Name: using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo'ya (FAPESP, Grant Temático 2017/03489-1'den JK'ya ve FLB 2018/05350-3)'e burs ve bu araştırmayı finanse etmek için Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) aracılığıyla. PMTE1A plazmid ve Zerler ve meslektaşlarına E1A klonlama çalışmalarından dolayı teşekkür ederiz. Ayrıca Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti ve Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller'e laboratuvar alan ve ekipmanlarını kullanmamızı sağlayan teşekkür ediyoruz.

1. Kaplama hücreleri
NOT: Bu açıklanan protokolde, daha önce Nek4'ün kararlı indüklensiz ekspresyörü için oluşturulan HEK293 kararlı hücre hatları21kullanıldı, ancak aynı protokol HEK293 22 , HeLa23 , 24 ,25,26,U-2 OS27,COS728, SH-SY5Y29gibi diğer birçok h...

<ol>
	<li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+Regulatory+Networks:+Functions,+Mechanisms,+and+Evolution.">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing.">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li><li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing:+a+new+dimension+of+the+human+genome.">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li><li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing:+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation.">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Misteli, T., C&#225;ceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo.">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li><li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins.">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li><li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells.">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).</li><li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells.">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li><li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis.">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li><li>Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer.">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li><li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing.">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li><li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells.">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li><li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts:+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3'+splice+site.">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li><li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins.">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li><li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties.">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li><li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs.">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li><li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusj&#228;rvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential.">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li><li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms:+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing.">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus.">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li><li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors.">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li><li>Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones.">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes &amp; Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li><li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival.">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li><li>Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4.">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).</li><li>Jarn&#230;ss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+Factor+Arginine/Serine-rich+17A+(SFRS17A)+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments.">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li><li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+of+human+Ki-1/57+with+pre-mRNA+splicing+events.">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li><li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2.">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).</li><li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+gel:+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality.">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+3'+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF/SF2+and+hnRNP+A1.">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li><li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT/CGRP+precursor+mRNA.">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li></ol>

Minigenes, küresel alternatif birleştirme in vivo etkilerini belirlemek için önemli araçlardır. Adenoviral minigene E1A,13,14hücredeki bunların miktarını artırarak proteinlerin rolünü değerlendirmek için on yıllardır başarıyla kullanılmaktadır. Burada, kemoterapötik maruziyet sonrası alternatif birleştirmeyi değerlendirmek için minigene E1A kullanımını öneriyoruz. Nek4 isoform 1'i ifade eden kararlı bir hücre hattı kullanıldı ve...

