Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Agradecemos a la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, a través de grant temático 2017/03489-1 a JK y beca a FLB 2018/05350-3) y al Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) por financiar esta investigación. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Adrian Krainer por proporcionar el plásmido pMTE1A y a Zerler y sus colegas por su trabajo en la clonación E1A. También agradecemos a la Prof. Dra. Patrícia Moriel, a la Prof. Dra. Wanda Pereira Almeida, al Prof. Dr. Marcelo Lancellotti y a la Prof. Dra. Karina Kogo Cogo Müller por permitirnos utilizar su espacio y equipo de laboratorio.

1. Células de chapado
NOTA: En este protocolo descrito, hek293 líneas celulares estables, previamente generado para la expresión inducible estable de Nek4 se utilizaron21,sin embargo, el mismo protocolo es adecuado para muchas otras líneas celulares, tales como HEK29322,HeLa23,24,25,26,U-2 OS27,</sup...

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	<li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+Regulatory+Networks:+Functions,+Mechanisms,+and+Evolution.">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing.">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li><li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing:+a+new+dimension+of+the+human+genome.">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Misteli, T., C&#225;ceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo.">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li><li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins.">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li><li>Anufrieva, K. 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W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer.">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties.">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li><li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs.">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li><li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusj&#228;rvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential.">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li><li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. 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Y., Tarn, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4.">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).</li><li>Jarn&#230;ss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+Factor+Arginine/Serine-rich+17A+(SFRS17A)+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments.">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li><li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+of+human+Ki-1/57+with+pre-mRNA+splicing+events.">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li><li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2.">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).</li><li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+gel:+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality.">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+3'+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF/SF2+and+hnRNP+A1.">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li><li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT/CGRP+precursor+mRNA.">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li></ol>

Los minigenes son herramientas importantes para determinar los efectos en el empalme alternativo global in vivo. El minigén adenoviral E1A se ha utilizado con éxito durante décadas para evaluar el papel de las proteínas aumentando la cantidad de estas en la célula13,14. Aquí, proponemos el uso del minigén E1A para evaluar el empalme alternativo después de la exposición quimioterapéutica. Una línea celular estable que expresaba el isoform 1 Nek4 fue uti...

