Name: creating avian forebrain chimeras to assess facial development
Uploaded: 2021-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development at JoVE.com

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למחקר שיניים וקרניופציאליות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרסים R01DE019648, R01DE018234 ו- R01DE019638.

ברווז פקין לבן (Anas platyrhynchos), עוף לגהורן לבן (Gallus gallus) ושליו יפני (Cortunix coturnix japonica) מודגרים ב 37 ° C בתא לח עד שלב תואם ב HH7/817.
1. הכנת הרקמה התורמת
הערה: הכנת ריאגנטים וכלים וכיצד לפתוח ביצים למניפולציה ניסיוניתתוארה 6.
<ol><li>הכן...

<ol>
	<li>Waddington, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Mechanics+of+Chicken+and+Duck+Embryos.">Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos.</a> Nature. 125, 924-925 (1930).</li><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+neural+crest+in+patterning+of+avian+cranial+skeletal,+connective,+and+muscle+tissues.">The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues.</a> Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).</li><li>Borue, X., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+aberrant+craniofacial+myogenesis+by+grafted+trunk+somitic+and+segmental+plate+mesoderm.">Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm.</a> Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face.">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+signaling+properties+of+ectodermal+epithelia+during+craniofacial+development.">Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals.">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).</li><li>Griffin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+dosage+determines+midfacial+integration+and+polarity+within+the+nasal+and+optic+capsules.">Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules.</a> Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).</li><li>Schneider, R. A., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+origins+of+beak+morphology.">The cellular and molecular origins of beak morphology.</a> Science. 299 (5606), 565-568 (2003).</li><li>Tucker, A. S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+provide+species-specific+patterning+information+in+the+developing+branchial+skeleton.">Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton.</a> Evolution &amp; Development. 6 (1), 32-40 (2004).</li><li>Fish, J. L., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+species-specific+contributions+to+craniofacial+development+using+quail-duck+chimeras.">Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li><li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+and+the+origin+of+species-specific+pattern.">Neural crest and the origin of species-specific pattern.</a> Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).</li><li>Sohal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reciprocal+forebrain+transplantation+on+motility+and+hatching+in+chick+and+duck+embryos.">Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos.</a> Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).</li><li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+avian+brain+chimeras+reveal+that+large+brain+size+differences+are+influenced+by+cell-interdependent+processes.">Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes.</a> PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+pattern+the+surface+cephalic+ectoderm+during+FEZ+formation.">Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation.</a> Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).</li><li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+brain+induce+variation+in+avian+facial+shape.">Signals from the brain induce variation in avian facial shape.</a> Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+Between+the+Morphology+of+Sonic+Hedgehog+Expression+Domains+and+Embryonic+Craniofacial+Shape.">Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape.</a> Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).</li><li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+of+cartilage+size+and+shape+during+development+and+evolution.">The genesis of cartilage size and shape during development and evolution.</a> Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).</li><li>Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchyme-dependent+BMP+signaling+directs+the+timing+of+mandibular+osteogenesis.">Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis.</a> Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).</li></ol>

השיטה המתוארת מאפשרת לבחון את יחסי הגומלין בין המוח הקדמי הבסיסי לבין האקטודרם הסמוך. גישה זו שונה משיטות השתלת מוח קדמי קודמות, מכיוון שרקמת התורם הייתה מוגבלת למוח הקדמי הגחוני. זה מבטל השתלה של תאי הפסגה העצבית, אשר הוכחו להשתתף בדפוס מורפולוגיית הפנים 9,10</su...