Birleştirme, 5'mRNA kapaklama ve 3'mRNA poliadenilasyonuna aynı anda meydana gelen ökaryotik mRNA işlemede en önemli adımlar arasındadır, intron kaldırma ve ardından exon kavşağı. Birleştirme alanlarının (SS) spliceosome tarafından tanınması, küçük ribonükleoproteinler (snRNP U1, U2, U4 ve U6), küçük RNA'lar (snRNA'lar) ve birkaç düzenleyici protein1 içeren bir ribonükleoprotein kompleksi, birleştirme için gereklidir.
Ökaryotlarda intron kaldırmanın (konsitutive birleştirme) yanı sıra, intronlar tutulabilir ve eksonlar dışlanabilir, mRNA alternatif birleştirme (AS) adı verilen işlemi yapılandırabilir. Alternatif pre-mRNA birleştirme, ökaryotik genomların kodlama kapasitesini genişleterek nispeten az sayıda genden çok sayıda protein üretilmesini sağlar. Birden fazla ekson içeren insan mRNA'larının% 95-100'ünün alternatif birleştirme2,3'tengeçebileceği tahmin edilmektedir. Bu, nöronal gelişim, apoptoz aktivasyonu ve hücresel stres yanıtı4gibi biyolojik süreçler için temeldir Organizmaya aynı gen repertuarını kullanarak hücre işleyişini düzenlemek için alternatifler sağlar.
Alternatif birleştirme için gerekli makine, konsitütif birleştirme için kullanılanla aynıdır ve SS kullanımı alternatif birleştirme oluşumu için ana belirleyicidir. Constitutive birleştirme, genellikle spliceosome tanıma için konsensüs motiflerine daha benzer olan güçlü birleştirme alanlarının kullanımı ile ilgilidir5.
Alternatif eksonlar tipik olarak, cis düzenleyiciunsurları, 5'SS ve 3'SS'deki diziler bu eksonları kuşatırken, spliceosome için daha düşük bir bağlama kapasitesi gösterdiğinde, konstrüktif eksonlardan daha az verimli olarak tanınır. mRNA ayrıca eksonlarda (eksonik birleştirme arttırıcıları (ESE'ler) ve eksonik birleştirme susturucularında (ESSs)) ve intronlarda (intronic splicing enhancers (ISS) ve intronic splicing susturucularında (ISSs)) bulunan ve eksonik kullanımı artıran veya bastıran güçlendiriciler veya susturucular (ISSs) adlı bölgeleriiçerir. Bu diziler, düzenleyici öğeler veya birleştirme faktörleri (SF) tarafından tanınır. SF'ler esas olarak iki protein ailesi tarafından temsil edilir, ESE'lere bağlanan serine / arginin zengin birleştirme faktörleri (SRSF'ler) ve ESSs dizilerine bağlanan heterojen nükleer ribonükleoproteinler (hnRNPs) ailesi5.
Alternatif birleştirme, etkileşim ortaklarını değiştiren trans faktörlerin fosforilasyonu / defosforilasyonu ve birleştirme faktörlerinin hücresel lokalizasyonu ile modüle edilebilir6,7,8. Birleştirme faktörlerinin yeni düzenleyicilerinin belirlenmesi, birleştirmeyi ve dolayısıyla bazı kanser tedavilerini düzenlemek için yeni araçlar sağlayabilir.
Anufrieva ve ark.9, bir mRNA mikroarray gen ekspresyon profilinde, 101 hücre hattında ve farklı stres koşullarından sonra (platin bazlı ilaçlar, gama ışınlama, topoisomeraz inhibitörleri, tirozin kinaz inhibitörleri ve taksonlar) spliceosomal bileşenlerin seviyelerinde tutarlı değişiklikler gözlemledi. Birleştirme paterni ve kemoterapi etkinliği arasındaki ilişki, kemoterapiye dirençli olan akciğer kanseri hücrelerinde, kaspaz-9 varyantları oranındaki değişiklikleri gösteren10. Kemoterapötik panel ile tedavi edilen HEK293 hücreleri, pro-apoptotik varyantlarda bir artışla birleştirmede değişiklikler göstermektedir. Gabriel ve ark.11, farklı hücre hatlarında cisplatin tedavisinden sonra en az 700 birleştirme etkinliğinde değişiklikler gözlemledi ve birleştirme yollarının cisplatin etkilendiğine işaret etti. Birleştirme modülatörleri, birleştirmenin tümöral gelişim ve esas olarak kemoterapi yanıtı 12 için önemli olduğunu gösteren anti-tümöral aktivitegöstermiştir. Bu nedenle, kemoterapötikler gibi hücresel stresör ajanlarından sonra birleştirmeyi düzenleyen yeni proteinleri karakterize etmek, yeni tedavi stratejilerini keşfetmek için çok önemlidir.
Interactome çalışmalarından alternatif birleştirme düzenlemesinin ipuçları, özellikle yeni veya karakteristik olmayan proteinlerin işlevlerini karakterize etmek için önemlidir, proteinin AS'deki gerçek rolünü doğrulamak için daha genel ve basit bir yaklaşım talep edebilir. Minigenler, birleştirme regülasyonını etkileyen bir proteinin genel rolünün analizi için önemli araçlardır. Alternatif olarak birikmiş ve kuşatıcı genomik bölgeler içeren ilgi geninden segmentler içerirler13. Bir minigene aracı kullanmak, minigenenin uzunluğu gibi küçük olan ve bu nedenle amplifikasyon reaksiyonu için bir sınırlama olmayan çeşitli avantajlarla in vivo birleştirmenin analizini sağlar; aynı minigene farklı hücre hatlarında değerlendirilebilir; tüm hücresel bileşenler, esas olarak çeviri sonrası modifikasyonlarını düzenleyen (fosforilasyon ve hücre bölmelerindeki değişiklikler) mevcuttur ve13,14. Ayrıca, hücresel stres sonrası alternatif birleştirme düzenindeki değişiklikler gözlenebilir ve minigene sisteminin kullanımı, farklı uyaranlar tarafından modüle edilen yolu tanımlamaya izin verir.
13,14, ancak, ön test olarak, minigeneE1A 15,5'SS seçiminin vivo olarak incelenmesi için çok iyi kurulmuş bir alternatif birleştirme muhabir sistemidir. Sadece bir genden, E1A, beş mRNA'lar, üç farklı 5′ splice bölgesinin ve bir büyük veya bir küçük 3′ splice sitesinin seçimine dayalı alternatif birleştirme ile üretilir16,17,18. E1A varyantlarının ekspresyonu Adenoviral enfeksiyon dönemine göre değişir19,20.
Daha önce her iki Nek4 izoformlarının da SRSF1 ve hnRNPA1 gibi birleştirme faktörleriyle etkileşime girdiğini ve isoform 2 değişiklikleri E1A alternatif birleştirmeyi minigene ederken, isoform 1'in bu21. İzoform 1 en bol izoform olduğundan ve kemoterapi direncini ve DNA hasar yanıtını değiştirdiğinden, stres durumunda minigene E1A alternatif birleştirmeyi değiştirip değiştiremeyeceğini değerlendiriyoruz.
Minigene tahlil basit, düşük maliyetli ve hızlı bir yöntemdir, çünkü sadece RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi, amplifikasyon ve agarose jel analizlerine ihtiyaç duyar ve farklı tedavilerin hücresel alternatif birleştirme deseni üzerindeki etkisine kadar ilgi çekici bir protein tarafından alternatif birleştirme üzerinde olası bir etkiden bu yana değerlendirmek için yararlı bir araç olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 pb DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 wells plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10297-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED FLUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP - pEGFPC3</td>
			<td>Clontech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated from Flp-In&#8482; T-REx&#8482; 293 - Invitrogen and described in ref 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10687010</td>
			<td>Used for Flp-In cells maintenemant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing and analysis software - FIJI software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ref. 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>117-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo DT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18418020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitxel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader/ UV absorbance</td>
			<td>Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Epoch Biotek/ Take3 adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Adrian Krainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A F</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;5&#8217; -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMTE1A R</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>5&#8217; -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3&#8217;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase - M-MLV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase - Superscript IV</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribunuclease inhibitor RNAse OUT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrSafe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Platinum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>10966026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracyclin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3383</td>
			<td>Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler Bio-Rad</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes

mRNA işleme, mRNA'yı çeviriye hazırlamak için 5'kapaklama, çoklu A ekleme ve birleştirme gibi birden fazla eşzamanlı adım içerir. Konsültasyonel birleştirmenin yanı sıra, alternatif mRNA birleştirme, bir genden çok fonksiyonlu proteinlerin ifadesini sağlar. Interactome çalışmaları genellikle yeni veya bilinmeyen proteinler için ilk analiz olduğundan, yem proteininin birleştirme faktörleriyle ilişkilendirmesi, mRNA birleştirme sürecine katılabileceğinin bir göstergesidir, ancak hangi bağlamda veya hangi genlerin düzenlendiğini belirlemek ampirik bir süreçtir. Bu işlevi değerlendirmek için iyi bir başlangıç noktası klasik minigene aracını kullanmaktır. Burada, farklı hücresel stres uyaranları sonrası alternatif birleştirme değişikliklerini değerlendirmek için adenoviral E1A minigene kullanımını sunuyoruz. Farklı stres tedavilerinden sonra NEK4 proteinini bıçaklayarak HEK293'te E1A minigene'nin birlenmesini değerlendirdik. Protokol, E1A minigene transfection, hücre tedavisi, RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezini, ardından PCR ve jel analizini ve E1A ekli varyantların nicelleştirilmesini içerir. Bu basit ve köklü yöntemin belirli tedavilerle birlikte kullanılması, hücresel süreçlere veya mRNA birleştirme ile hangi genlerin düzenlenebileceğine ışık tutmak için güvenilir bir başlangıç noktasıdır.

Kemoterapi sergisinden sonra hücrelerde birleştirme profilindeki değişiklikleri değerlendirmek için E1A minigene kullanılarak 5' splice sites tahlil yapıldı. Paclitaxel veya cisplatin tedavisinden sonra HEK293 stabil hücrelerinde AS regülasyonunda Nek4 - isoform 1'in rolü değerlendirildi.
Adenoviral E1A bölgesi, farklı splice donörlerinin kullanımı nedeniyle bir RNA öncüsünden üç ana mRNA'nın üretiminden...

