Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Vi tackar Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, genom Grant Temático 2017/03489-1 till JK och stipendie till FLB 2018/05350-3) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) för finansiering av denna forskning. Vi vill tacka Dr Adrian Krainer för att ha tillhandahållit pMTE1A-plasmiden och Zerler och kollegor för deras arbete inom E1A-kloning. Vi tackar också prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti och Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller så att vi kan använda deras laboratorieutrymme och utrustning.

1. Plätera celler
OBS: I detta beskrivna protokoll användes HEK293 stabila cellinjer, som tidigare genererats för stabilt inducerbart uttryck av Nek4,21, men samma protokoll är lämpligt för många andra cellinjer, såsom HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-...

<ol>
	<li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+Regulatory+Networks:+Functions,+Mechanisms,+and+Evolution.">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing.">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li><li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing:+a+new+dimension+of+the+human+genome.">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Misteli, T., C&#225;ceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo.">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li><li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins.">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li><li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells.">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).</li><li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells.">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li><li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis.">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li><li>Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer.">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li><li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells.">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li><li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts:+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3'+splice+site.">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li><li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins.">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li><li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties.">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li><li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs.">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li><li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusj&#228;rvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential.">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li><li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms:+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing.">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus.">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li><li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival.">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li><li>Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4.">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).</li><li>Jarn&#230;ss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+Factor+Arginine/Serine-rich+17A+(SFRS17A)+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments.">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li><li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+of+human+Ki-1/57+with+pre-mRNA+splicing+events.">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li><li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2.">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).</li><li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+gel:+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality.">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+3'+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF/SF2+and+hnRNP+A1.">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li><li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT/CGRP+precursor+mRNA.">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li></ol>

Minigener är viktiga verktyg för att bestämma effekterna i globala alternativa skarvningar in vivo. Adenoviral minigene E1A har använts framgångsrikt i årtionden för att utvärdera proteinernas roll genom att öka mängden av dessa icellen 13,14. Här föreslår vi minigene E1A användning för utvärdering av alternativ splitsning efter kemoterapeutisk exponering. En stabil cellinje som uttrycker Nek4 isoform 1 användes, undvika artefakter av överuttryc...

