Name: creating avian forebrain chimeras to assess facial development
Uploaded: 2021-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development at JoVE.com

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health under tildelingsnumre R01DE019648, R01DE018234 og R01DE019638.

Hvid Pekinand (Anas platyrhynchos), hvid leghornkylling (Gallus gallus) og japansk vagtel (Cortunix coturnix japonica) udruges ved 37 °C i et befugtet kammer, indtil den matches ved HH7/817.
1. Klargøring af donorvæv
BEMÆRK: Fremstilling af reagenser og værktøj og hvordan man åbner æg til eksperimentel manipulation er beskrevet6.
<ol><li>Forbered DMEM-medier med neutral rød, en gla...

<ol>
	<li>Waddington, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Mechanics+of+Chicken+and+Duck+Embryos.">Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos.</a> Nature. 125, 924-925 (1930).</li><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+neural+crest+in+patterning+of+avian+cranial+skeletal,+connective,+and+muscle+tissues.">The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues.</a> Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).</li><li>Borue, X., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+aberrant+craniofacial+myogenesis+by+grafted+trunk+somitic+and+segmental+plate+mesoderm.">Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm.</a> Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face.">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+signaling+properties+of+ectodermal+epithelia+during+craniofacial+development.">Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals.">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).</li><li>Griffin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+dosage+determines+midfacial+integration+and+polarity+within+the+nasal+and+optic+capsules.">Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules.</a> Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).</li><li>Schneider, R. A., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+origins+of+beak+morphology.">The cellular and molecular origins of beak morphology.</a> Science. 299 (5606), 565-568 (2003).</li><li>Tucker, A. S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+provide+species-specific+patterning+information+in+the+developing+branchial+skeleton.">Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton.</a> Evolution &amp; Development. 6 (1), 32-40 (2004).</li><li>Fish, J. L., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+species-specific+contributions+to+craniofacial+development+using+quail-duck+chimeras.">Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li><li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+and+the+origin+of+species-specific+pattern.">Neural crest and the origin of species-specific pattern.</a> Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).</li><li>Sohal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reciprocal+forebrain+transplantation+on+motility+and+hatching+in+chick+and+duck+embryos.">Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos.</a> Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).</li><li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+avian+brain+chimeras+reveal+that+large+brain+size+differences+are+influenced+by+cell-interdependent+processes.">Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes.</a> PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+pattern+the+surface+cephalic+ectoderm+during+FEZ+formation.">Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation.</a> Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).</li><li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+brain+induce+variation+in+avian+facial+shape.">Signals from the brain induce variation in avian facial shape.</a> Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+Between+the+Morphology+of+Sonic+Hedgehog+Expression+Domains+and+Embryonic+Craniofacial+Shape.">Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape.</a> Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).</li><li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+of+cartilage+size+and+shape+during+development+and+evolution.">The genesis of cartilage size and shape during development and evolution.</a> Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).</li><li>Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchyme-dependent+BMP+signaling+directs+the+timing+of+mandibular+osteogenesis.">Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis.</a> Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).</li></ol>

Den beskrevne metode tillader undersøgelse af vævsinteraktionerne mellem den basale forhjerne og den tilstødende ektoderm. Denne tilgang adskiller sig fra tidligere forhjernetransplantationsmetoder, fordi donorvævet var begrænset til den ventrale forhjerne. Dette eliminerer transplantation af neurale kamceller, som har vist sig at deltage i mønstrende ansigtsmorfologi 9,10. Derfor var det vigtigt at begrænse transplantatet til den basale forhjerne for at e...

