Name: creating avian forebrain chimeras to assess facial development
Uploaded: 2021-02-18T13:00:00
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La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental and Craniofacial Research del National Institutes of Health con i numeri di premio R01DE019648, R01DE018234 e R01DE019638.

L'anatra pechinese bianca (Anas platyrhynchos), il pollo livornese bianco (Gallus gallus) e la quaglia giapponese (Cortunix coturnix japonica) vengono incubati a 37 °C in una camera umidificata fino allo stadio HH7/817.
1. Preparazione del tessuto donatore
NOTA: È stata descritta la preparazione dei reagenti e degli strumenti e come aprire le uova per la manipolazione sperimentale6.
<ol><...

<ol>
	<li>Waddington, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Mechanics+of+Chicken+and+Duck+Embryos.">Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos.</a> Nature. 125, 924-925 (1930).</li><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+neural+crest+in+patterning+of+avian+cranial+skeletal,+connective,+and+muscle+tissues.">The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues.</a> Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).</li><li>Borue, X., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+aberrant+craniofacial+myogenesis+by+grafted+trunk+somitic+and+segmental+plate+mesoderm.">Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm.</a> Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face.">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+signaling+properties+of+ectodermal+epithelia+during+craniofacial+development.">Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals.">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).</li><li>Griffin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+dosage+determines+midfacial+integration+and+polarity+within+the+nasal+and+optic+capsules.">Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules.</a> Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).</li><li>Schneider, R. A., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+origins+of+beak+morphology.">The cellular and molecular origins of beak morphology.</a> Science. 299 (5606), 565-568 (2003).</li><li>Tucker, A. S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+provide+species-specific+patterning+information+in+the+developing+branchial+skeleton.">Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton.</a> Evolution &amp; Development. 6 (1), 32-40 (2004).</li><li>Fish, J. L., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+species-specific+contributions+to+craniofacial+development+using+quail-duck+chimeras.">Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li><li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+and+the+origin+of+species-specific+pattern.">Neural crest and the origin of species-specific pattern.</a> Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).</li><li>Sohal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reciprocal+forebrain+transplantation+on+motility+and+hatching+in+chick+and+duck+embryos.">Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos.</a> Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).</li><li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+avian+brain+chimeras+reveal+that+large+brain+size+differences+are+influenced+by+cell-interdependent+processes.">Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes.</a> PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+pattern+the+surface+cephalic+ectoderm+during+FEZ+formation.">Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation.</a> Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).</li><li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+brain+induce+variation+in+avian+facial+shape.">Signals from the brain induce variation in avian facial shape.</a> Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+Between+the+Morphology+of+Sonic+Hedgehog+Expression+Domains+and+Embryonic+Craniofacial+Shape.">Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape.</a> Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).</li><li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+of+cartilage+size+and+shape+during+development+and+evolution.">The genesis of cartilage size and shape during development and evolution.</a> Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).</li><li>Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchyme-dependent+BMP+signaling+directs+the+timing+of+mandibular+osteogenesis.">Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis.</a> Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).</li></ol>

Il metodo descritto consente l'esame delle interazioni tissutali tra il proencefalo basale e l'ectoderma adiacente. Questo approccio differisce dai precedenti metodi di trapianto del proencefalo, perché il tessuto del donatore era limitato al proencefalo ventrale. Questo elimina il trapianto delle cellule della cresta neurale, che hanno dimostrato di partecipare al pattern della morfologia facciale 9,10. Quindi, limitare l'innesto al proencefalo basale era essen...

