Name: a 3d cartographic description of the cell by cryo soft x-ray tomography
Uploaded: 2021-03-15T14:00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography at JoVE.com

Este projeto recebeu financiamento do projeto iNEXT-Discovery da Comissão Europeia Horizon 2020 e do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 75439.

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A study of cholesterol crystal early formation in cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).</li><li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway.">Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182, 1-16 (2020).</li><li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+quinoline+antimalarial+drugs+in+red+blood+cells+infected+by+Plasmodium+falciparum+revealed+in+vivo.">Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo.</a> PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).</li><li>Conesa, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanoparticles+mass+quantification+by+near-edge+absorption+soft+X-ray+nanotomography.">Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography.</a> Scientific Reports. 6, 22354 (2016).</li><li>Ot&#243;n, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. 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Os autores não declaram conflito de interesses.

A preparação da amostra é um passo crítico para obter tomogramas de raios-X macios de alta qualidade, pois sua qualidade depende diretamente da qualidade da vitrificação da amostra e da espessura da camada de gelo em que a célula está incorporada. Projeções com alta relação sinal-ruído serão coletadas em regiões com fina camada de gelo, permitindo minimizar a dose de radiação necessária para alcançar a maior resolução possível. Além disso, a confluência celular também afetará a qualidade final do tomograma, uma vez que deve-se evitar ter células vizinhas entrando no FoV após a rotação. Finalmente, a dispersão correta dos marcadores fiduciais Au determinará a precisão do alinhamento da projeção e, em última instância, determinará a qualidade do volume reconstruído 3D final. Observe que uma disseminação adequada de fiduciais Au na rede permite a automatização da etapa de alinhamento de projeção, sem a qual é necessário um alto conhecimento para um passo tão crítico.
O protocolo aqui apenas retrata uma possível estratégia de preparação de amostras, que tem semelhanças com as utilizadas na tomografia crio-elétron (crio-ET). Em ambos os casos, protocolos que melhorem a exigente preparação amostral para uma melhor reprodutibilidade serão fundamentais para o sucesso dessas técnicas, e esforços estão sendo feitos para esse objetivo29. Vale ressaltar que, além de imagens de células isoladas, seções de tecido também podem ser visualizadas, desde que o sinal de transmissão através da seção seja suficiente em ângulos de inclinação alta. Normalmente, isso implicará seções de poucos mícrons (abaixo de 10 μm).
Para imaginar uma estrutura ou evento específico dentro de uma célula, é preciso ter certeza de que esse recurso em particular está dentro do FoV da série de inclinação. Como o FoV no crio-SXT é limitado a 10 x 10 μm2 a 15 x 15 μm2, dependendo da lente e contabilizando um pixel superdimensionado da resolução para pelo menos um fator de 2, muitas vezes é menor do que a extensão completa da célula (veja os quadrados vermelhos indicados na Figura 5). Portanto, o ROI deve ser encontrado e devidamente rotulado. Isso geralmente é feito por meio de tags fluorescentes e abordagens correlativas de luz visível. Estratégias 2D que combinam epifluorescência são simples, pois o microscópio de transmissão de raios-X macio tem um microscópio integrado de fluorescência de luz visível on-line, mas outras abordagens para sinal de fluorescência 2D ou 3D de alta resolução também estão disponíveis 4,12,13,15,16 . Nesses casos, a grade precisa ser imagens primeiro em instrumentos específicos, como microscópios de super resolução. Note-se que as abordagens correlativas mais eficientes são aquelas que envolvem a coleta de dados em condições criogênicas. Isso porque o lapso de tempo entre a temperatura ambiente (TR), a imagem de fluorescência da luz visível e a vitrificação da amostra, por exemplo, dificultarão a captura do evento celular certo a tempo; além disso, o procedimento de vitrificação pode desacopalar a célula de interesse que foi imaged em RT da grade. Mesmo que a maioria das abordagens de imagem correlativa possa implicar que as redes de amostragem devem ser manipuladas e transportadas de um instrumento para o outro, e apesar do risco aumentado de contaminação da rede ou dano que isso representa, a recompensa é clara: ser capaz de identificar eventos ou moléculas específicas dentro da paisagem celular.
Quando a imagem celular inteira é necessária, a costura de diferentes tomogramas é possível, desde que a dose total aplicada não exceda o limite de dano à radiação. Normalmente, a dose depositada para coletar poucos tomogramas na mesma célula está bem abaixo do limite na resolução alcançável (109 Gy) e, portanto, nenhuma estratégia específica é necessária para diminuir a dose, embora esta seja dependente de amostra e experimento. No caso da coleta intensiva de dados, como a espectro-tomografia, a minimização da dose seria de fato necessária e seria necessária a coleta de dados conveniente e estratégias específicas de processamento.
O Crio-SXT tem várias limitações, que devem ser mencionadas aqui. A primeira é a conhecida cunha ausente, que é intrínseca ao uso de suportes de amostra plana. Suportes de amostra capilar que permitem rotação de 180 graus foram usados no passado e ainda são usados em algumas instalações, mas também apresentam desvantagens, como um contraste empobrecido devido à absorção de vidro e à restrição do uso de células em suspensão. Uma maneira de diminuir o efeito da cunha faltante é realizando tomografia dupla inclinação. Isso é realmente possível na linha de feixe Mistral hoje em dia. A segunda limitação é definida pela lente da placa da zona de Fresnel usada em tais microscópios. Esta lente define a resolução final alcançável e a profundidade de campo (DoF), ambas sendo fortemente relacionadas. Isso implica que o aumento da resolução diminuirá o DoF, enquanto a espessura da célula será muitas vezes maior. Por exemplo, uma lente de 40 nm terá, em teoria, um DoF de 3 μm e uma resolução de 24,4 nm meio campo. O compromisso entre resolução e DoF é, portanto, estratégico e a escolha da lente dependerá do tipo da célula30,31. Finalmente, os TXMs operacionais em todo o mundo estão longe de serem microscópios ideais e esforços estão sendo feitos para melhorar os sistemas ópticos para alcançar as expectativas teóricas. Por fim, a visualização e segmentação dos volumes reconstruídos pode ser realizada com ferramentas específicas de software 25,32,33,34.
Em resumo, o crio-SXT permite que as células de imagem quantitativamente em resolução média (25-30 nm meio pitch) e em números estatísticos (poucas dezenas de tomogramas por dia). Isso permite a obtenção da organização, distribuição e dimensão das organelas em condições específicas, por exemplo, durante a infecção por patógenos ou doenças, em momentos precisos ou após tratamentos específicos. É, portanto, uma técnica de imagem biológica complementar útil para as microscopias de elétrons e luz visível mais comuns, cada uma delas abordando uma gama específica de dimensões e resolução da amostra. O Crio-SXT é frequentemente usado em abordagens correlativas envolvendo fluorescência de luz visível, mas outras estratégias correlativas crio-s também são possíveis.

