Name: creating avian forebrain chimeras to assess facial development
Uploaded: 2021-02-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development at JoVE.com

Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av National Institute of Dental and Craniofacial Research vid National Institutes of Health under prisnummer R01DE019648, R01DE018234 och R01DE019638.

Vit pekinand (Anas platyrhynchos), vit leghornskyckling (Gallus gallus) och japansk vaktel (Cortunix coturnix japonica) inkuberas vid 37 °C i en fuktad kammare tills de matchas i stadiet vid HH7/817.
1. Beredning av donatorvävnaden
OBS: Beredning av reagens och verktyg och hur man öppnar ägg för experimentell manipulation har beskrivits6.
<ol><li>Förbered DMEM-media med neutralrött, ...

<ol>
	<li>Waddington, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Mechanics+of+Chicken+and+Duck+Embryos.">Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos.</a> Nature. 125, 924-925 (1930).</li><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+neural+crest+in+patterning+of+avian+cranial+skeletal,+connective,+and+muscle+tissues.">The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues.</a> Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).</li><li>Borue, X., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+aberrant+craniofacial+myogenesis+by+grafted+trunk+somitic+and+segmental+plate+mesoderm.">Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm.</a> Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).</li><li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quail-chick+chimeras.">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face.">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+signaling+properties+of+ectodermal+epithelia+during+craniofacial+development.">Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals.">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).</li><li>Griffin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+dosage+determines+midfacial+integration+and+polarity+within+the+nasal+and+optic+capsules.">Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules.</a> Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).</li><li>Schneider, R. A., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+origins+of+beak+morphology.">The cellular and molecular origins of beak morphology.</a> Science. 299 (5606), 565-568 (2003).</li><li>Tucker, A. S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+provide+species-specific+patterning+information+in+the+developing+branchial+skeleton.">Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton.</a> Evolution &amp; Development. 6 (1), 32-40 (2004).</li><li>Fish, J. L., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+species-specific+contributions+to+craniofacial+development+using+quail-duck+chimeras.">Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li><li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+and+the+origin+of+species-specific+pattern.">Neural crest and the origin of species-specific pattern.</a> Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).</li><li>Sohal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reciprocal+forebrain+transplantation+on+motility+and+hatching+in+chick+and+duck+embryos.">Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos.</a> Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).</li><li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+avian+brain+chimeras+reveal+that+large+brain+size+differences+are+influenced+by+cell-interdependent+processes.">Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes.</a> PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+pattern+the+surface+cephalic+ectoderm+during+FEZ+formation.">Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation.</a> Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).</li><li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+brain+induce+variation+in+avian+facial+shape.">Signals from the brain induce variation in avian facial shape.</a> Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+Between+the+Morphology+of+Sonic+Hedgehog+Expression+Domains+and+Embryonic+Craniofacial+Shape.">Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape.</a> Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).</li><li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+of+cartilage+size+and+shape+during+development+and+evolution.">The genesis of cartilage size and shape during development and evolution.</a> Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).</li><li>Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchyme-dependent+BMP+signaling+directs+the+timing+of+mandibular+osteogenesis.">Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis.</a> Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).</li></ol>

Den beskrivna metoden möjliggör undersökning av vävnadsinteraktionerna mellan den basala framhjärnan och den intilliggande ektodermen. Detta tillvägagångssätt skiljer sig från tidigare prebraintransplantationsmetoder, eftersom donatorvävnaden var begränsad till den ventrala framhjärnan. Detta eliminerar transplantation av neuralkamcellerna, som har visat sig delta i mönstring av ansiktsmorfologi 9,10. Därför var det viktigt att begränsa transplant...

