Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Vi takker Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, gjennom Grant Temático 2017/03489-1 til JK og stipendiatstilling til FLB 2018/05350-3) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) for finansiering av denne forskningen. Vi vil gjerne takke Dr Adrian Krainer for å gi pMTE1A plasmid og Zerler og kolleger for deres arbeid i E1A kloning. Vi takker også professor Dr. Patrícia Moriel, prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, prof. Dr. Marcelo Lancellotti og prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller for å tillate oss å bruke laboratorieplassen og utstyret deres.

1. Plating celler
MERK: I denne beskrevne protokollen ble HEK293 stabile cellelinjer, tidligere generert for stabilt inducible uttrykk for Nek4, brukt21, men den samme protokollen passer for mange andre cellelinjer, for eksempel HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, S...

<ol>
	<li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+Regulatory+Networks:+Functions,+Mechanisms,+and+Evolution.">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing.">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li><li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing:+a+new+dimension+of+the+human+genome.">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Misteli, T., C&#225;ceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo.">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li><li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins.">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li><li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells.">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).</li><li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells.">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li><li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis.">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li><li>Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer.">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li><li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells.">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li><li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts:+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3'+splice+site.">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li><li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins.">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li><li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties.">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li><li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs.">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li><li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusj&#228;rvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential.">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li><li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms:+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing.">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus.">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li><li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival.">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li><li>Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4.">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).</li><li>Jarn&#230;ss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+Factor+Arginine/Serine-rich+17A+(SFRS17A)+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments.">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li><li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+of+human+Ki-1/57+with+pre-mRNA+splicing+events.">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li><li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2.">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).</li><li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+gel:+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality.">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+3'+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF/SF2+and+hnRNP+A1.">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li><li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT/CGRP+precursor+mRNA.">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li></ol>

Minigenes er viktige verktøy for å bestemme effektene i global alternativ skjøting in vivo. Den adenovirale minigene E1A har blitt brukt med hell i flere tiår for å evaluere proteinenes rolle ved å øke mengden av disse i celle13,14. Her foreslår vi minigene E1A-bruk for å evaluere alternativ skjøting etter kjemoterapeutisk eksponering. En stabil cellelinje som uttrykker Nek4 isoform 1 ble brukt, og unngår artefakter av overekspression forårsaket av fo...