O Crio-SXT pode desempenhar um papel central na pesquisa de imagem biológica, pois fornece volumes de resolução média 3D (25-30 nm meio pitch) de células inteiras hidratadas 1,2,3,4,5,6. Na faixa de energia da janela de água, entre o carbono e as bordas K de absorção de oxigênio (4,4-2,3 nm), estruturas celulares ricas em carbono absorvem 10 vezes mais do que o meio rico em oxigênio que as permeia e as cerca. Nesta faixa de energia, células vitrificadas de até 10 μm de espessura podem ser imagens sem a necessidade de secção ou coloração, levando a projeções quantitativas de contraste de alta absorção, que, combinadas com capacidades de rotação de amostras, permitem a reconstrução tomográfica da estrutura celular. O Crio-SXT preenche um nicho em termos de dimensões de espécimes e resolução espacial que não é facilmente acessível por qualquer outra técnica de imagem.
Resumindo, o contraste de absorção do crio-SXT é quantitativo, pois a atenuação dos fótons através do espécime de espessura obedece à lei Beer-Lambert da seguinte forma: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq01.jpg" style="margin:-.4em 0;">, onde eu0 representa a intensidade do incidente e μl o coeficiente de absorção linear, que depende do comprimento de onda λ e da parte imaginária β do índice de refração do espécime (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq02.jpg" style="margin:-.4em 0;"> ). A atenuação é uma função da composição bioquímica e da espessura das estruturas sendo imagens, com cada componente bioquímico tendo um coeficiente de absorção linear de raios-X específico μl (LAC). Isso significa que cada valor de voxel de tomografia depende dos elementos químicos e sua concentração naquele voxel7. Isso permite a discriminação natural de diferentes organelas, como núcleos, nucleoli, corpos lipídides ou mitocôndrias, ou diferentes estados de compactação de cromatina apenas com base em seus valores inerentes de LAC reconstruídos 2,8,9.
Além disso, crio-SXT é uma técnica de alto rendimento com tomogramas sendo coletados em poucos minutos. Isso permite especificamente imagens mesoescalas de populações celulares que podem ser capturadas em pontos-chave, como divisão, diferenciação e apoptose, mas também em diferentes estados de resposta, como aqueles induzidos pela exposição química a terapias medicamentosas específicas ou a infecções patogênicas. Os dados coletados nesses pontos-chave fornecerão descrição 3D do sistema com um registro fiel da organização espacial das diferentes organelas celulares nesses momentos específicos.
Geralmente, o crio-SXT é usado em combinação com outras técnicas que seguem abordagens correlativas que permitem localizar características específicas, eventos ou macromoléculas dentro do ambiente celular 3D 4,10,11,12,13,14,15,16 ou dados de fluorescência de raios-X rígidos 17,18 . Abordagens correlativas em condições criogênicas são de suma importância para obter a imagem mais completa e valiosa do sistema de interesse. Um resumo sucinta do fluxo de trabalho típico nas linhas crio-SXT Mistral (Alba) e B24 (Diamond) é esboçado na Figura 1.
Além disso, aproveitando a capacidade de ajuste do comprimento de onda nas instalações síncrotrons, informações espectroscópicas podem ser obtidas, além da estrutural utilizando a absorção diferencial específica de elementos específicos contidos na amostra. Um exemplo disso seria a localização do cálcio no estudo dos processos de biomineralização nas células 19,20,21. Ao tirar imagens 2D em diferentes energias fótons (espectro) ou tomogramas abaixo e na borda de absorção de raios-X de interesse, os pixels ou voxels contendo o elemento selecionado podem ser identificados. O espectro também permite diferenciar estados químicos (ou seja, a evolução do cálcio amorfo para hidroxiapatita como no exemplo anterior de biomineralização20). A quantificação de diferentes elementos é possível em 2D e 3D. A imagem espectroscópica de células vitrificadas é tipicamente feita na janela da água, mas também é possível em outras faixas de energia se o teor de água for baixo o suficiente ou se outros protocolos de preparação de amostras, incluindo a desidratação, forem usados22. Um protocolo detalhado de espectroscopia passo a passo está além do foco do protocolo aqui.
No que se segue, o protocolo se concentra em resumir brevemente as principais etapas de preparação da amostra, embora cada sistema possa precisar de refinamento individual, seguido de um procedimento detalhado de coleta de dados passo a passo para a tomografia de raios-X suaves crio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Software for segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Au Holey Carbon Films&#160; finder grids</td>
			<td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td>
			<td>&#160;R 2/2 Au G200F1</td>
			<td>Au Holey Carbon Films finder grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Au nanoparticles</td>
			<td>&#160;BBI Group, Cardiff, UK</td>
			<td>Au nanoparticles 100nm</td>
			<td>100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Au nanoparticles</td>
			<td>&#160;BBI Group, Cardiff, UK</td>
			<td>Au nanoparticles 250nm</td>
			<td>250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope A1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>430035 9060</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting No.1 filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td>Blotting filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chimera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for segmentation (Pettersen et al. 2004)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-EM Glow Discharge Set</td>
			<td>PELCO easiGlow</td>
			<td>91000S</td>
			<td>Glow Discharge Cleaning System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu Holey Carbon Films&#160; finder grids</td>
			<td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td>
			<td>&#160;R 2/2Cu G200F1</td>
			<td>Cu Holey Carbon Films finder grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for image processing and analysis in Java (NIH &#38; LOCI University of Wisconsin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM GP Grid Plunger</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706401</td>
			<td>Automatic Plunge Freezer EM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LINKAM cryo-stage</td>
			<td>Linkam Scientific Instruments</td>
			<td>CMS 196</td>
			<td>Cryo-Correlative Microscopy Stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for segmentation (Belevich et al. 2016)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6106</td>
			<td>Treated for cell culture and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P60 Petri dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8054</td>
			<td>Treated for cell culture and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td>Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV</td>
			<td>Xradia</td>
			<td>NCT-SB</td>
			<td>Transmission soft X-Ray microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVOS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for segmentation&#160; (Luengo et al. 2017)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tomo3d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TomoJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM Data Explorer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>TXM software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d cartographic description of the cell by cryo soft x-ray tomography