Mycket samtida forskning inom utvecklingsbiologi fokuserar på genernas roll i att forma embryon. Det finns bra verktyg för att undersöka utvecklingsmekanismer ur ett genetiskt perspektiv. Embryon monteras emellertid och genomgår morfogenes som svar på vävnadsinteraktioner. Fågelsystemet är ett klassiskt verktyg som används för att bedöma de olika vävnadsinteraktioner som reglerar utvecklingen av följande skäl: embryologin är väl förstådd, embryon är lättillgängliga, verktyg för analys av fågelsystem är välutvecklade och embryon är billiga.
Fågeltransplantationssystemet har använts i stor utsträckning för härstamningsspårning och för att bedöma vävnadsinteraktioner under utveckling i nästan ett sekel 1,2,3,4. Detta system användes för att undersöka ett signalcenter, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), som reglerar morfogenes av överkäken5, och en video publicerades som beskriver den tekniken tidigare6. Förutom vaktel-chick har andra arter också använts för att producera chimärer för analys av vävnadsinteraktioner. Till exempel transplanterades musen FEZ från vilda typ7 och mutanta möss8, och andra har använt ett anka-, vaktel- och kycklingsystem för att bedöma rollen som neuralvapen i mönstring av ansiktsskelettet 9,10,11,12.
I detta arbete bedömdes framhjärnans roll för att reglera mönstret för genuttryck i FEZ genom att transplantera den ventrala framhjärnan ömsesidigt bland vaktel-, ank- och kycklingembryon, eftersom en signal från framhjärnan krävs för att inducera Sonic hedgehog-uttryck i FEZ. Forebraintransplantationer är inte unika inom området. Dessa transplantationer användes för att bedöma utvecklingen av motilitet i vaktel- och ankaembryon13, även om vävnader som bidrog till icke-neurala derivat också transplanterades i dessa experiment. I andra arbeten har hörselkretsar hos fåglar bedömts genom framhjärntransplantation14, men dessa transplantationer innehöll presumtiva neurala vapenceller, som bidrar till ansiktsform 9,10 och deltar i regleringen av SHH-uttryck i FEZ 15. Därför utformades ett system för att transplantera bara den ventrala framhjärnan från en fågelart till en annan före stängning av neuralröret för att bedöma hjärnans roll i ansiktsform16 (figur 1A, B). Denna metod saknade kontaminering av neuralkammen i transplantatet. I den här artikeln illustreras metoden och de förväntade resultaten beskrivs och de utmaningar som står inför diskuteras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>TEK</td>
			<td>TEKZR114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35x10 mm Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>553-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipets</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating avian forebrain chimeras to assess facial development

Fågelembryot har använts som modellsystem i mer än ett sekel och har lett till grundläggande förståelse för ryggradsdjurens utveckling. En av styrkorna med detta modellsystem är att effekten av, och interaktionen bland, vävnader kan bedömas direkt i chimära embryon. Vi har tidigare visat att signaler från framhjärnan bidrar till ansiktsmorfogenes genom att reglera formen på expressionsdomänen hos Sonic hedgehog (SHH) i Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). I denna artikel beskrivs metoden för att generera framhjärnans chimärer och ge illustrationer av resultaten av dessa experiment.

Bedömning av chimärism och transplantationskontaminering För att bedöma chimärerna bör omfattningen av chimärism och kontaminering av transplantatet med andra celltyper behandlas. Att skapa chimärer genom att transplantera vaktelvävnader i kycklingembryon möjliggör denna typ av analys. Med hjälp av QCPN-antikroppen kan vaktelceller visualiseras och särskiljas från värdvävnaderna (figur 1 C, D). I detta fall färgades endast vävnader som h...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development at JoVE.com

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Denna artikel beskriver en vävnadstransplantationsteknik som utformades för att testa signalerings- och mönstringsegenskaperna hos basal framhjärna under kraniofacial utveckling.