רוב המחקר העכשווי בביולוגיה התפתחותית מתמקד בתפקידם של גנים בעיצוב עוברים. יש כלים טובים לבחון מנגנונים התפתחותיים מנקודת מבט גנטית. עם זאת, עוברים מורכבים ועוברים מורפוגנזה בתגובה לאינטראקציות בין רקמות. מערכת העופות היא כלי קלאסי המשמש להערכת מגוון אינטראקציות הרקמות המווסתות את ההתפתחות מהסיבות הבאות: האמבריולוגיה מובנת היטב, העוברים נגישים בקלות, הכלים לניתוח מערכות העופות מפותחים והעוברים זולים.
מערכת השתלות העופות נמצאת בשימוש נרחב למעקב אחר שושלות ולהערכת אינטראקציות רקמות במהלך ההתפתחות במשך כמעט מאה שנה 1,2,3,4. מערכת זו שימשה לחקר מרכז איתות, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), המווסת מורפוגנזה של הלסת העליונה5, ופורסם סרטון המתאר טכניקה זו בעבר6. בנוסף לגוזל שליו, מינים אחרים שימשו גם לייצור כימרות לניתוח אינטראקציות בין רקמות. לדוגמה, העכבר FEZ הושתל מעכברים פראיים מסוג7 ועכברים מוטנטיים8, ואחרים השתמשו במערכות ברווז, שליו ואפרוחים כדי להעריך את התפקיד של סמל עצבי בעיצוב שלד הפנים 9,10,11,12.
בעבודה זו הוערך תפקידו של המוח הקדמי בוויסות דפוס ביטוי הגנים ב-FEZ על ידי השתלת המוח הקדמי הגחוני באופן הדדי בין עוברי שליו, ברווז ואפרוחים, מאחר שנדרש אות מהמוח הקדמי כדי לגרום לביטוי קיפוד סוניק ב-FEZ. השתלות מוח קדמי אינן ייחודיות בתחום. השתלות אלה שימשו להערכת התפתחות תנועתיות בעוברי שליו וברווז13, אם כי בניסויים אלה הושתלו גם רקמות שתרמו לנגזרות לא עצביות. בעבודות אחרות, מעגלי שמיעה בציפורים הוערכו על ידי השתלת מוח קדמי14, אך השתלות אלה הכילו תאי פסגה עצביים משוערים, התורמים לצורת הפנים 9,10 ומשתתפים בוויסות הבעת SHH ב- FEZ 15. לפיכך, פותחה מערכת להשתלת המוח הקדמי הגחוני בלבד ממין אחד של ציפור למשנהו לפני סגירת הצינור העצבי כדי להעריך את תפקיד המוח בצורת פנים 16 (איור 1A,B). שיטה זו הייתה נטולת זיהום עצבי של השתל. במאמר זה מודגמת השיטה ומתוארות התוצאות הצפויות, ונדונים האתגרים הניצבים בפנינו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>TEK</td>
			<td>TEKZR114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35x10 mm Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>553-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating avian forebrain chimeras to assess facial development

עובר העופות שימש כמערכת מודל במשך יותר ממאה שנה והוביל להבנה בסיסית של התפתחות בעלי חוליות. אחת מנקודות החוזק של מערכת מודל זו היא שניתן להעריך ישירות את ההשפעה של רקמות ואינטראקציה ביניהן בעוברים כימריים. הראינו בעבר כי אותות מהמוח הקדמי תורמים למורפוגנזה של הפנים על ידי ויסות צורת תחום הביטוי של קיפוד סוניק (SHH) באזור האקטודרמלי הקדמי (FEZ). במאמר זה מתוארת השיטה ליצירת כימרות במוח הקדמי ולספק המחשות לתוצאות ניסויים אלה.

הערכת כימריזם וזיהום השתלות על מנת להעריך את הכימרות, יש להתייחס למידת הכימריזם והזיהום של השתל עם סוגי תאים אחרים. יצירת כימרות על ידי השתלת רקמות שליו בעוברי אפרוחים מאפשרת ניתוח מסוג זה. באמצעות נוגדן QCPN ניתן להמחיש תאי שליו ולהבדיל בינם לבין הרקמות המארחות (איור 1...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development at JoVE.com

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שנועדה לבחון את תכונות האיתות והדפוס של המוח הקדמי הבסיסי במהלך התפתחות הגולגולת.