Splitsning är bland de viktigaste stegen i eukaryota mRNA-bearbetning som sker samtidigt till 5'mRNA-kapning och 3'mRNA polyadenylation, bestående av intronborttagning följt av exon junction. Erkännandet av skarvplatserna (SS) av skapliceosomen, ett ribonukleoproteinkomplex som innehåller små ribonukleoproteiner (snRNP U1, U2, U4 och U6), små RNAs (snRNAs) och flera regulatoriskaproteiner 1 är nödvändigt för skarvning.
Förutom intronborttagning (konstituerande skarvning), i eukaryoter, kan introner behållas och exoner kan uteslutas, vilket konfigurerar processen som kallas mRNA-alternativ splitsning (AS). Den alternativa för-mRNA splitsning utökar kodningskapaciteten för eukaryotic genom som möjliggör produktion av ett stort och varierat antal proteiner från ett relativt litet antal gener. Det uppskattas att 95-100% av mänskliga mRNAs som innehåller mer än en exon kan genomgå alternativskarvning 2,3. Detta är grundläggande för biologiska processer som neuronal utveckling, apoptosaktivering och cellulärstressrespons 4, vilket ger organismalternativen för att reglera cellens funktion med samma repertoar av gener.
De maskiner som är nödvändiga för alternativ skarvning är desamma som används för konstituerande skarvning och användningen av SS är den viktigaste avgörande faktorn för alternativ skarvförekomst. Konstituerande skarvning är relaterad till användningen av starka skarvningsplatser, som vanligtvis är mer lika konsensusmotiv för skapliceosomigenkänning5.
Alternativa exoner känns vanligtvis igen mindre effektivt än konstituerande exons en gång dess cis-reglerande element, sekvenserna i 5'SS och 3'SS flankering dessa exons, visar en sämre bindande kapacitet till skarveosome. mRNA innehåller också regioner som kallas förstärkare eller ljuddämpare i exoner (exonic skarv förstärkare (EES) och exonic skarv ljuddämpare (ESSs)) och introner (intronic skarv förstärkare (ISE) och intronic splitsande ljuddämpare (ISSs)) som förbättrar eller undertrycker exon användning,respektive 5. Dessa sekvenser känns igen av transreglerande element eller splitsfaktorer (SF). SFs representeras huvudsakligen av två familjer av proteiner, serin/arginin rika splitsfaktorer (SRSFs) som binder till EES och familjen heterogena nukleära ribonukleoproteiner (hnRNPs) som binder till ESSssekvenser 5.
Alternativ splitsning kan moduleras genom fosforylering/ defosforylering av transfaktorer som ändrar interaktionspartners och cellulär lokalisering av skarvfaktorer6,7,8. Att identifiera nya tillsynsmyndigheter för skarvningsfaktorer kan ge nya verktyg för att reglera skarvning och följaktligen vissa cancerbehandlingar.
Anufrieva et al.9, i en mRNA microarray genuttryck profil, observerade konsekventa förändringar i nivåerna av skarveosomal komponenter i 101 cellinjer och efter olika stress villkor (platina-baserade läkemedel, gamma bestrålning, topoisomerashämmare, tyrosin kinashämmare och taxaner). Förhållandet mellan splitsmönster och kemoterapi effekt har redan visats i lungcancer celler, som är kemoterapi resistenta, visar förändringar i caspase-9 varianter hastighet10. HEK293 celler behandlade med kemoterapeutiska panelen visar förändringar i splitsning med en ökning av pro-apoptotiska varianter. Gabriel et al.11 observerade förändringar i minst 700 händelser av skarvning efter cisplatin behandling i olika cellinjer, påpekar att skarvvägar är cisplatin-drabbade. Splitsande modulatorer har redan visat anti-tumoral aktivitet, visar att splitsning är viktigt för tumoral utveckling och, främst, kemoterapi svar12. Därför är det mycket viktigt att karakterisera nya proteiner som reglerar splitsning efter cellulära stressfaktorer, som kemoterapeuter, för att upptäcka nya behandlingsstrategier.
Ledtrådarna till alternativ splitsreglering från interactome-studier, särskilt viktiga för att karakterisera funktioner hos nya eller okarakteriserade proteiner, kan kräva ett mer allmänt och enkelt tillvägagångssätt för att verifiera proteinets verkliga roll i AS. Minigener är viktiga verktyg för analys av den allmänna rollen av ett protein som påverkar splitsreglering. De innehåller segment från en gen av intresse som innehåller alternativt skarvade och flankerande genomiska regioner13. Med hjälp av ett minigeneverktyg kan analysen av skarv in vivo med flera fördelar såsom längden på minigenen som är liten och därför inte är en begränsning av förstärkningsreaktionen; Samma minigen kan utvärderas i olika cellinjer. Alla cellulära komponenter, huvudsakligen deras reglerande post-translationella modifiering (fosforylering och förändringar i cellutrymmen) finns och kan behandlas13,14. Dessutom kan förändringar i alternativa splitsmönster observeras efter cellulär stress och, användning av ett minigene-system, gör det möjligt att identifiera den väg som moduleras av olika stimuli.
Det finns flera minigene-system som redan beskrivs som är specifika för olika typer av skarvningshändelser13,14, men som en preliminär analys är minigenen E1A15 ett mycket väletablerat alternativt skarvreportersystem för studier av 5:s SS-urval in vivo. Från endast en gen, E1A, produceras fem mRNAs genom alternativ skarvning baserat på val av tre olika 5′ skarvplatser och av en större eller en mindre 3′ skarvplats16,17,18. Uttrycket av E1A-varianter ändras beroende på perioden för Adenoviral infektion19,20.
Vi har tidigare visat att både Nek4-isoformer interagerar med splitsfaktorer som SRSF1 och hnRNPA1 och medan isoform 2 ändrar minigene E1A alternativ skarvning, har isoform 1 ingen effekt i det21. Eftersom isoform 1 är den vanligaste isoformen och förändrar kemoterapiresistens och DNA-skaderespons utvärderar vi om det kan förändra minigen E1A alternativ splitsning i ett stresstillstånd.
Minigene-analys är en enkel, billig och snabb metod, eftersom den bara behöver RNA-extraktion, cDNA-syntes, förstärkning och agarosgelanalyser, och kan vara ett användbart verktyg att utvärdera eftersom en möjlig effekt på alternativ skarvning av ett protein av intressen tills effekten av olika behandlingar på cellulära alternativa splitsmönster.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

mRNA-bearbetning innebär flera samtidiga steg för att förbereda mRNA för översättning, såsom 5'capping, poly-A tillägg och splitsning. Förutom konstituerande splitsning tillåter alternativ mRNA splitsning uttryck av multifunktionella proteiner från en gen. Eftersom interactomestudier i allmänhet är den första analysen för nya eller okända proteiner, är associeringen av beteproteinet med splitsfaktorer en indikation på att det kan delta i mRNA-skarvningsprocess, men att avgöra i vilket sammanhang eller vilka gener som regleras är en empirisk process. En bra utgångspunkt för att utvärdera denna funktion är att använda det klassiska minigeneverktyget. Här presenterar vi adenoviral E1A minigene användning för utvärdering av alternativa splitsning förändringar efter olika cellulära stress stimuli. Vi utvärderade skarvningen av E1A minigene i HEK293 stabilt överuttryckande Nek4 protein efter olika stressande behandlingar. Protokollet omfattar E1A minigene transfection, cell behandling, RNA extraktion och cDNA syntes, följt av PCR och gel analys och kvantifiering av E1A skarvade varianter. Användningen av denna enkla och väletablerade metod i kombination med specifika behandlingar är en tillförlitlig utgångspunkt för att belysa cellulära processer eller vilka gener som kan regleras genom mRNA-splitsning.