Skjøting er blant de viktigste trinnene i eukaryotisk mRNA-behandling som skjer samtidig til 5'mRNA capping og 3'mRNA polyadenylering, bestående av intronfjerning etterfulgt av exon junction. Anerkjennelsen av skjøteplassene (SS) av skjøteosomet, et ribonucleoproteinkompleks som inneholder små ribonukleoproteiner (snRNP U1, U2, U4 og U6), små RNAer (snRNAer) og flere regulatoriske proteiner1 er nødvendig for skjøting.
Foruten intronfjerning (konstituerende skjøting), i eukaryoter, kan introner beholdes og eksoner kan utelukkes, og konfigurerer prosessen som kalles mRNA alternativ skjøting (AS). Den alternative pre-mRNA skjøtingen utvider kodingskapasiteten til eukaryote genomer slik at produksjonen av et stort og mangfoldig antall proteiner fra et relativt lite antall gener. Det er anslått at 95-100% av menneskelige mRNAer som inneholder mer enn en exon kan gjennomgå alternativ skjøting2,3. Dette er grunnleggende for biologiske prosesser som nevronutvikling, apoptoseaktivering og cellulær stressrespons4, og gir organismealternativene for å regulere cellefunksjon ved hjelp av samme repertoar av gener.
Maskinene som er nødvendige for alternativ skjøting er det samme som brukes til konstituerende skjøting, og bruken av SS er hoveddeterminanten for alternativ skjøteforekomst. Konstituerende skjøting er relatert til bruk av sterke skjøteplasser, som vanligvis ligner mer på konsensusmotiver for skjøtemosomgjenkjenning5.
Alternative eksoner er vanligvis anerkjent mindre effektivt enn konstitutive eksoner når dens cis-regulatoriskeelementer, sekvensene i 5'SS og 3'SS flanking disse exons, viser en dårligere bindende kapasitet til skjøteosomet. mRNA inneholder også regioner som kalles forsterkere eller lyddempere plassert i eksoner (eksoniske skjøteforsterkere (ESE) og eksoniske skjøte lyddempere (ESSs)) og introner (introniske skjøteforsterkere (ISE) og introniske skjøte lyddempere (ISSs)) som forbedrer eller undertrykker eksonbruk, henholdsvis5. Disse sekvensene gjenkjennes av transregulatoriske elementer, eller skjøtefaktorer (SF). SFs er representert hovedsakelig av to familier av proteiner, serin / arginin rike skjøtefaktorer (SRSFer) som binder seg til ESE og familien av heterogene kjernefysiske ribonukleoproteiner (hnRNPer) som binder seg til ESSs-sekvenser5.
Alternativ skjøting kan moduleres ved fosforylering/ defosforylering av transfaktorer som endrer interaksjonspartnerne og cellulær lokalisering av skjøtefaktorer6,7,8. Identifisering av nye regulatorer av skjøtefaktorer kan gi nye verktøy for å regulere skjøting og følgelig noen kreftbehandlinger.
Anufrieva et al.9, i en mRNA mikroarray genuttrykksprofil, observerte konsistente endringer i nivåer av spleiseosomale komponenter i 101 cellelinjer og etter forskjellige stressforhold (platinabaserte legemidler, gammabestråling, topoisomerasehemmere, tyrosinkinasehemmere og taxanes). Forholdet mellom skjøtemønster og kjemoterapi effekt er allerede vist i lungekreftceller, som er kjemoterapi resistente, viser endringer i caspase-9 varianter rate10. HEK293 celler behandlet med kjemoterapeutisk panel viser endringer i skjøting med en økning i pro-apoptotiske varianter. Gabriel et al.11 observerte endringer i minst 700 tilfeller av skjøting etter cisplatinbehandling i forskjellige cellelinjer, og påpekte at skjøtebaner er cisplatin-påvirket. Skjøtemodulatorer har allerede vist anti-tumoral aktivitet, som viser at skjøting er viktig for tumorutvikling og hovedsakelig kjemoterapirespons12. Derfor er karakterisering av nye proteiner som regulerer skjøting etter cellulære stressorer, som kjemoterapeutiske midler, svært viktig for å oppdage nye behandlingsstrategier.
Ledetrådene om alternativ skjøteregulering fra interaktivitetsstudier, spesielt viktig for å karakterisere funksjoner av nye eller ukarakteriserte proteiner, kan kreve en mer generell og enkel tilnærming for å verifisere proteinets reelle rolle i AS. Minigenes er viktige verktøy for analyse av den generelle rollen til et protein som påvirker skjøtereguleringen. De inneholder segmenter fra et gen av interesse som inneholder alternativt spleisede og flankende genomiske regioner13. Ved hjelp av et minigene verktøy tillater analysen av skjøting in vivo med flere fordeler som lengden på minigene som er mindre og derfor ikke er en begrensning i forsterkningsreaksjonen; den samme minigene kan evalueres i forskjellige cellelinjer; alle cellulære komponenter, hovedsakelig deres regulerende post-translasjonsmodifikasjon (fosforylering og endringer i cellerom) er til stede og kan adresseres13,14. Videre kan endringer i alternativt skjøtemønster observeres etter cellulært stress og, bruken av et minigensystem, tillate å identifisere banen som moduleres av forskjellige stimuli.
Det er flere minigene systemer som allerede er beskrevet som er spesifikke for ulike typer skjøtehendelser13,14, men som en foreløpig analyse er minigeneE1A 15 et meget godt etablert alternativt skjøtereportersystem for studiet av 5'SS utvalg in vivo. Fra bare ett gen, E1A, produseres fem mRNAer ved alternativ skjøting basert på utvalg av tre forskjellige 5′ skjøteplasser og av en stor eller en mindre 3′ skjøte sted16,17,18. Uttrykket av E1A-varianter endres i henhold til perioden for Adenoviral infeksjon19,20.
Vi har tidligere vist at både Nek4 isoformer samhandler med skjøtefaktorer som SRSF1 og hnRNPA1, og mens isoform 2 endrer minigene E1A alternativ skjøting, isoform 1 har ingen effekt i at21. Fordi isoform 1 er den mest tallrike isoformen og endrer kjemoterapimotstand og DNA-skaderespons, vurderer vi om det kan endre minigene E1A alternativ skjøting i en stresstilstand.
Minigene analyser er en enkel, rimelig og rask metode, siden den bare trenger RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese, forsterkning og agarosegelanalyser, og kan være et nyttig verktøy for å evaluere siden en mulig effekt på alternativ skjøting av et protein av interesser til effekten av forskjellige behandlinger på cellulært alternativt skjøtemønster.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