יצירת כימרות במוח הקדמי של העופות להערכת התפתחות הפנים

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

שיטה זו מאפשרת לחוקרים להעריך אינטראקציות רקמות בין המוח הקדמי הבסיסי לבין הפנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מבודדת את המוח הקדמי הבסיסי להערכה ומונעת זיהום עם תאי פסגה עצבית, אשר יבלבל את הניתוח. החלק הקשה בטכניקה זו הוא הסרת המוח הקדמי מהפונדקאי והחלפתו ברקמת התורם.מי שתדגים את ההליך תהיה דיאן הו, מדענית מחקר ממעבדתו של ד"ר ראלף מרקוצ'יו. כדי להתחיל, להכין מדיה DMEM עם אדום ניטרלי, פיפטה העברת זכוכית, טונגסטן מושחז. בעזרת מזרק 10 מיליליטר ומחט 18 מד, מוציאים 0.5 מיליליטר אלבומין מהקצה המחודד של קליפת הביצה.צור חור קטן על גבי הקליפה באמצעות נקודת מספריים. לאחר מכן מניחים חתיכת סרט מעל החור וחותכים פתח עגול כדי לחשוף את העובר. מכתימים את העובר באדום נייטרלי.קצור שתלי רקמה מהצד השמאלי של המוח הקדמי הבסיסי של שלב שבע או שמונה עוברים. השתמש מחטי טונגסטן מחודדות מעוקלות כדי לחתוך בעדינות חתיכה של המוח הקדמי. כדי לא לכלול את האנדודרם הבסיסי, החליקו את המחט מתחת למוח הקדמי ובמקביל לציר הצינור העצבי.הרימו את השתל מהעובר התורם באמצעות פיפטת העברת הזכוכית, והעבירו אותו ל- DMEM המכיל אדום נייטרלי למשך שתי דקות כדי להכתים אותו. לאחר מכן הניחו את השתל המוכתם ב-DMEM שאינו מכיל אדום נייטרלי עד שהוא מוכן לקליטה. דוגרים על ביצים מופרות מתרנגולת לגהורן לבנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח עד לשלב המבורגר-המילטון בשלב שבע עד שמונה.לחשוף עוברים כפי שהודגם בעבר. באמצעות מחטי טונגסטן מושחזות, הכינו את אתר השתל על ידי חיתוך ולאחר מכן הסרה של חתיכה בגודל 0.3 על 0.2 מילימטר של המוח הקדמי הבסיסי כדי להתאים לשתל. הימנע הפרעה מוגזמת של האנדודרם הבסיסי, אשר יהיה ניכר כמו גרגרי חלמון יתחילו לדלוף דרך כל קרע שנוצר.לאחר העברת השתל לפונדקאי, מקם את השתל כך שיחליף את המוח הקדמי הבזאלי של המארח. מניחים נייר דבק בחוזקה מעל החור, ומחזירים את העוברים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לניתוח. בתחילה, כימרות נוצרו על ידי השתלת רקמות שליו לעוברי אפרוחים.באמצעות נוגדן QCPN, תאי שליו הודגמו ונבדלו מהרקמות המארחות. מערכת אפרוח השליו אישרה כי כל השתל מורכב רק מרקמה עצבית ולא היה מזוהם עם סוגי תאים אחרים. השתלת רקמת שליו בעוברי ברווזים הובילה לעיוות חמור של כימרות עקב מוח שליו המתפתח מהר יותר.לכן, בוצעה השתלת רקמות ברווז בעוברי תרנגולות. הכימרות המתקבלות כתוצאה מכך מצביעות על כך שהמוח משתתף בוויסות המורפולוגיה. הכלאה של הר שלם C2 שימשה להערכת ביטוי קיפוד סוניק בכימרות.בדומה למורפולוגיה, ביטוי הקיפוד הסוניק בצד הברווז של הכימרה נראה דומה יותר לברווז. הכנת האתר המארח דורשת תרגול. מספר גדול של עוברים אינם שורדים, ולכן יצירת מספר גדול של כימרות יכולה לעזור להבטיח דגימות נאותות לניתוח.שיטה זו אפשרה להעריך כיצד אותות מהמוח מעצבים את תחום הביטוי של קיפוד סוניק באזור האקטודרמלי הקדמי.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

מותאם באופן מיטבי<em&gt; Ex-אובו</em&gt; Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development

Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...