As técnicas de imagem são fundamentais para compreender a organização celular e o maquinário em pesquisas biológicas e nos campos relacionados. Entre essas técnicas, a tomografia criogênica de raios-X (SXT) permite a imagem de células inteiras conservadas por crio-preservados na faixa de energia de raios-X da janela de água (284-543 eV), na qual as estruturas de carbono têm absorção intrinsecamente maior do que a água, permitindo a reconstrução 3D do coeficiente de absorção linear do material contido em cada voxel. Informações estruturais quantitativas ao nível de células inteiras de até 10 μm de espessura são então alcançáveis desta forma, com alto rendimento e resolução espacial até 25-30 nm de meio-campo. A Crio-SXT tem se mostrado relevante para a pesquisa biomédica atual, fornecendo informações 3D sobre processos de infecção celular (vírus, bactérias ou parasitas), alterações morfológicas devido a doenças (como doenças genéticas recessivas) e nos ajudando a entender a ação medicamentosa no nível celular, ou localizando estruturas específicas no ambiente celular 3D. Além disso, aproveitando o comprimento de onda instável em instalações síncrotrons, espectro-microscopia ou sua contraparte 3D, espectro-tomografia, também pode ser usado para imagem e quantificação de elementos específicos na célula, como cálcio em processos de biomineralização. O Crio-SXT fornece informações complementares a outras técnicas biológicas de imagem, como microscopia eletrônica, fluorescência de raios-X ou fluorescência de luz visível, e é geralmente usado como um método parceiro para imagens correlativas 2D ou 3D em condições criogênicas, a fim de vincular função, localização e morfologia.