mRNA-behandling innebærer flere samtidige trinn for å forberede mRNA for oversettelse, for eksempel 5'capping, poly-A addisjon og skjøting. Foruten konstituerende skjøting, tillater alternativ mRNA-skjøting uttrykket av multifunksjonelle proteiner fra ett gen. Siden interaktivitetsstudier generelt er den første analysen for nye eller ukjente proteiner, er foreningen av agnproteinet med skjøtefaktorer en indikasjon på at det kan delta i mRNA-skjøteprosessen, men å bestemme i hvilken sammenheng eller hvilke gener som er regulert er en empirisk prosess. Et godt utgangspunkt for å evaluere denne funksjonen er å bruke det klassiske minigene verktøyet. Her presenterer vi den adenovirale E1A minigene-bruken for evaluering av de alternative skjøteendringene etter forskjellige cellulære stressstimuli. Vi evaluerte skjøtingen av E1A minigene i HEK293 stabilt overekspresserende Nek4-protein etter ulike stressende behandlinger. Protokollen inkluderer E1A minigene transfeksjon, cellebehandling, RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese, etterfulgt av PCR- og gelanalyse og kvantifisering av de skjøtede variantene av E1A. Bruken av denne enkle og veletablerte metoden kombinert med spesifikke behandlinger er et pålitelig utgangspunkt for å belyse cellulære prosesser eller hvilke gener som kan reguleres av mRNA-skjøting.

En 5' skjøte steder analyse ved hjelp av E1A minigene ble utført for å evaluere endringer i skjøteprofil i celler etter kjemoterapi utstilling. Nek4 - isoform 1s rolle i AS-regulering i HEK293 stabile celler etter at paclitaksel- eller cisplatinbehandling ble evaluert.
Adenoviral E1A-regionen er ansvarlig for produksjon av tre hoved-mRNAer fra en RNA-forløper på grunn av bruk av forskjellige skjøtedonorer. De deler felles...

Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Denne protokollen presenterer et raskt og nyttig verktøy for å evaluere rollen til et protein med ukarakterisert funksjon i alternativ skjøteregulering etter kjemoterapeutisk behandling.