El empalme es uno de los pasos más importantes en el proceso eucariota del mRNA que ocurre simultáneamente al 5' mRNA que tapa y al 3' poliadenylation del mRNA, comprendiendo del retiro del intrón seguido por la ensambladura del exón. El reconocimiento de los sitios que empalaban (SS) por el spliceosome, un complejo del ribonucleoprotein que contiene las pequeñas ribonucleoproteínas (snRNP U1, U2, U4 y U6), los pequeños RNAs (snRNAs) y varias proteínas reguladoras1 es necesario para empalmar.
Además de la extirpación de intrones (empalme constitutivo), en los eucariotas se pueden retener los intrones y se pueden excluir los exones, configurando el proceso llamado empalme alternativo de ARNm (EA). El empalme alternativo pre-ARNm amplía la capacidad de codificación de los genomas eucariotas permitiendo la producción de un número grande y diverso de proteínas a partir de un número relativamente pequeño de genes. Se estima que el 95-100% de los ARNm humanos que contienen más de un exón pueden someterse a empalme alternativo2,3. Esto es fundamental para procesos biológicos como el desarrollo neuronal, la activación de la apoptosis y la respuesta al estrés celular4,proporcionando al organismo alternativas para regular el funcionamiento celular utilizando el mismo repertorio de genes.
La maquinaria necesaria para el empalme alternativo es la misma utilizada para el empalme constitutivo y el uso de las SS es el principal determinante para la ocurrencia de empalme alternativo. El empalme constitutivo está relacionado con el uso de sitios de empalme fuerte, que suelen ser más similares a los motivos de consenso para el reconocimiento de spliceosomas5.
Los exones alternativos se reconocen típicamente menos eficientemente que los exones constitutivos una vez que sus elementos reguladores cis-,las secuencias en 5' SS y 3' SS flanqueando estos exones, demuestre una capacidad obligatoria inferior al emposoma. El ARNm también contiene regiones denominadas potenciadores o silenciadores ubicados en exones (potenciadores de empalme exónico (ESEs) y silenciadores de empalme exónicos (ESSs)) e intrones (potenciadores de empalme intrónico (ISEs) y silenciadores de empalme intrónico (ISSs)) que mejoran o reprimen el uso de exones, respectivamente5. Estas secuencias son reconocidas por elementos trans-reguladores, o factores de empalme (SF). Las SFs están representadas principalmente por dos familias de proteínas, los factores de empalme ricos en serina/arginina (SRSFs) que se unen a las EES y la familia de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNPs) que se unen a las secuencias deLASE 5.
El empalme alternativo puede ser modulado por fosforilación/desfosforilación de factores trans que modifican las interacciones de los socios y localización celular de los factores de empalme6,7,8. La identificación de nuevos reguladores de los factores de empalme puede proporcionar nuevas herramientas para regular el empalme y, en consecuencia, algunos tratamientos contra el cáncer.
Anufrieva et al.9,en un perfil de expresión génica de microarrays de ARNm, observaron cambios consistentes en los niveles de componentes spliceosomales en 101 líneas celulares y después de diferentes condiciones de estrés (fármacos a base de platino, irradiación gamma, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de la tirosina cinasa y taxanos). La relación entre el patrón de empalme y la eficacia de la quimioterapia ya se ha demostrado en células cancerosas de pulmón, que son resistentes a la quimioterapia, mostrando cambios en la tasa de variantes de la caspasa-910. Las células HEK293 tratadas con panel quimioterapéutico muestran cambios en el empalme con un aumento en las variantes pro-apoptóticas. Gabriel et al.11 observaron cambios en al menos 700 eventos de empalme después del tratamiento con cisplatino en diferentes líneas celulares, señalando que las vías de empalme están afectadas por el cisplatino. Los moduladores del empalme ya han demostrado actividad antitumoral, mostrando que el empalme es importante para el desarrollo tumoral y, principalmente, para la respuesta quimioterápica12. Por lo tanto, caracterizar nuevas proteínas que regulan el empalme después de agentes estresores celulares, como la quimioterapia, es muy importante para descubrir nuevas estrategias de tratamiento.
Las pistas de la regulación alternativa del empalme de estudios del interactome, particularmente importantes para caracterizar funciones de proteínas nuevas o no caracterizados, pueden exigir un acercamiento más general y simple para verificar el papel real de la proteína en COMO. Los minigenes son herramientas importantes para el análisis del papel general de una proteína que afecta a la regulación del empalme. Contienen segmentos de un gen de interés que contiene regiones genómicas alternativamente empalmadas y flanqueantes13. El uso de una herramienta minigénica permite el análisis del empalme in vivo con varias ventajas como la longitud del minigén que es menor y por lo tanto no es una limitación a la reacción de amplificación; el mismo minigén se puede evaluar en diferentes líneas celulares; todos los componentes celulares, principalmente su modificación postraduccional reguladora (fosforilación y cambios en los compartimentos celulares) están presentes y pueden ser abordados13,14. Por otra parte, se pueden observar cambios en el patrón de empalme alternativo después del estrés celular y, el uso de un sistema de minigenes, permiten identificar la vía modulada por diferentes estímulos.
Hay varios sistemas de minigenes ya descritos que son específicos para diferentes tipos de eventos de empalme13,14, sin embargo, como un ensayo preliminar, el minigén E1A15 es un sistema de reportero de empalme alternativo muy bien establecido para el estudio de la selección de 5 SS in vivo. A partir de un solo gen, E1A, cinco ARNm se producen por empalme alternativo basado en la selección de tres diferentes sitios de empalme de 5 ′ y de uno mayor o un menor 3 ′ sitio de empalme16,17,18. La expresión de las variantes de E1A cambia según el período de infección adenoviral19,20.
Hemos demostrado previamente que ambas isoformas Nek4 interactúan con factores de empalme como SRSF1 y hnRNPA1 y mientras que la isoforma 2 cambia el splicing alternativo del minigén E1A, la isoforma 1 no tiene ningún efecto en esa21. Porque el isoform 1 es el isoform más abundante y cambia resistencia de la quimioterapia y respuesta del daño de la DNA, evaluamos si podría cambiar el empalme alternativo del minigene E1A en una condición de la tensión.
El ensayo de minigene es un método sencillo, de bajo coste y rápido, ya que solo necesita extracción de ARN, síntesis de ADNc, amplificación y análisis de gel de agarosa, y puede ser una herramienta útil para evaluar desde un posible efecto sobre el empalme alternativo por una proteína de intereses hasta el efecto de diferentes tratamientos sobre el patrón de empalme alternativo celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

El procesamiento del ARNm implica múltiples pasos simultáneos para preparar el ARNm para la traducción, como el 5'capping, la adición de poli-A y el empalme. Además del empalme constitutivo, el empalme alternativo del ARNm permite la expresión de proteínas multifuncionales a partir de un gen. Como los estudios de interactomas son generalmente el primer análisis de proteínas nuevas o desconocidas, la asociación de la proteína de cebo con factores de empalme es una indicación de que puede participar en el proceso de empalme de ARNm, pero determinar en qué contexto o qué genes están regulados es un proceso empírico. Un buen punto de partida para evaluar esta función es el uso de la herramienta clásica de minigene. Aquí presentamos el uso del minigene adenoviral E1A para evaluar los cambios que empalme alternativos después de diversos estímulos celulares de la tensión. Se evaluó el empalme del minigén E1A en HEK293 establemente sobreexpresando la proteína Nek4 después de diferentes tratamientos de estrés. El protocolo incluye transfección de minigenes E1A, tratamiento celular, extracción de ARN y síntesis de ADNc, seguido de pcr y análisis de gel y cuantificación de las variantes empalmeadas E1A. El uso de este método simple y bien establecido combinado con tratamientos específicos es un punto de partida confiable para arrojar luz sobre los procesos celulares o qué genes pueden ser regulados por el empalme de ARNm.