Gran parte della ricerca contemporanea in biologia dello sviluppo si concentra sul ruolo dei geni nella formazione degli embrioni. Ci sono buoni strumenti per esaminare i meccanismi di sviluppo da una prospettiva genetica. Tuttavia, gli embrioni vengono assemblati e subiscono morfogenesi in risposta alle interazioni tissutali. Il sistema aviario è uno strumento classico utilizzato per valutare la varietà di interazioni tissutali che regolano lo sviluppo per i seguenti motivi: l'embriologia è ben compresa, gli embrioni sono facilmente accessibili, gli strumenti per l'analisi dei sistemi aviari sono ben sviluppati e gli embrioni sono poco costosi.
Il sistema di trapianto aviario è stato ampiamente utilizzato per tracciare il lignaggio e per valutare le interazioni tissutali durante lo sviluppo per quasi un secolo 1,2,3,4. Questo sistema è stato utilizzato per studiare un centro di segnalazione, la zona ectodermica frontonasale (FEZ), che regola la morfogenesi della mascella superiore5, ed è stato pubblicato un video che descrive quella tecnica in precedenza6. Oltre al pulcino di quaglia, altre specie sono state utilizzate anche per produrre chimere per l'analisi delle interazioni tissutali. Ad esempio, il topo FEZ è stato trapiantato da topi selvatici di tipo7 e topi mutanti8, e altri hanno utilizzato un sistema di anatra, quaglia e pulcino per valutare il ruolo della cresta neurale nel modellare lo scheletro facciale 9,10,11,12.
In questo lavoro, è stato valutato il ruolo del proencefalo nella regolazione del modello di espressione genica nella zona FEZ trapiantando reciprocamente il proencefalo ventrale tra embrioni di quaglia, anatra e pulcino, perché è necessario un segnale dal proencefalo per indurre l'espressione del riccio sonico nella FEZ. I trapianti di proencefalo non sono unici nel campo. Questi trapianti sono stati utilizzati per valutare lo sviluppo della motilità negli embrioni di quaglia e anatra13, sebbene in questi esperimenti siano stati trapiantati anche tessuti che hanno contribuito a derivati non neurali. In altri lavori, i circuiti uditivi negli uccelli sono stati valutati mediante trapianto di proencefalo14, ma questi trapianti contenevano presunte cellule della cresta neurale, che contribuiscono alla forma del viso 9,10 e partecipano alla regolazione dell'espressione di SHH nella FEZ 15. Quindi, è stato ideato un sistema per trapiantare solo il proencefalo ventrale da una specie di uccello a un'altra prima della chiusura del tubo neurale per valutare il ruolo del cervello nella forma facciale16 (Figura 1A, B). Questo metodo era privo di contaminazione della cresta neurale dell'innesto. In questo articolo, il metodo è illustrato e vengono descritti i risultati attesi e vengono discusse le sfide affrontate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>TEK</td>
			<td>TEKZR114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35x10 mm Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>553-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating avian forebrain chimeras to assess facial development

L'embrione aviario è stato utilizzato come sistema modello per più di un secolo e ha portato a una comprensione fondamentale dello sviluppo dei vertebrati. Uno dei punti di forza di questo sistema modello è che l'effetto e l'interazione tra i tessuti possono essere valutati direttamente negli embrioni chimerici. Abbiamo precedentemente dimostrato che i segnali provenienti dal proencefalo contribuiscono alla morfogenesi facciale regolando la forma del dominio di espressione del riccio sonico (SHH) nella zona ectodermica frontonasale (FEZ). In questo articolo, viene descritto il metodo per generare le chimere del proencefalo e fornire illustrazioni dei risultati di questi esperimenti.

Valutazione del chimerismo e della contaminazione da trapianto Al fine di valutare le chimere, deve essere affrontata l'entità del chimerismo e della contaminazione dell'innesto con altri tipi di cellule. La creazione di chimere trapiantando tessuti di quaglia in embrioni di pulcino consente questo tipo di analisi. Utilizzando l'anticorpo QCPN le cellule di quaglia possono essere visualizzate e distinte dai tessuti ospiti (Figura 1 C,D). In questo caso, ...

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Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Questo articolo descrive una tecnica di trapianto di tessuto che è stata progettata per testare le proprietà di segnalazione e pattern del proencefalo basale durante lo sviluppo craniofacciale.