Bruke E1A Minigene Tool til å studere mRNA-skjøteendringer

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

Det overordnede målet med denne protokollen er å gi detaljert veiledning for å bruke minigene E1A2 for evaluering av globale mRNA-skjøteendringer. Dette er et raskt, billig og enkelt verktøy for å vurdere funksjonen til målproteinet i alternativ skjøteregulering uten nødvendigheten av spesielle regimer eller laboratorieforhold. Begynn med å dyrke HEK 293 celler med stabilt uttrykk for genet av interesse.Del cellene ved hjelp av 0,25% trypsin EDTA, deretter plate 300,000 celler per brønn i seks-brønns plater og inkuber dem i 24 timer ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid. Etter 24 timer, kontroller sammenløpet, og transfekt HEK 293 stabile celler bare når 70 til 80% sammenløp. Fjern cellekulturmediet forsiktig med en pipette, legg deretter til to milliliter komplett DMEM-medium uten antibiotika og legg platen tilbake i inkubatoren.Forbered et rør med transfeksjonsbufferen, legg deretter til to mikrogram pMTE1A DNA, virvel og legg til to mikroliter transfeksjonsreagens. Virvel igjen og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Fjern platene fra inkubatoren og legg forsiktig til transfeksjonsblandingen dråpevis.Seks timer etter transfeksjonen, legg tetracyklin til HEK 293 stabile celler for Nek4 uttrykksinduksjon. 24 timer etter transfeksjonen, bekreft cellemorfologi og transfeksjonseffektivitet ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Bruk en pipette til å fjerne cellekulturmediet, og legg deretter til cellekulturmedium med kjemoterapeutikken.Inkuber cellene i ytterligere 24 timer. For å samle RNA, kast cellekulturmediet, og tilsett 0,5 til 1 milliliter RNA ekstraksjonsreagens direkte til brønnen. Hvis brønnene er svært sammenfallende, bruk en milliliter RNA ekstraksjonsreagens for å forbedre RNA-kvaliteten.Homogeniser cellene med en pipette og overfør dem til et 1,5 milliliter sentrifugerør. Fortsett umiddelbart til RNA-utvinningen, eller lagre prøvene på minus 80 grader Celsius. Tine prøvene i en avtrekkshette og inkuber i fem minutter ved romtemperatur.Tilsett 0,1 til 0,2 milliliter kloroform og rør kraftig, og inkuber deretter i tre minutter ved romtemperatur. Sentrifuge i 15 minutter ved 12.000 ganger G og fire grader Celsius, samle deretter den øvre vandige fasen og overfør den til et nytt 1,5 milliliter sentrifugerrør. Samle rundt 60% av det totale volumet, men ikke samle DNA eller organisk fase.Tilsett 0,25 til 0,5 milliliter isopropanol og rør prøven ved inversjon fire ganger. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur, deretter sentrifuger ved 12.000 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten. Vask RNA-pelletsen to ganger med etanol, og sentrifuger ved 7500 ganger G i fem minutter, og kast deretter etanol.Fjern overflødig etanol ved å invertere røret på et papirhåndkle, og la deretter røret stå åpent inne i en avtrekkshette for delvis å tørke pelletsen i fem til ti minutter. Re-suspendere RNA pellet i 15 mikroliter DEPC-behandlet vann. Kvantifisere total RNA og verifisere RNA-kvalitet ved å måle absorbans ved 230, 260 og 280 nanometer.For å bekrefte total RNA-kvalitet, kjør en 1% agarose gel forbehandlet med 1,2% av en 2,5% natriumhypoklorittoppløsning i 30 minutter. Utfør cDNA-syntese ved hjelp av ett til to mikrogram totalt RNA. Kombiner RNA, en mikroliter oligo d-T, en mikroliter DNTP og nukleasefritt vann til 12 mikroliter.Inkuber reaksjonen i Termo-syklisten i fem minutter ved 65 grader Celsius. Fjern prøver fra thermo cycler, og tilsett fire mikroliter omvendt transkripsjonsbuffer, to mikroliter DTT og en mikroliter ribonukleasehemmer. Inkuber ved 37 grader Celsius i to minutter.Tilsett en mikroliter termostabil omvendt transkripsjon, og inkuber ved 37 grader Celsius i 50 minutter. Inaktiver enzymet ved 70 grader Celsius i 15 minutter. Utfør PCR som beskrevet i tekstmanuskriptet, last deretter 20 til 25 mikroliter av PCR-produktet på en 3% agarose gel som inneholder nukleinsyreflekk, og kjør på 100 volt i omtrent en time.Fotografier gelen, unngå bandmetning, og kvantifiser båndene ved