Meget moderne forskning i udviklingsbiologi fokuserer på genernes rolle i udformningen af embryoner. Der er gode værktøjer til at undersøge udviklingsmekanismer fra et genetisk perspektiv. Imidlertid samles embryoner og gennemgår morfogenese som reaktion på vævsinteraktioner. Fuglesystemet er et klassisk værktøj, der bruges til at vurdere de forskellige vævsinteraktioner, der regulerer udviklingen af følgende grunde: embryologien er velforstået, embryonerne er let tilgængelige, værktøjer til analyse af fuglesystemer er veludviklede, og embryonerne er billige.
Fugletransplantationssystemet har været meget anvendt til afstamningssporing og til vurdering af vævsinteraktioner under udvikling i næsten et århundrede 1,2,3,4. Dette system blev brugt til at undersøge et signalcenter, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), der regulerer morfogenese af overkæben5, og en video blev offentliggjort, der beskriver denne teknik tidligere6. Ud over vagtel-chick er andre arter også blevet brugt til at producere kimærer til analyse af vævsinteraktioner. For eksempel blev musens FEZ transplanteret fra vilde type7 og mutante mus8, og andre har brugt et ande-, vagtel- og kyllingsystem til at vurdere neurale kams rolle i mønster af ansigtsskelettet 9,10,11,12.
I dette arbejde blev forhjernens rolle i reguleringen af genekspressionsmønsteret i FEZ ved at transplantere den ventrale forhjerne gensidigt blandt vagtler, ænder og kyllingembryoner vurderet, fordi der kræves et signal fra forhjernen for at inducere sonisk pindsvineekspression i FEZ. Forebrain transplantationer er ikke unikke på området. Disse transplantationer blev brugt til at vurdere udviklingen af motilitet i vagtel- og andeembryoner13, selvom der i disse forsøg også blev transplanteret væv, der bidrog til ikke-neurale derivater. I andet arbejde er auditive kredsløb hos fugle blevet vurderet ved forhjernetransplantation14, men disse transplantationer indeholdt formodede neurale kamceller, som bidrager til ansigtsform 9,10 og deltager i reguleringen af SH-ekspression i FEZ 15. Derfor blev et system til kun at transplantere den ventrale forhjerne fra en fugleart til en anden inden lukning af neuralrøret udtænkt for at vurdere hjernens rolle i ansigtsform16 (figur 1A, B). Denne metode var blottet for neurale kamforurening af transplantatet. I denne artikel illustreres metoden, og de forventede resultater beskrives, og de udfordringer, der står over for, diskuteres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>TEK</td>
			<td>TEKZR114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35x10 mm Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>553-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating avian forebrain chimeras to assess facial development

Fugleembryoet er blevet brugt som modelsystem i mere end et århundrede og har ført til grundlæggende forståelse af hvirveldyrs udvikling. En af styrkerne ved dette modelsystem er, at effekten af og interaktionen mellem væv kan vurderes direkte i kimære embryoner. Vi har tidligere vist, at signaler fra forhjernen bidrager til ansigtsmorfogenese ved at regulere formen på ekspressionsdomænet for sonisk pindsvin (SHH) i Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). I denne artikel beskrives metoden til generering af forhjernekimærerne og illustrationer af resultaterne af disse eksperimenter.

Vurdering af kimærisme og transplantationsforurening For at vurdere kimærerne bør omfanget af kimærisme og kontaminering af transplantatet med andre celletyper behandles. Oprettelse af kimærer ved at transplantere vagtelvæv i kyllingembryoner muliggør denne type analyse. Ved hjælp af QCPN kan vagtelceller visualiseres og skelnes fra værtsvævene (figur 1 C, D). I dette tilfælde blev kun væv afledt af den ventrale forhjerne farvet med antistoffe...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development at JoVE.com

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Denne artikel beskriver en vævstransplantationsteknik, der er designet til at teste signal- og mønsteregenskaberne hos basal forhjerne under kraniofacial udvikling.

