人科癌と泌尿器科癌を研究する

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

肝転移間質を研究するための結腸直腸癌オルガノイドの門脈注入

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...