hjelp av en bildebehandlingsprogramvare. Båndene på henholdsvis 631, 493 og 156 basispar tilsvarer isoformene 13S, 12S og 9S. Åpne bildefilen fra Fil-menyen i programvaren, og konverter den til gråtoner.Juster lysstyrke og kontrast, og fjern deretter ytterstøyen om nødvendig. Tegn et rektangel rundt den første banen med rektangelmarkeringsverktøyet, og det ved hjelp av kommandoen Analyser, Geler og Velg første bane, eller ved hjelp av hurtigtasten. Bruk musen til å klikke og holde midt i rektanglet på første kjørefelt, og dra den over til neste kjørefelt.Gå til Analyser, Gels og Velg Next Lane. Gjenta dette trinnet for alle gjenværende baner. Når alle banene er uthevet og nummerert, går du til Analyser, Gels og Plot Lanes for å tegne en profilplott for hvert kjørefelt.Bruk markeringsverktøyet for rette linjer til å tegne en linje over bunnen av hver topp, som tilsvarer hvert felt, og utelater bakgrunnsstøyen. Etter at alle toppene fra hvert kjørefelt er stengt, velger du tryllestavverktøyet og klikker inne i hver topp. Målinger skal dukke opp i resultatvinduet for hver uthevede topp.Vurder bare 13S-, 12S- og 9S-toppene som tilsvarer 631-, 493- og 156 basisparbånd. Kopier intensitetsdata for et regnearkredigeringsprogram, og summer intensiteten fra alle tre feltene for hvert utvalg, og beregn deretter prosentandelen for hver isoform i forhold til totalen. Tegn inn prosentandelene av hver isoform, eller forskjellene i prosentandelen i forhold til de ubehandlede prøvene.En plasmid som inneholder minigene fra E1A ble brukt til å observere effekten på alternativ skjøting ved å evaluere andelen mRNA fra hver isoform som produseres. Basal uttrykk for E1A isoforms varianter var avhengig av cellelinjen og klokkeslettet for E1A-uttrykket. Hek 293 stabil cellelinje, eller HEK 293 rekombininase som inneholder stedet, viste et høyere uttrykk for 13S i forhold til HeLa-celler, men viste lignende nivåer av 13S og 12S isoformer etter 48 timer med E1A-uttrykk.Celler eksponert for cisplatin viste et skifte i fem prime S-S skjøtevalg som favoriserte 12S-uttrykk. Denne effekten ble observert i HEK 293 som stabilt uttrykte flagg tom vektor, samt isoform en av Nek4. Endringer i alternativ skjøting etter paclitaxel-behandling var svært diskrete, men retningene for endringene var motsatte i Flag og Nek4 som uttrykte celler.Når du utfører denne protokollen, er det viktig å bruke utransfected og ikke-omvendt transcriptase kontroller for å unngå feiltolkning med endogene E1A uttrykk, hovedsakelig ved bruk av HEK 293 celler. Etter å ha oppnådd positive resultater, kan alternativ skjøting av spesifikke gener relatert til kjemoterapeutisk respons evalueres. Når en viss effekt observeres, kan denne enkle protokollen lede disse studiene for mer konsistente veier, hvor proteinet spiller en rolle som regulerer alternativ skjøting i kjemoterapirespons, for eksempel.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser å studere macrophage og Microglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Betinget Knockdown av genuttrykk i kreftcelle linjer å studere rekruttering av monocytter/makrofager til Tumor Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Bruke Dot analysen å analysere migrering av cellen ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Tørket blod og Serum flekker som et nyttig verktøy for eksempel Storage evaluere kreft Biomarkers

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

18F-FDG PET/CT Imaging og kvantitative Histology måle dynamiske endringer i glukose metabolisme i musen modeller av lungekreft

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En Syngeneic bukspyttkjertelkreft musemodell å studere virkningene av Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analysen for å studere tumor-macrophage interaksjon

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Bruke kylling chorioallantoic membran i Vivo modell for å studere gynekologiske og urologiske kreftformer

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Portal vene injeksjon av kolorektal kreft organoider for å studere levermetastase Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...