Creazione di chimere del proencefalo aviario per valutare lo sviluppo facciale

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

Questo metodo consente ai ricercatori di valutare le interazioni tissutali tra il proencefalo basale e il viso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che isola il proencefalo basale per la valutazione e previene la contaminazione con le cellule della cresta neurale, che confonderebbe l'analisi. La parte difficile di questa tecnica è la rimozione del proencefalo dall'ospite e la sostituzione con il tessuto donatore.A dimostrare la procedura sarà Diane Hu, ricercatrice del laboratorio del Dr.Ralph Marcucio. Per iniziare, preparare i supporti DMEM con rosso neutro, una pipetta di trasferimento del vetro e tungsteno affilato. Utilizzando una siringa da 10 millilitri e un ago da 18 gauge, rimuovere 0,5 millilitri di albumina dall'estremità appuntita del guscio d'uovo.Fai un piccolo foro sopra il guscio usando la punta delle forbici. Quindi posizionare un pezzo di nastro adesivo sopra il foro e tagliare un'apertura circolare per esporre l'embrione. Macchia l'embrione con rosso neutro.Raccogliere innesti di tessuto dal lato sinistro del proencefalo basale degli embrioni allo stadio sette o otto. Utilizzare aghi di tungsteno affilati curvi per incidere delicatamente un pezzo del proencefalo. Per non includere l'endoderma sottostante, far scorrere l'ago sotto il proencefalo e parallelamente all'asse del tubo neurale.Prelevare l'innesto dall'embrione donatore usando la pipetta di trasferimento di vetro e trasferirlo in DMEM contenente rosso neutro per due minuti per colorarlo. Quindi posizionare l'innesto colorato in DMEM che non contiene rosso neutro fino a quando non è pronto per l'attecchimento. Incubare le uova fecondate dal pollo bianco livornese a 37 gradi Celsius in una camera umidificata fino alla settima all'ottava tappa di Hamburger-Hamilton.Esporre gli embrioni come precedentemente dimostrato. Utilizzando aghi di tungsteno affilati, preparare il sito di innesto tagliando e quindi rimuovendo un pezzo di proencefalo basale di 0,3 x 0,2 millimetri per accogliere l'innesto. Evitare un'eccessiva interruzione dell'endoderma sottostante, che sarà evidente poiché i granuli di tuorlo inizieranno a fuoriuscire attraverso qualsiasi lacrima fatta.Dopo aver trasferito l'innesto all'ospite, posizionare l'innesto per sostituire il proencefalo basale estirpato dell'ospite. Posizionare del nastro adesivo strettamente sopra il foro e restituire gli embrioni all'incubatore a 37 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'analisi. Inizialmente, le chimere sono state create trapiantando tessuti di quaglia in embrioni di pulcino.Utilizzando l'anticorpo QCPN, le cellule di quaglia sono state visualizzate e distinte dai tessuti ospiti. Il sistema quaglia-pulcino ha confermato che tutto l'innesto era costituito solo da tessuto neurale e non era contaminato da altri tipi di cellule. Il trapianto di tessuto di quaglia in embrioni di anatra ha portato a chimere gravemente deformate a causa di un cervello di quaglia in rapido sviluppo.Pertanto, è stato eseguito il trapianto di tessuti di anatra in embrioni di pollo. Le chimere risultanti anatra-pulcino suggeriscono che il cervello partecipa alla regolazione della morfologia. L'ibridazione C2 dell'intera montagna è stata utilizzata per valutare l'espressione del riccio sonico nelle chimere.Simile alla morfologia, l'espressione del riccio sonico sul lato dell'anatra della chimera appariva più simile a un'anatra. La preparazione del sito ospitante richiede pratica. Un gran numero di embrioni non sopravvive, quindi la creazione di un gran numero di chimere può aiutare a garantire campioni adeguati per l'analisi.Questo metodo ha permesso di valutare come i segnali provenienti dal cervello modellano il dominio di espressione del riccio sonico nella zona ectodermica frontonasale.

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