Preparar amostras para crio-SXT pode ser um desafio. Mesmo dentro da mesma grade amostral, é possível ter áreas ideais, e áreas que não são ideais, como pode ser visto na Figura 5, que mostra dois quadrados da mesma grade de localizador de Au. A amostra ideal deve ter células únicas no centro de uma malha quadrada, embutidas em uma fina camada de gelo e cercadas por marcadores fiduciais Au bem dispersos usados para o alinhamento de projeções de inclinação antes da reconstrução da tomografia. A Figura 5A mostra uma célula semelhante a fibroblasto (NIH 3T3) que cumpre muitos desses critérios. Uma única fatia de uma reconstrução 3D usando ART27 da área marcada com a caixa vermelha indicando o campo de visão (FoV) é mostrada na Figura 5B. Muitas organelas diferentes como mitocôndrias (M), ânticulo endoplasmático (ER), vesículas (V) e núcleo (N) podem ser distinguidas graças à reconstrução quantitativa dos LACs. Além disso, a relação sinal-ruído da reconstrução é muito alta, permitindo alcançar alto contraste das características celulares. Por outro lado, a Figura 5C mostra um quadrado com maior densidade celular. Por causa disso, a mancha geralmente é menos eficiente, levando a uma camada de gelo mais espessa, ou mesmo problemas de vitrificação. Em alguns casos, isso já pode ser observado ao triagem da rede usando mapeamento de epifluorescência antes da imagem de raio-X, e essas grades devem ser evitadas a qualquer custo. Na Figura 5C, uma rachadura dentro da grade e o gelo vitrificado podem ser observados passando por todo o quadrado de malha (marcado pelas setas vermelhas). Qualquer imagem próxima a rachaduras deve ser evitada devido à provável instabilidade da rede quando exposta ao feixe. Além disso, rachaduras podem ser um sinal de gelo espesso, como foi o caso nesta área. Uma série de inclinação foi registrada na área marcada com a caixa vermelha. Na Figura 5D, uma única fatia da reconstrução 3D correspondente é mostrada. Embora algumas estruturas maiores possam ser reconhecidas, detalhes finos são perdidos dentro do ruído e textura granulada devido à má qualidade de vitrificação do gelo espesso, como pode ser visto especificamente, por exemplo, nas mitocôndrias superiores apontadas pela seta.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho. Fluxo de trabalho esquemático seguido antes da coleta de dados crio-SXT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig02.jpg"> Figura 2: Cultivando células em grades. (A) Células crescendo em uma placa P100 Petri com uma confluência em torno de 80%-90%. (B) Placa de Petri P60 com várias grades após semeadura das células. (C) Células crescendo em cima de uma grade após 24 horas. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig03.jpg"> Figura 3: Carregar grades nos porta-amostras e na câmara de transferência. (A) Estação de trabalho cheia de nitrogênio líquido com o transporte e as crioboxes prontas para carregar as grades. (B) Porta-amostras inserido no carregador com a grade carregada. (C) Transportado com o suporte de amostra na posição 3 sem a tampa. (D) Estação de trabalho com a câmara de transferência anexada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig04.jpg"> Figura 4: Carregando amostras no TXM (A) Anexando a câmara de transferência ao TXM. (B) Navegá-lo dentro do TXM. (C) Braço robô TXM inserindo o suporte de amostra no estágio da amostra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig05.jpg"> Figura 5: Exemplo de tomogramas de raios-X macios criogênicos. Linha superior: amostra ideal, (A) vista de mosaico 2D de um quadrado de grade mostrando uma célula isolada no centro. (B) Uma fatia do volume 3D reconstruído mostrando a área marcada com a caixa vermelha (A). Em comparação com (D) a imagem é muito mais suave e mais detalhes são visíveis. Linha inferior: amostras não ideais, (C) visão de mosaico 2D de um quadrado de grade mostrando confluência celular muito alta e rachaduras no gelo e folha de grade (setas vermelhas). (D) Uma fatia do volume 3D reconstruído mostrando a área marcada com a caixa vermelha em (C). A vitrificação pobre ou subótimal pode ser identificada pela textura granulada da imagem. N: Núcleo; M: Mitocôndrias; ER: Órticulo endoplasmático; MV: Corpos multivesiculares; V: Vacuole; Barras de escala: A & C 20 μm; B & D 2 μm.V<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Aqui, é apresentado um protocolo descrevendo as etapas de preparação da amostra e coleta de dados necessárias na tomografia criobada de raios-X (SXT) para a imagem da ultraestrutura de células inteiras preservadas de crio-preservo em uma resolução de 25 nm meio passo.