En 5' skarv platser analys med hjälp av E1A minigene utfördes för att utvärdera förändringar i splitsning profil i celler efter kemoterapi utställning. Nek4 - isoform 1 i AS reglering i HEK293 stabila celler efter paklitaxel eller cisplatin behandling utvärderades.
Adenoviral E1A-regionen ansvarar för produktionen av tre huvudsakliga mRNAs från en RNA föregångare på grund av användningen av olika skarv givare. De d...

Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Detta protokoll presenterar ett snabbt och användbart verktyg för att utvärdera rollen av ett protein med okarakteriserad funktion i alternativ splitsreglering efter kemoterapeutisk behandling.

Använda E1A Minigene Tool för att studera mRNA-splitsningsändringar

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

Det övergripande målet med detta protokoll är att ge detaljerad vägledning för att använda minigen E1A2 för utvärdering av globala mRNA-splitsningsändringar. Detta är ett snabbt, billigt och enkelt verktyg för att bedöma målproteinens funktion i alternativ splitsreglering utan att speciella regimer eller laboratorieförhållanden är nödvändiga. Börja med att odla HEK 293 celler med stabilt uttryck för genen av intresse.Dela cellerna med 0,25% trypsin EDTA, sedan plätera 300, 000 celler per brunn i sexbrunnsplattor och inkubera dem i 24 timmar vid 37 grader Celsius i 5% koldioxid. Efter 24 timmar, kontrollera sammanflödet och transfektera HEK 293 stabila celler endast när 70 till 80% sammanflöde. Ta försiktigt bort cellkulturmediet med en pipett, tillsätt sedan två milliliter komplett DMEM-medium utan antibiotika och lägg tillbaka plattan i inkubatorn.Förbered ett rör med transfectionbufferten, tillsätt sedan två mikrogram pMTE1A DNA, virvel och tillsätt två mikroliter transfection reagens. Virvel igen och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Ta bort plattorna från inkubatorn och tillsätt försiktigt transfectionblandningen droppvis.Sex timmar efter transfekten, tillsätt tetracyklin till HEK 293 stabila celler för Nek4 uttryck induktion. 24 timmar efter transfektionen, kontrollera cellmorfologi och transfection effektivitet med hjälp av ett fluorescerande mikroskop. Använd en pipett för att ta bort cellodlingsmediet och lägg sedan till cellodlingsmediet med kemoterapeuterna.Inkubera cellerna i ytterligare 24 timmar. För att samla RNA, kassera cellkulturmediet och tillsätt 0,5 till 1 milliliter RNA-extraktionsreagens direkt till brunnen. Om brunnar är mycket konfluenta, använd en milliliter RNA-extraktionsreagens för att förbättra RNA-kvaliteten.Homogenisera cellerna med en pipett och överför dem till ett 1,5 milliliter centrifugeringsrör. Fortsätt omedelbart till RNA-extraktionen eller lagra proverna vid minus 80 grader Celsius. Tina proverna i en rökhuv och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur.Tillsätt 0,1 till 0,2 milliliter kloroform och omrör kraftigt och inkubera sedan i tre minuter vid rumstemperatur. Centrifug i 15 minuter vid 12 000 gånger G och fyra grader Celsius, samla sedan den övre vattenfasen och överför den till ett nytt 1,5 milliliter centrifugerör. Samla in cirka 60% av den totala volymen, men samla inte in DNA eller den organiska fasen.Tillsätt 0,25 till 0,5 milliliter isopropanol och omrör provet genom inversion fyra gånger. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur, centrifugera sedan vid 12 000 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och kassera supernaten. Tvätta RNA-pelleten två gånger med etanol och centrifugera vid 7 500 gånger G i fem minuter och kassera sedan etanolen.Ta bort överflödig etanol genom att vända röret på en pappershandduk och lämna sedan röret öppet inuti en rökhuv för att delvis torka pelleten i fem till tio minuter. Suspendera RNA-pelleten i 15 mikroliter DEPC-behandlat vatten. Kvantifiera totalt RNA och verifiera RNA-kvaliteten genom att mäta absorbans vid 230, 260 och 280 nanometer.För att verifiera den totala RNA-kvaliteten, kör en 1%agarose gel förbehandlad med 1,2% av en 2,5% natriumhypokloritlösning i 30 minuter. Utför cDNA-syntes med ett till två mikrogram totalt RNA. Kombinera RNA, en mikroliter oligo d-T, en mikroliter DNTP och nukleasfritt vatten till 12 mikroliter.Inkubera reaktionen i termocyklatorn i fem minuter vid 65 grader Celsius. Ta bort prover från termocyklatorn och tillsätt fyra mikroliter omvänd transkriptasbuffert, två mikroliter DTT och en mikroliter ribonukleashämmare. Inkubera vid 37 grader Celsius i två minuter.Tillsätt en mikroliter termostabil omvänd transkriptas och inkubera vid 37 grader