Oprettelse af fugleforhjernekimærer til vurdering af ansigtsudvikling

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

Denne metode gør det muligt for efterforskere at vurdere vævsinteraktioner mellem den basale forhjerne og ansigtet. Den største fordel ved denne teknik er, at den isolerer den basale forhjerne til vurdering og forhindrer forurening med neurale kamceller, hvilket ville forvirre analysen. Den vanskelige del af denne teknik er fjernelse af forhjernen fra værten og udskiftning med donorvævet.Diane Hu, en forsker fra Dr. Ralph Marcucios laboratorium, vil demonstrere proceduren. Til at begynde med skal du forberede DMEM-medier med neutral rød, en glasoverførselspipette og skærpet wolfram. Brug en 10 ml sprøjte og en 18 gauge nål til at fjerne 0,5 ml albumin fra den spidse ende af æggeskallen.Lav et lille hul oven på skallen ved hjælp af saksen. Placer derefter et stykke tape over hullet og skær en cirkulær åbning for at udsætte embryoet. Plet embryoet med neutralt rødt.Høst vævstransplantater fra venstre side af den basale forhjerne i fase syv eller otte embryoner. Brug buede skærpede wolframnåle til forsigtigt at skære et stykke af forhjernen. For ikke at inkludere den underliggende endoderm skal nålen glide under forhjernen og parallelt med neuralrørets akse.Transplantatet tages op fra donorembryoet ved hjælp af glasoverførselspipetten, og overfør det til DMEM, der indeholder neutralt rødt, i to minutter for at plette det. Placer derefter det farvede transplantat i DMEM, der ikke indeholder neutral rød, før den er klar til engraftment. Inkuber befrugtede æg fra hvid leghorn kylling ved 37 grader Celsius i et befugtet kammer indtil Hamburger-Hamilton fase syv til otte.Udsæt embryoner som tidligere demonstreret. Brug skærpede wolframnåle til at forberede transplantatstedet ved at skære og derefter fjerne et 0,3 x 0,2 millimeter stykke basal forhjerne for at rumme transplantatet. Undgå overdreven forstyrrelse af den underliggende endoderm, hvilket vil være tydeligt, da æggeblommegranulat begynder at lække gennem enhver tåre, der er lavet.Efter overførsel af transplantatet til værten skal du placere transplantatet for at erstatte værtens uddøde basale forhjerne. Placer tape tæt over hullet, og returner embryonerne til 37 grader Celsius-inkubatoren, indtil de er klar til analyse. Indledningsvis blev kimærer skabt ved at transplantere vagtelvæv i kyllingembryoner.Ved hjælp af QCPN-antistoffet blev vagtelceller visualiseret og adskilt fra værtsvævene. Vagtel-chick-systemet bekræftede, at alt transplantat kun bestod af neuralt væv og ikke var forurenet med andre celletyper. Transplantation af vagtelvæv i ænderembryoner førte til alvorligt deformerede kimærer på grund af en hurtigere udviklende vagtelhjerne.Derfor blev transplantation af ændervæv i kyllingembryoner udført. De resulterende duck-chick kimærer tyder på, at hjernen deltager i regulering af morfologi. Hele bjerg C2 hybridisering blev brugt til at vurdere Sonic pindsvin udtryk i kimærer.I lighed med morfologi syntes sonisk pindsvineudtryk på andesiden af kimæren mere andelignende. Forberedelse af værtsstedet kræver øvelse. Et stort antal embryoner overlever ikke, så oprettelse af et stort antal kimærer kan hjælpe med at sikre korrekte prøver til analyse.Denne metode gjorde det muligt at vurdere, hvordan signaler fra hjernen former det soniske pindsvineekspressionsdomæne i den frontonasale ektodermale zone.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimeret<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrkning af kyllingeembryoer til fremskredne stadier af udvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development

Immunfarvning at Visualiser Murine enteriske nervesystem Udvikling

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Brug Light Sheet Fluorescens mikroskopi til billede zebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroinjektion-baseret System for i Vivo Implantation af embryonale Cardiomyocytes i aviær Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i aviær embryoner ved hjælp af mRNA-elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkte og enkel metode til at vurdere Drosophila melanogasterslevedygtighed fra embryo til voksen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...