Uma descrição cartográfica 3D da célula por crioma tomografia de raios-X suave

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

A tomografia de raios-X suaves crioques pode fornecer informações quantitativas valiosas valiosas no nível celular que podem ser usadas como uma conjunção autônoma ou com outras técnicas de imagem. Imagem do sensor em um estado hidratado congelado que são necessários para coloração ou secção. Além disso, é uma técnica de alta produtividade, porque cada tomograma é coletado em apenas alguns minutos.A crio-tomografia de raios-X macios oferece uma plataforma perfeita para acompanhar o processo de restauração celular em células infectadas ou defeituosas no nível de células únicas. Esta técnica pode relatar a eficácia de novos medicamentos antivirais ou terapia genética para reverter a infecção de fenótipos redigidos. Para carregar amostras no microscópio de raios-X de transmissão, esfrie a câmara de transferência com nitrogênio líquido até atingir menos de 100 Kelvin.Encha a estação de trabalho com nitrogênio líquido adicional e ligue o aquecedor da borda da estação de trabalho. Quando a borda da estação de trabalho parar de ferver, coloque a caixa criogena contendo grades nos locais apropriados na estação de trabalho em condições crio-ocistas e carregue as grades nos suportes de amostras previamente resfriados. Carregue os suportes na nave auxiliar e proteja-os com as tampas.Carregue a nave na câmara de transferência a menos de 100 Kelvin e bombeie a câmara até o vácuo. Conecte a câmara de transferência ao microscópio e siga o procedimento de vácuo na tela para carregar a nave auxiliar da câmara de transferência no microscópio. Uma vez que a nave está no microscópio com as amostras, use o braço robô microscópio para transferir um suporte de amostra para o estágio da amostra.Para imagens de campo brilhante da grade com o microscópio de luz visível on-line, selecione a câmera do microscópio de luz visível e ligue a fonte LED do microscópio de luz visível para imagens de campo brilhante. Clique em Movimento, Controle, Amostra e de amostra para girar a amostra a menos 60 graus para que ela enfrente o objetivo do microscópio de luz visível, e selecione Controle de Movimento e Amostra e Amostra e amostra X e amostra Y para mover a amostra para as posições centradas esperadas. Selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição, Controle contínuo e inicial e clique em Controle de Movimento e Amostra para selecionar a amostra Z para refinar o foco com passos menores até cinco mícrons até que as células e/ou os furos da película de suporte de carbono estejam em foco.Em seguida, selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição, Mosaico e Comece a iniciar a aquisição de um mapa de mosaico completo da grade no modo brightfield usando os valores padrão para o mosaico. Para imagens do mosaico do modo fluorescência, desligue a fonte LED do microscópio de luz visível para imagens de campo brilhante e selecione a fonte de luz LED correspondente ao comprimento de onda de excitação desejado e ao filtro óptico correspondente manualmente na configuração. Selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição, Contínuo e Iniciar e clique em Controle de Movimento e Amostra para selecionar a amostra Z para refinar o foco na imagem de fluorescência.Em seguida, clique em Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição, Mosaico e Start para adquirir um mapa de mosaico mantendo os parâmetros posicionais X e Y do mosaico brightfield. Em seguida, desligue a fonte de luz LED. Para aquisição de mosaico de raios-X, altere a fenda de saída para cinco mícrons e use uma exposição de um segundo no MISTRAL.Selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Configurações da Câmera e Binning para ajustar o foco usando a tradução Z da amostra. Selecione Controle de movimento e Amostra para selecionar a amostra Z.A partir de etapas de cinco mícrons, refine o foco até passos de 0,5 mícrons até que a célula ou os orifícios de folha de carbono estejam bem em foco. Para adquirir um mapa