Watch this Scientific Journal Video about Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes at JoVE.com

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Bu protokol, kemoterapötik tedaviden sonra alternatif birleştirme regülasyonunda karakteristik olmayan işleve sahip bir proteinin rolünü değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir araç sunar.

mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

Bu protokolün genel amacı, genel mRNA birleştirme değişikliklerini değerlendirmek için minigene E1A2'yi kullanmak için ayrıntılı rehberlik sağlamaktır. Bu, özel rejimlere veya laboratuvar koşullarına gerek kalmadan alternatif birleştirme düzenlemesinde hedef proteinin işlevini değerlendirmek için hızlı, ucuz ve basit bir araçtır. HEK 293 hücrelerini ilgi geninin kararlı ifadesiyle kült ederek başlayın.Hücreleri % 0.25 tripsin EDTA kullanarak bölün, ardından altı kuyu plakalarında kuyu başına 300.000 hücreyi plakalayın ve% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede 24 saat kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra, izdihamı kontrol edin ve HEK 293 kararlı hücrelerini sadece% 70 ila% 80 birleştiğinde transfect edin. Hücre kültürü ortamını bir pipetle dikkatlice çıkarın, ardından antibiyotiksiz iki mililitre tam DMEM ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.Transfeksiyon tamponu ile bir tüp hazırlayın, ardından iki mikrogram pMTE1A DNA, girdap ekleyin ve iki mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Vortex tekrar ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Plakaları inkübatörden çıkarın ve transfeksiyon karışımını damla açısından dikkatlice ekleyin.Transfeksiyondan altı saat sonra, Nek4 ekspresyon indüksiyonu için HEK 293 kararlı hücrelerine tetrasiklin ekleyin. Transfeksiyondan 24 saat sonra, floresan mikroskop kullanarak hücre morfolojisini ve transfeksiyon verimliliğini doğrulayın. Hücre kültürü ortamını çıkarmak için bir pipet kullanın, ardından kemoterapötiklerle hücre kültürü ortamı ekleyin.Hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatır. RNA toplamak için hücre kültürü ortamını atın ve doğrudan kuyuya 0,5 ila 1 mililitre RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin. Kuyular çok uyumluysa, RNA kalitesini artırmak için bir mililitre RNA ekstraksiyon reaktifi kullanın.Hücreleri bir pipetle homojenize edin ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hemen RNA ekstraksiyonuna devam edin veya örnekleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Numuneleri duman kaputunda çözün ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.0,1 ila 0,2 mililitre kloroform ekleyin ve kuvvetlice ajite edin, ardından oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın. 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüj, daha sonra üst sulu fazı toplayın ve yeni bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Toplam hacmin yaklaşık% 60'ını toplayın, ancak DNA'yı veya organik fazı toplamayın.0,25 ila 0,5 mililitre izopropanol ekleyin ve numuneyi dört kez ters çevrilerek ajite edin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın, sonra dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin ve üstnatantı atın. RNA peletini etanol ile iki kez yıkayın ve beş dakika boyunca 7.500 kez G'de santrifüjleyin, sonra etanol atın.Tüpü bir kağıt havlu üzerinde ters çevirerek fazla etanol çıkarın, ardından peleti beş ila 10 dakika boyunca kısmen kurutmak için tüpü bir duman kaputunun içinde açık bırakın. RNA peletini 15 mikrolitre DEPC arıtılmış suda yeniden askıya alın. Toplam RNA'yı ölçün ve absorbansı 230, 260 ve 280 nanometre olarak ölçerek RNA kalitesini doğrulayın.Toplam RNA kalitesini doğrulamak için, 30 dakika boyunca %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisinin %1,2'si ile önceden tedavi edilmiş %1 agarose jel çalıştırın. Toplam RNA'nın bir ila iki mikrogramını kullanarak cDNA sentezi gerçekleştirin. RNA, bir mikroligo d-T mikrolitresi, bir mikrolitre DNTP ve nükleaz içermeyen suyu 12 mikrolitreye birleştirin.Termo Cycler'daki reaksiyona 65 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatır. Termo Cycler'dan numuneleri çıkarın ve dört mikrolitre ters transkriptaz tamponu, iki mikrolitre DTT ve bir mikrolitre ribonikleaz inhibitörü ekleyin. İki dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yaslanın.Bir mikroliter termo-kararlı ters transkriptaz ekleyin ve 50 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Enzimi 70 santigrat derecede 15 dakika boyunca etkisiz hale getir. Metin el yazmasında açıklandığı gibi PCR yapın, ardından pcr ürününün 20 ila 25 mikrolitresini nükleik asit lekesi içeren% 3 agarose jel üzerine yükleyin ve yaklaşık bir saat boyunca 100 voltta çalıştırın.Herhangi bir bant doygunluğundan kaçınarak jeli fotoğraflayın ve bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bantları ölçün. 