冷冻软X射线断层扫描可以在细胞水平上提供定量有价值的信息，可以作为独立使用或与其他成像技术结合使用。处于冷冻水合状态的传感器图像，需要染色或切片。此外，这是一种高通量技术，因为每个断层扫描仅在几分钟内即可收集。
软X射线冷冻断层扫描为在单细胞水平上跟踪受感染或有缺陷的细胞的细胞恢复过程提供了一个完美的平台。该技术可以报告新的抗病毒药物或基因疗法的疗效，以恢复编辑表型的感染。要将样品装入透射X射线显微镜，请用液氮冷却转印室，直到其达到低于100开尔文。
用额外的液氮填充工作站，然后打开工作站边缘的加热器。当工作站边缘停止沸腾时，在低温条件下将包含网格的冷冻盒放入工作站中的适当位置，并将网格加载到先前冷却的样品架上。将支架装载到穿梭车上，并用盖子保护它们。
将穿梭车以低于100开尔文的开尔文值加载到转移室中，并将腔室泵入低真空。将转印室连接到显微镜上，并按照屏幕上的真空程序将转印室穿梭车加载到显微镜中。一旦穿梭车与样品一起进入显微镜，使用显微镜机器人手臂将一个样品架转移到样品台。
对于在线可见光显微镜对网格进行明场成像，请选择可见光显微镜相机并打开可见光显微镜LED光源进行明场成像。单击运动、控制、采样和样本θ将样本旋转至零下60度，使其面向可见光显微镜物镜，然后选择运动控制和采样并更改样本X和样本Y，将样本移动到预期的居中位置。选择显微镜、采集、采集设置、采集模式、连续和开始，然后单击运动控制和样品以选择样品Z，以较小的步长细化焦点，直至五微米，直到细胞和/或碳支撑膜的孔聚焦。
然后选择显微镜、采集、采集设置、采集模式、马赛克和开始，以使用镶嵌的默认值在明场模式下开始采集格网的完整镶嵌贴图。对于荧光模式马赛克成像，关闭可见光显微镜LED光源进行明场成像，并在设置上手动选择对应于所需激发波长的LED光源和相应的光学滤光片。选择显微镜、采集、采集设置、采集模式、连续和开始，然后单击运动控制和采样以选择样品Z以细化荧光图像上的焦点。
然后，单击显微镜、采集、采集设置、采集模式、马赛克和开始，获取保留明场镶嵌中位置 X 和 Y 参数的镶嵌贴图。然后，关闭 LED 光源。对于 X 射线马赛克采集，将出口狭缝更改为 5 微米，并在 MISTRAL 处使用一秒钟的曝光。
选择显微镜、采集、采集设置、相机设置和分档，以使用样品Z平移调整焦点。选择运动控制和样品以选择样品Z.从5微米的步长开始，将焦点细化到0.5微米的步长，直到电池或碳箔孔均匀聚焦。要获取网格方块的镶嵌贴图，请单击显微镜、采集、采集设置、采集模式、马赛克和开始。
获取地图后，单击运动控制和采样，然后更改样本 X 和样本 Y 以将样本移动到平坦场位置。在 MISTRAL 处将曝光时间设置为一秒。然后，通过平场图像对采集到的马赛克进行归一化，以获得传输并保存归一化马赛克。
要将旋转轴上的样本与零度的旋转对齐，请选择“运动控制”和“采样”，然后更改样本 X、样本 Y 和样本 Z，以专注于要放置在旋转轴上的像元的特征。要将样本旋转到正θ位置，请选择“运动控制”和“采样”，然后将样本θ更改为正θ。使用线条工具在要置于旋转轴上的单元格要素上绘制一条线。
要将样本旋转到负θ位置，请选择“运动控制”和“采样”，然后将样本θ更改为负θ。使用线条工具在要置于旋转轴上的单元格要素上绘制一条线。在正或负θ位置时，使用样本 Z 平移将所选要素移动到两条线之间的中心位置，并重复样本旋转，直到获得最小线间距离。
当样本θ等于零时，将样本X移动两倍于将所选要素置于视场中心所需的距离，并移动区域板X以使要素回到视场中心。要相对于新的旋转轴重新优化区域板 Z 位置，请选择显微镜、采集、采集设置、采集模式和焦点系列，然后单击开始以记录区域板 Z 焦点系列。然后，单击“运动控制”和“区域板”并选择区域板 Z，将区域板 Z 移动到样品聚焦的位置。
要获取断层扫描，请单击运动控制和采样，然后选择样本θ以将负最大角度移动到加 0.1。单击显微镜、采集、采集设置、采集模式和断层扫描，将图像数量设置为总角度数，同时考虑到角度为零处的图像和角度范围，并设置图像数量。选择角度开始和角度结束，单击显微镜，采集，采集设置，相机设置，然后设置曝光时间。
单击“开始”开始采集层析成像倾斜系列。理想的样品应该在嵌入薄冰层的方形网格的中心具有单个细胞，并被分散良好的金基准标记物包围。许多不同的细胞器，如线粒体，内质网，液泡和细胞核应该能够在最终重建的断层扫描中区分，这要归功于线性吸收系数的定量重建。
在该图像中，可以观察到具有较高细胞密度的正方形。在这个例子中，印迹效率较低，导致冰层更厚，有裂缝。尽管在这种制备中可以识别出一些较大的结构，但由于厚冰的玻璃化质量差，噪声和颗粒状纹理中丢失了精细的细节。
冷冻保存的样品应最低限度地处理，因为大多数伪影都是在此阶段的样品中诱导的。通常，相关的冷冻可见光显微镜检查，您使用冷冻底物断层扫描之前。此外，光谱显微镜可以在相关化学元素上进行。
该协议通过在样品和分辨率状态下操作来填补利基市场，而任何其他直接成像技术都不容易获得这些技术，允许少量微米和30纳米半间距分辨率。