de mosaico do quadrado de malha, clique em Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modo de Aquisição, Mosaico e Start.Quando o mapa for adquirido, clique em Controle de Movimento e Amostra e altere a amostra X e prove Y para mover a amostra para uma posição de campo plano. Ajuste o tempo de exposição para um segundo no MISTRAL. Em seguida, normalize o mosaico adquirido pela imagem de campo plano para obter a transmissão e salvar o mosaico normalizado.Para alinhar a amostra no eixo de rotação com a rotação em zero graus, selecione Controle de Movimento e Amostra e altere a amostra X, amostra Y e amostra Z para focar na característica da célula para colocar no eixo de rotação. Para girar a amostra para uma posição positiva, selecione Controle de Movimento e Amostra e altere a da amostra para positiva. Use a ferramenta de linha para desenhar uma linha sobre o recurso da célula para colocar no eixo de rotação.Para girar a amostra para uma posição negativa, selecione Controle de Movimento e Amostra e altere a da amostra para negativa. Use a ferramenta de linha para desenhar uma linha sobre o recurso da célula para colocar no eixo de rotação. Enquanto estiver na posição positiva ou negativa, use a tradução Z da amostra para mover o recurso selecionado para a posição central entre ambas as linhas e repetir a rotação da amostra até que uma distância mínima linha-a-linha seja obtida.Quando a da amostra for igual a zero, mova a amostra X duas vezes a distância necessária para colocar o recurso selecionado no centro do campo de visão e mova a placa de zona X para trazer o recurso de volta ao centro do campo de visão. Para reotimizar a posição da placa de zona Z em relação ao novo eixo de rotação, selecione Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição e Série Focal e clique em Iniciar para gravar uma série focal de placa de zona Z. Em seguida, clique em Controle de Movimento e Placa de Zona e selecione a placa de zona Z para mover a placa de zona Z para a posição em que a amostra está em foco.Para adquirir um tomograma, clique em Controle de Movimento e Amostra e selecione Sample theta para mover o ângulo máximo negativo para mais 0,1. Clique em Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Modos de Aquisição e Tomografia para definir o número de imagens como o número total de ângulos, levando em conta a imagem no ângulo zero e na faixa angular, e definir o número de imagens. Selecione O ângulo start e o angle end, clique em Microscópio, Aquisição, Configurações de Aquisição, Configurações da câmera e defina o tempo de exposição.Clique em Iniciar a aquisição da série de inclinação de tomografia. A amostra ideal deve ter células únicas no centro de uma malha quadrada embutida em uma fina camada de gelo e cercada por marcadores fiduciais de ouro bem dispersos. Muitas organelas diferentes, como mitocôndrias, réticula endoplasmática, vacuoles e núcleo devem ser capazes de ser distinguidas no tomograma reconstruído final, graças à reconstrução quantitativa dos coeficientes de absorção linear.Nesta imagem, pode-se observar um quadrado com maior densidade celular. Neste exemplo, a mancha foi menos eficiente, levando a uma camada de gelo mais espessa com rachaduras. Embora algumas estruturas maiores possam ser reconhecidas nesta preparação, detalhes finos foram perdidos dentro do ruído e textura granulada devido à má qualidade de vitrificação do gelo espesso.A amostra preservada por crio deve ser minimamente manuseada, pois a maioria dos artefatos são induzidos quando as amostras nesta fase. Normalmente, fotomicroscopia de luz crio-visível correlativa, você usa uma tomografia anterior ao substrato criostrato. Além disso, a microscopia espectral pode ser feita em elementos químicos relevantes.Este protocolo preenche um nicho operando em um regime de espécime e resolução, que não são facilmente acessíveis por qualquer outra técnica de imagem direta, permitindo poucos mícrons e resolução de meio-campo de 30 nanômetros.

Research

JoVE Journal

Biology

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