Skapa aviära framhjärnschhimärer för att bedöma ansiktsutveckling

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

Denna metod gör det möjligt för utredare att bedöma vävnadsinteraktioner mellan den basala framhjärnan och ansiktet. Den största fördelen med denna teknik är att den isolerar den basala framhjärnan för bedömning och förhindrar kontaminering med neurala vapenceller, vilket skulle förvirra analysen. Den svåra delen av denna teknik är avlägsnandet av framhjärnan från värden och ersättning med givarvävnaden.Diane Hu, forskare från Dr.Ralph Marcucios laboratorium, demonstrerar förfarandet. För att börja, förbered DMEM-media med neutralrött, en glasöverföringspipett och vässad volfram. Använd en 10 ml spruta och en 18 gauge nål, ta bort 0,5 ml albumin från den spetsiga änden av äggskalet.Gör ett litet hål ovanpå skalet med saxspetsen. Lägg sedan en bit tejp över hålet och skär en cirkulär öppning för att exponera embryot. Färga embryot med neutralt rött.Skörda vävnadstransplantat från vänster sida av den basala framhjärnan i steg sju eller åtta embryon. Använd böjda vässade volframnålar för att försiktigt skära en bit av framhjärnan. För att inte inkludera den underliggande endodermen, skjut nålen under framhjärnan och parallellt med neuralrörets axel.Plocka upp transplantatet från donatorembryot med hjälp av glasöverföringspipetten och överför det till DMEM som innehåller neutralrött i två minuter för att färga det. Placera sedan det färgade transplantatet i DMEM som inte innehåller neutralrött förrän det är klart för engraftment. Inkubera befruktade ägg från vit leghornkyckling vid 37 grader Celsius i en fuktad kammare tills Hamburger-Hamilton steg sju till åtta.Exponera embryon som tidigare visats. Använd vässade volframnålar, förbered transplantatstället genom att klippa och sedan ta bort en 0,3 x 0,2 millimeter bit basal framhjärna för att rymma transplantatet. Undvik överdriven störning av den underliggande endodermen, vilket kommer att vara uppenbart eftersom äggula granuler börjar läcka genom någon tår som görs.Efter överföring av transplantatet till värden, placera transplantatet för att ersätta värdens utrotade basala framhjärna. Placera tejpen tätt över hålet och återför embryon till 37 grader Celsius-inkubatorn tills de är redo för analys. Ursprungligen skapades chimärer genom att transplantera vaktelvävnader i kycklingembryon.Med hjälp av QCPN-antikroppen visualiserades vaktelceller och särskiljdes från värdvävnaderna. Vaktel-kycklingsystemet bekräftade att allt transplantat endast bestod av nervvävnad och inte var förorenat med andra celltyper. Transplantation av vaktelvävnad i ankembryon ledde till allvarligt deformerade chimärer på grund av en snabbare utvecklande vaktelhjärna.Därför utfördes transplantation av ankavävnader i kycklingembryon. De resulterande anka-chick chimärerna föreslår att hjärnan deltar i regleringen av morfologin. Hela berget C2 hybridisering användes för att bedöma Sonic igelkott uttryck i chimärer.I likhet med morfologin verkade Sonic hedgehog uttryck på anksidan av chimären mer ankaliknande. Att förbereda värdplatsen kräver övning. Ett stort antal embryon överlever inte, så att skapa ett stort antal chimärer kan bidra till att säkerställa korrekta prover för analys.Denna metod gjorde det möjligt att bedöma hur signaler från hjärnan formar Sonic hedgehog expression-domänen i den frontonasala ektodermala zonen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimerad<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Odling av kycklingembryon till avancerade stadier av utveckling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development

Immunofärgning att Visualisera Murin enteriska nervsystemet Utveckling

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Använda ljus Sheet fluorescensmikroskopi till bild Zebrafish Eye utveckling

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av standardiserade och reproducerbara framhjärnan-typ Cerebral Organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metod att studera utvecklingen av embryonala kyckling vävnader

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroskop-baserat System för i Vivo Implantation av embryonala hjärtmuskelcellerna i aviär embryot

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkt och enkel metod för att bedöma Drosophila melanogasterlönsamhet från embryo till vuxen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmonterad in situ-hybridisering i Zebrafish Embryon och Tube Formation Assay i iPSC-ECs att studera rollen av Endoglin i vaskulär utveckling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...