631, 493 ve 156 baz çiftlerindeki bantlar sırasıyla 13S, 12S ve 9S izoformlarına karşılık gelir. Yazılımın Dosya menüsünden görüntü dosyasını açın ve gri ölçeğe dönüştürün.Parlaklık ve Kontrast'ı ayarlayın, ardından gerekirse aykırı paraziti giderin. Dikdörtgen seçim aracıyla ilk şeridin etrafına bir dikdörtgen çizin ve Analiz Et, Jeller ve İlk Şeridi Seç komutundan veya klavye kısayolunu kullanarak seçin. İlk şeritteki dikdörtgenin ortasında tıklatıp tutmak için fareyi kullanın ve bir sonraki şeride sürükleyin.Analiz Et, Gel'ler'e gidin ve Sonraki Şeridi Seç'i seçin. Kalan tüm şeritler için bu adımı yineleyin. Tüm şeritler vurgulandıktan ve numaralandıktan sonra, her şeridin bir profil grafiğini çizmek için Analiz, Jeller ve Çizim Şeritleri'ne gidin.Arka plan gürültüsünü dışarıda bırakarak her bir banta karşılık gelen her tepenin tabanı boyunca bir çizgi çizmek için düz çizgi seçim aracını kullanın. Her şeritten tüm tepeler kapatıldıktan sonra, asa aracını seçin ve her tepenin içini tıklayın. Ölçümler, vurgulanan her tepe için sonuçlar penceresinde açılmalıdır.Yalnızca 631, 493 ve 156 baz çift bantlarına karşılık gelen 13S, 12S ve 9S zirvelerini göz önünde bulundurun. Elektronik tablo düzenleyicisi için yoğunluk verilerini kopyalayın ve her örnek için üç banttan da yoğunluğu toplayın, ardından her izoform için toplam göre yüzdeyi hesaplayın. Her izoformun yüzdelerini veya tedavi edilmemiş örneklere göre yüzdedeki farkları çizin.Üretilen her izoformdan mRNA oranını değerlendirerek alternatif birleştirme üzerindeki etkiyi gözlemlemek için E1A'dan minigene içeren bir plazmid kullanılmıştır. E1A izoformlarının bazal ekspresyolü, E1A ekspresyonunun hücre çizgisine ve zamanına bağlı olarak ortaya çıktı. HEK 293 stabil hücre hattı veya HEK 293 rekombinaz içeren bölge, HeLa hücrelerine kıyasla daha yüksek bir 13S ifadesi gösterdi, ancak 48 saatlik E1A ifadesinden sonra benzer 13S ve 12S izoform seviyeleri gösterdi.Cisplatin'e maruz kalan hücreler, 12S ekspresyondan yana beş asal S-S birleştirme seçiminde bir kayma gösterdi. Bu etki HEK 293'te Bayrak boş vektörü ve Nek4'ün isoform'larını kasten ifade ederken gözlenmiştir. Paclitaxel tedavisinden sonra alternatif birleştirmedeki değişiklikler çok gizliydi, ancak değişikliklerin yönleri Flag ve Nek4 eksprese hücrelerinde zıttı.Bu protokolü gerçekleştirirken, özellikle HEK 293 hücrelerini kullanırken endojen E1A ifadesiyle yanlış yorumlamayı önlemek için transtransfected ve ters olmayan transkriptaz kontrolleri kullanmak önemlidir. Olumlu sonuçlar alındıktan sonra kemoterapötik yanıtla ilgili spesifik genlerin alternatif biriktiği değerlendirilebilir. Bazı etkiler gözlendiğinde, bu basit protokol, proteinin örneğin kemoterapi yanıtında alternatif birleştirmeyi düzenleyen bir rol oynadığı daha tutarlı yollar için bu çalışmaları yönlendirebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Kan ve Serum lekeler kanser biyolojik değerlendirmek örnek depolama için yararlı bir araç olarak kurutulmuş

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer

18F-FDG PET/BT görüntüleme ve nicel Histoloji glikoz metabolizması akciğer kanserinin fare modellerinde dinamik değişiklikleri ölçmek için kullanmak

A hallmark of advanced tumors is a switch to aerobic glycolysis that is readily measured by [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Geri dönüşü olmayan Elektroporasyon etkilerini incelemek için bir Syngeneic pankreas kanseri fare modeli

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Karaciğer Metastazı Stromasını İncelemek için Kolorektal Kanser Organoidlerinin Portal Ven Enjeksiyonu

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...