Un 5' el análisis de los sitios del empalme usando el minigene de E1A fue realizado para evaluar cambios en perfil que empalmaba en células después de la exposición de la quimioterapia. Se evaluó el papel de Nek4-isoforma 1 en la regulación de AS en células estables HEK293 después del tratamiento con paclitaxel o cisplatino.
La región adenoviral de E1A es responsable de la producción de tres mRNAs principales a partir ...

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Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Este protocolo presenta una herramienta rápida y útil para evaluar el papel de una proteína con la función uncharacterized en la regulación que empalma alternativa después del tratamiento quimioterapéutico.

Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una guía detallada para utilizar el minigén E1A2 para evaluar los cambios globales de empalme de ARNm. Esta es una herramienta rápida, económica y simple para evaluar la función de la proteína diana en la regulación alternativa del empalme sin la necesidad de regímenes especiales o condiciones de laboratorio. Comience por el cultivo de células HEK 293 con expresión estable del gen de interés.Divida las células usando EDTA de tripsina al 0,25%, luego platee 300, 000 células por pocillo en placas de seis pocillos e incube durante 24 horas a 37 grados Centígrados en dióxido de carbono al 5%. Después de 24 horas, compruebe la confluencia y transfecte las células estables HEK 293 solo cuando sea 70 a 80% confluyente. Retire cuidadosamente el medio de cultivo celular con una pipeta, luego agregue dos mililitros de medio DMEM completo sin antibióticos y vuelva a colocar la placa en la incubadora.Prepare un tubo con el tampón de transfección, luego agregue dos microgramos de ADN pMTE1A, vórtice y agregue dos microlitros de reactivo de transfección. Vórtice de nuevo e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire las placas de la incubadora y agregue cuidadosamente la mezcla de transfección en cuanto a gotas.Seis horas después de la transfección, agregue tetraciclina a las células estables HEK 293 para la inducción de la expresión de Nek4. 24 horas después de la transfección, verifique la morfología celular y la eficiencia de la transfección utilizando un microscopio fluorescente. Use una pipeta para extraer el medio de cultivo celular y, a continuación, agregue el medio de cultivo celular con los quimioterapéuticos.Incubar las células durante otras 24 horas. Para recolectar ARN, deseche el medio de cultivo celular y agregue de 0.5 a 1 mililitro de reactivo de extracción de ARN directamente al pozo. Si los pozos son muy confluentes, utilice un mililitro de reactivo de extracción de ARN para mejorar la calidad del ARN.Homogeneizar las células con una pipeta y transferirlas a un tubo centrífuga de 1,5 mililitros. Proceda inmediatamente a la extracción del ARN, o almacene las muestras en menos 80 grados centígrados. Descongelar las muestras en una campana extractora de humos e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Añadir de 0,1 a 0,2 mililitros de cloroformo y agitar vigorosamente, luego incubar durante tres minutos a temperatura ambiente. Centrífuga durante 15 minutos a 12, 000 veces G y cuatro grados Celsius, luego recoja la fase acuosa superior y transfilíquela a un nuevo tubo centrífuga de 1.5 mililitros. Recoger alrededor del 60% del volumen total, pero no recoger el ADN o la fase orgánica.Añadir de 0,25 a 0,5 mililitros de isopropanol y agitar la muestra por inversión cuatro veces. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego centrifugar a 12,000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados y desechar el sobrenadante. Lave el pellet de ARN dos veces con etanol y centrífuga a 7, 500 veces G durante cinco minutos, luego deseche el etanol.Retire el exceso de etanol invirtiendo el tubo en una toalla de papel, luego deje el tubo abierto dentro de una campana extractora de humos para secar parcialmente el pellet durante cinco a 10 minutos. Vuelva a suspender el pellet de ARN en 15 microlitros de agua tratada con DEPC. Cuantifique el ARN total y verifique la calidad del ARN midiendo la absorbancia a 230, 260 y 280 nanómetros.Para verificar la calidad total del ARN, ejecute un gel de agarosa al 1% pretratado con un 1,2% de una solución de hipoclorito de sodio al 2,5% durante 30 minutos. Realice la síntesis del cDNA usando uno a dos microgramos de ARN total. Combine el ARN, un microlitro de oligo d-T, un microlitro de DNTP y agua libre de nucleasa a 12 microlitros.Incubar la reacción en el Thermo Cycler durante cinco minutos a 65 grados Centígrados. Retire las muestras del Thermo Cycler y agregue cuatro microlitros de tampón de la transcriptasa inversa, dos microlitros de TDT y un microlitro del inhibidor de la ribonucleasa. Incubar