腫瘍関連マクロファージは、腫瘍微小環境において重要な役割を果たす。腫瘍細胞の異なる遺伝子変異がマクロファージの採用に与える影響を理解することは、がん患者のためのパーソナライズされた治療法を設計するために重要です。このアッセイは、腫瘍細胞とマクロファージの相互作用をインビトロで評価する簡単で堅牢な方法を提供します。
このアッセイは、腫瘍細胞と他の免疫細胞との相互作用をインビトロで評価するために修飾することができる。この手順を開始するには、無血清幹細胞培地を摂氏37度の水浴に20分間入れ、温めます。70%エタノールで組織培養フード表面をスプレーし、ペーパータオルでスプレーした表面を拭き取ります。
次に、培地と細胞剥離液のボトルに70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで拭き取ります。洗浄したボトルを組織培養フードに移します。腫瘍細胞を取り出し、組織培養フードに移します。
培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞を洗います。その後、フラスコに2ミリリットルの細胞剥離液を加える。ボンネットにフラスコを下ろし、毎分腫瘍細胞が切り上げられたかどうかを確認します。
腫瘍細胞が切り上がったら、フラスコの側面をそっとタップして細胞が切り離されるのを助けます。この後、8ミリリットルの無血清細胞培地をフラスコにピペットし、ピペットを3回上下に混合する。この細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管と遠心分離機を200倍g、摂氏4度で5分間移します。
上清を吸引する。その後、PBSの10ミリリットルで細胞を洗浄し、混合するために3〜5回上下ピペットすることを確認します。200倍gで細胞を遠心分離し、摂氏4度で5分間遠心する。
上清を吸引し、細胞を10ミリリットルの無血清培地で再懸濁させた。ピペットは3〜5回上下して混ぜます。このセル懸濁液の10マイクロリットルを、10マイクロリットルのトリパンブルー溶液と混合します。
次に、トリパンブルーとセル混合物のピペット10マイクロリットルを計数スライドに入れ、自動セルカウンターを使用して生細胞数を定量化する。無血清細胞培地を使用して、細胞密度を1ミリリットル当たり5番目の細胞に2.5倍に調整します。その後、6ウェル培養プレートの各ウェルに細胞の2ミリリットルを播種します。
同時に、無血清幹細胞培地を2ミリリットルで6つのウェルを調製します。この後、摂氏37度で6ウェルプレートを5%の二酸化炭素で24時間インキュベートします。まず、70%エタノールで組織培養フード表面をスプレーし、スプレーされた表面をペーパータオルで拭き取ります。
次に、培地と細胞剥離液のボトルに70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで拭き取ります。洗浄したボトルを組織培養フードに移します。この後、インキュベーターから6ウェルプレートを取り出します。
慎重に15ミリリットルの無菌遠心分離チューブに調整された培地をピペットし、氷の上にチューブを置きます。6ウェルプレートの各ウェルに0.5ミリリットルの細胞剥離液を加え、腫瘍細胞が切り上げられたかどうかを毎分チェックします。腫瘍細胞が切り上がったら、プレートの側面をそっとタップして細胞を取り外します。
次のピペット2.5ミリリットルの腫瘍細胞維持培地をウェルに入れ、ピペットを3回上下して混合する。細胞を15ミリリットルの無菌遠心分離チューブに移します。10マイクロリットルのトリパンブルー溶液と10マイクロリットルの細胞を混合し、この混合物の10マイクロリットルを計数スライドに移します。
自動細胞カウンターを使用して生細胞数を定量化し、一晩摂氏37度でインキュベートした無血清幹細胞培地を使用して、細胞数に応じてコンディショニングされた培地の体積を調整する。0.45マイクロメートルフィルターを通して調整された媒体をフィルターし、氷の上に条件の付いた媒体を置く。まず、摂氏37度の水浴でIMDM培地を20分間温めます。
70%エタノールで組織培養フードを洗浄し、培地のボトルをきれいにし、前述のようにフードに輸送します。次に、MV-4-11細胞のフラスコをボンネットに移します。ピペット10ミリリットルの細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに入る。
Trypan Blue と自動セル カウンターを使用して、前に説明したとおりに、生きているセルの数を定量化します。その後、細胞を200倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を吸引し、PBSの10ミリリットルで細胞を洗浄します。
200倍gで再び遠心分離機、摂氏4度で5分間。上清を吸引し、IMDM培地中の細胞を1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終的な細胞密度で再懸濁させる。まず、必要な材料を室温にしてください。
各挿入に、調製したMV-4-11セルの250マイクロリットルを加えます。次に、24ウェルプレートの下のチャンバーにのみ、調整された培地または培地の400マイクロリットルを追加し、サンプルを三重に追加することを確認します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で4時間インキュベートします。
次に、同じウェルの内壁のインサートを軽くタップし、挿入物を捨てます。ウェル内の細胞を上下に3回軽くピペットして混合します。この細胞懸濁液の225マイクロリットルを、蛍光測定に適した黒壁の96ウェルプレートのウェルに移します。
この後、CyQUANT色素を4xリシスバッファーで1~75の比率で希釈します。渦を短時間で回転させ、ソリューションをスピンダウンします。この溶液の75マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに移し、室温で15分間インキュベートします。
蛍光プレートリーダーを使用して、蛍光を読み取り、テキストプロトコルに概説されているようにデータを分析します。本研究では、腫瘍マクロファージ相互作用を研究するためにインビトロアッセイを用いる。蛍光値の高いサンプルは、コンディションされた培地がマクロファージをリクルートする能力が高いことを示しています。
実験の必要性に応じて、追加の制御を含めることができます。例えば、中和抗体を使用して、コンディションされた培地を治療してマクロファージの化学軸を廃止し、同じように行うことができます。また、条件付きメディアに余分なケモカインを追加し、ポジティブコントロールとして機能します。
このアッセイでは細胞の数の違いを制御することが重要です。インビトロの結果のインビボ確認は重要です。マウスに腫瘍細胞を注入し、フローサイトメトリー、免疫染色、およびCyTOFで腫瘍を分析し、結果を確認することができます。