Celsius i 50 minuter. Inaktivera enzymet vid 70 grader Celsius i 15 minuter. Utför PCR enligt beskrivningen i textmanuskriptet, ladda sedan 20 till 25 mikroliter PCR-produkten på en 3%agarose gel som innehåller nukleinsyrafläck och kör på 100 volt i ungefär en timme.Fotografera gelén, undvik bandmättnad och kvantifiera banden med hjälp av en bildbehandlingsprogramvara. Banden på 631, 493 och 156 baspar motsvarar isoformerna 13S, 12S respektive 9S. Öppna bildfilen på menyn Arkiv och konvertera den till gråskala.Justera ljusstyrka och kontrast och ta sedan bort avvikande brus om det behövs. Rita en rektangel runt det första körfältet med rektangelns markeringsverktyg och markera den med kommandot Analysera, Geler och Välj första körfält eller med kortkommandot. Använd musen för att klicka och hålla ned i mitten av rektangeln på det första körfältet och dra den över till nästa körfält.Gå till Analysera, Geler och Välj Nästa körfält. Upprepa det här steget för alla återstående körfält. När alla körfält har markerats och numrerats går du till Analyze, Gels och Plot Lanes för att rita en profil tomt i varje körfält.Använd det raka linjemarkeringsverktyget för att rita en linje över basen av varje topp, motsvarande varje band, och lämna bakgrundsljudet utanför. När alla toppar från varje körfält har stängts av väljer du trollstavsverktyget och klickar inuti varje topp. Mätningar bör dyka upp i resultatfönstret för varje markerad topp.Tänk bara på 13S-, 12S- och 9S-topparna som motsvarar 631-, 493- och 156 basparband. Kopiera intensitetsdata för en kalkylbladsredigerare och summera intensiteten från alla tre banden för varje prov och beräkna sedan procentsatsen för varje isoformulär i förhållande till summan. Rita procentsatserna för varje isoform eller skillnaderna i procent i förhållande till de obehandlade proverna.En plasmid som innehåller minigen från E1A användes för att observera effekten på alternativ splitsning genom att utvärdera andelen mRNA från varje isoform som produceras. Basalt uttryck för E1A isoforms varianter beror på cellinjen och tiden för E1A uttryck. HEK 293 stabil cellinje, eller HEK 293 rekombinas innehållande webbplats, visade ett högre uttryck av 13S i jämförelse med HeLa celler, men visade liknande nivåer av 13S och 12S isoformer efter 48 timmar av E1A uttryck.Celler som exponeras för cisplatin visade en förskjutning i fem prime S-S splitsning val gynnar 12S uttryck. Denna effekt observerades i HEK 293 stabilt uttrycker flaggan tom vektor, liksom isoform en av Nek4. Förändringar i alternativ skarvning efter paklitaxel behandling var mycket diskret, men anvisningarna för ändringarna var motsatta i Flag och Nek4 uttrycker celler.När du utför det här protokollet är det viktigt att använda otillverkade och icke-omvända transkriptionskontroller för att undvika feltolkning med endogent E1A-uttryck, främst när du använder HEK 293-celler. Efter att ha fått positiva resultat kan den alternativa skarvningen av specifika gener relaterade till det kemoterapeutiska svaret utvärderas. När viss effekt observeras kan detta enkla protokoll styra dessa studier för mer konsekventa vägar, där proteinet spelar en roll som reglerar alternativ skarvning i kemoterapisvar, till exempel.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser för att studera makrofager och mikroglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Villkorliga Nedslagning av genuttryck i Cancer cellinjer att studera rekrytering av monocyter/makrofager att den tumör mikromiljö

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Med Dot-analys att analysera Migration av Cell ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Torkat blod och Serum ställen som ett användbart verktyg att utvärdera Cancer biomarkörer lagring på prov

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utnyttja 18F-FDG PET/CT Imaging och kvantitativa histologi för att mäta dynamiska förändringar i glukosmetabolism i musmodeller av lungcancer

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En syngena pankreascancer musmodell att studera effekterna av irreversibel elektroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analys för att studera interaktion med tumör-makrofage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Använda Kyckling chorioallantoic Membrane In Vivo modell för att studera gynekologiska och urologiska cancerformer

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Portalveninjektion av kolorektal cancerorganoider för att studera levermetastasen Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...