a 37 grados centígrados durante dos minutos.Agregue un microlitro de transcriptasa inversa termoestable e incube a 37 grados Centígrados durante 50 minutos. Inactivar la enzima a 70 grados Centígrados durante 15 minutos. Realice la POLIMERIZACIÓN EN CADENA como se describe en el manuscrito del texto, después cargue 20 a 25 microlitros del producto de la polimerización en cadena en un gel de la agarosa del 3% que contiene la mancha del ácido nucleico, y funcione en 100 voltios por aproximadamente una hora.Fotografíe el gel, evitando cualquier saturación de bandas, y cuantifique las bandas utilizando un software de procesamiento de imágenes. Las bandas en 631, 493, y 156 pares de bases corresponden a las isoformas 13S, 12S y 9S respectivamente. En el menú Archivo del software, abra el archivo de imagen y conviértalo en escala de grises.Ajuste brillo y contraste y, a continuación, elimine el ruido de valores atípicos si es necesario. Dibuje un rectángulo alrededor del primer carril con la herramienta de selección de rectángulo y selecciónelo a través del comando Analizar, Geles y Seleccionar primer carril, o mediante el método abreviado de teclado. Utilice el ratón para hacer clic y mantener en el centro del rectángulo en el primer carril, y arrástrelo al siguiente carril.Vaya a Analizar, Geles y Seleccionar el carril siguiente. Repita este paso para todos los carriles restantes. Después de que todos los carriles estén resaltados y numerados, vaya a Analizar, Geles y Trazar carriles para dibujar un diagrama de perfil de cada carril.Utilice la herramienta de selección de línea recta para dibujar una línea a través de la base de cada pico, correspondiente a cada banda, dejando fuera el ruido de fondo. Después de que todos los picos de cada carril se hayan cerrado, seleccione la herramienta varita y haga clic dentro de cada pico. Las mediciones deben aparecer en la ventana de resultados para cada pico resaltado.Considere solamente los picos 13S, 12S, y 9S correspondientes a las bandas de los pares de bases 631, 493, y 156. Copie los datos de intensidad de un editor de hojas de cálculo y sume la intensidad de las tres bandas para cada muestra y, a continuación, calcule el porcentaje de cada isoforma en relación con el total. Trazar los porcentajes de cada isoforma, o las diferencias en el porcentaje en relación con las muestras no tratadas.Un plásmido que contenía el minigene de E1A fue utilizado para observar el efecto sobre empalmar alternativo evaluando la proporción de mRNA de cada isoforma producida. La expresión básica de las variantes de las isoformas de E1A dependió de la línea celular y del tiempo de la expresión de E1A. La línea celular estable HEK 293, o el sitio que contenía la recombinasa HEK 293, mostró una expresión más alta de 13S en comparación con las células de HeLa, pero mostró niveles similares de isoformas 13S y 12S después de 48 horas de expresión de E1A.Las células expuestas al cisplatin mostraron un cambio en la selección que empalmaba de cinco primeros S-S que favorecía la expresión 12S. Este efecto se observó en HEK 293 expresando de forma estable el vector vacío flag, así como la isoforma uno de Nek4. Los cambios en el empalme alternativo después del tratamiento con paclitaxel fueron muy discretos, pero las direcciones de los cambios fueron opuestas en las células de expresión de Flag y Nek4.Al realizar este protocolo, es importante utilizar controles de transcriptasa no transfectados y no inversos para evitar la mala interpretación con la expresión endógena de E1A, principalmente cuando se usan células HEK 293. Tras la obtención de resultados positivos, se puede evaluar el empalme alternativo de genes específicos relacionados con la respuesta quimioterapéutica. Cuando se observa algún efecto, este protocolo simple puede dirigir estos estudios para vías más consistentes, donde la proteína desempeña un papel regulador del empalme alternativo en la respuesta a la quimioterapia, por ejemplo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizando 18F-FDG PET/CT la proyección de imagen e histología cuantitativa para medir cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa en modelos de ratón de cáncer de pulmón

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Un modelo de ratón de cáncer de páncreas Syngeneic para estudiar los efectos de la electroporación Irreversible

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Ensayo In Vitro para estudiar la interacción tumor-macrofago

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Uso de la membrana chorioalantoica de pollo en vivo modelo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Inyección en la vena porta de organoides de cáncer colorrectal para estudiar la metástasis hepática del estroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...