Name: estimation of urinary nanocrystals in humans using calcium fluorophore labeling and nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-02-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Forfatterne takker alle deltagere i undersøgelsen og UAB CCTS Bionutrition Core og UAB High Resolution Imaging Service Center for deres bidrag. Dette arbejde blev støttet af NIH grants DK106284 og DK123542 (TM) og UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).

Alle eksperimenter, der er skitseret i dette arbejde, blev godkendt af University of Alabama i Birmingham (UAB) Institutional Review Board. Raske voksne (33,6 ± 3,3 år; n =10) blev indskrevet i undersøgelsen, hvis de havde et normalt blod omfattende metabolisk panel, ikke-tobaksbrugere, ikke-gravide, et BMI mellem 20-30 kg / m2, og fri for kroniske medicinske tilstande eller akutte sygdomme. Raske deltagere underskrev en skriftlig informeret samtykkeformular inden undersøgelsens start.
<p class="jove_t...

<ol>
	<li>Fogazzi, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalluria:+a+neglected+aspect+of+urinary+sediment+analysis.">Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).</li><li>Kuo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+calcium+and+volume+predict+coverage+of+renal+papilla+by+Randall's+plaque.">Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque.</a> Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).</li><li>Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+crystalluria+in+recurrent+renal-stone+formers.">Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers.</a> Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).</li><li>Robertson, W. G., Peacock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oxalate+crystalluria+and+inhibitors+of+crystallization+in+recurrent+renal+stone-formers.">Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers.</a> Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).</li><li>Hallson, P. C., Rose, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+urinary+test+for+stone+"activity".">A new urinary test for stone "activity".</a> British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).</li><li>Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystalluria+determination+and+the+risk+of+recurrence+in+calcium+stone+formers.">Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers.</a> Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).</li><li>Baumann, J. M., Affolter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+crystalluria+to+kidney+stones,+some+physicochemical+aspects+of+calcium+nephrolithiasis.">From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis.</a> World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).</li><li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxalate+induces+mitochondrial+dysfunction+and+disrupts+redox+homeostasis+in+a+human+monocyte+derived+cell+line.">Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line.</a> Redox Biology. 15, 207-215 (2018).</li><li>Khan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+renal+epithelial+cells+in+the+initiation+of+calcium+oxalate+stones.">Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones.</a> Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).</li><li>Mulay, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oxalate+crystals+induce+renal+inflammation+by+NLRP3-mediated+IL-1beta+secretion.">Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).</li><li>Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxalate+ions+and+calcium+oxalate+crystals+stimulate+MCP-1+expression+by+renal+epithelial+cells.">Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells.</a> Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).</li><li>Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxalate+stimulates+IL-6+production+in+HK-2+cells,+a+line+of+human+renal+proximal+tubular+epithelial+cells.">Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells.</a> Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).</li><li>Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+injury,+apoptosis+and+inflammation+are+involved+in+melamine-related+kidney+stone+formation.">Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation.</a> Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).</li><li>Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+Mitochondrial+Function+in+Calcium+Oxalate+Stone+Formers.">Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers.</a> Urology. 93, 221-226 (2016).</li><li>Balcke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+hyperoxaluria+after+ingestion+of+chocolate+as+a+high+risk+factor+for+calcium+oxalate+calculi.">Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi.</a> Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).</li><li>Khan, S. R., Kok, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulators+of+urinary+stone+formation.">Modulators of urinary stone formation.</a> Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).</li><li>Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+action+of+citrate+in+urolithiasis+explained+by+chemical+speciation:+increase+in+pH+is+the+determinant+factor.">Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).</li><li>Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+inorganic+kidney+stone+components+in+the+presence+of+acid-base+sensitive+complexing+agents.">Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents.</a> European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).</li><li>Frochot, V., Daudon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+value+of+crystalluria+and+quantitative+morphoconstitutional+analysis+of+urinary+calculi.">Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi.</a> International Journal of Surgery. 36, 624-632 (2016).</li><li>Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intracrystalline+and+surface-bound+proteins+on+the+attachment+of+calcium+oxalate+monohydrate+crystals+to+renal+cells+in+undiluted+human+urine.">The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine.</a> BJU International. 105, 708-715 (2010).</li><li>Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+aspects+of+spontaneous+crystalluria+studies+in+calcium+stone+formers.">Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers.</a> Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).</li><li>Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , 261-263 (2001).</li><li>Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalluria.">Crystalluria.</a> Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).</li><li>Fan, J., Chandhoke, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+crystalluria+in+freshly+voided+urines+of+recurrent+calcium+stone+formers+and+normal+individuals+using+a+new+filter+technique.">Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique.</a> Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).</li><li>Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-dependent+cellular+toxicity+on+renal+epithelial+cells+and+stone+risk+of+calcium+oxalate+dihydrate+crystals.">Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).</li><li>He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+particle+size+distribution,+aggregation,+and+crystal+phase+of+nanocrystallites+in+the+urine+of+healthy+persons+and+lithogenic+patients.">Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients.</a> IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Physicochemical+Properties+of+Nano-+and+Microsized+Crystals+in+the+Urine+of+Calcium+Oxalate+Stone+Patients+and+Control+Subjects.">Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects.</a> Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).</li><li>Gavin, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Methods+of+Determining+Urinary+Calculi+Composition:+Petrographic+Thin+Sectioning+of+Calculi+and+Nanoscale+Flow+Cytometry+Urinalysis.">Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis.</a> Scientific Reports. 6, 19328 (2016).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+Oxalate+Induces+Urinary+Nanocrystals+in+Humans.">Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans.</a> Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).</li><li>Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+nanoparticle+tracking+analysis+in+nanoparticle+research--A+mini-review.">Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review.</a> European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+of+circulating+cell-derived+vesicles+in+ovarian+cancer+patients.">Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients.</a> Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).</li><li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores.">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li><li>Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+myoplasmic+free+calcium+in+frog+skeletal+muscle+fibers+estimated+with+fluo-3.">Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3.</a> Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).</li><li>Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+in+the+detection+of+calcium-containing+microcrystals+in+synovial+fluid.">New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid.</a> Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).</li><li>Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+speed+alters+the+apparent+size+and+concentration+of+particles+measured+using+NanoSight+nanoparticle+tracking+analysis.">Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis.</a> Placenta. 38, 29-32 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).</li><li>Tomlinson, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+circulating+exosomes+in+Parkinson's+disease.">Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).</li></ol>

NTA er blevet brugt i denne undersøgelse til at vurdere nanokrystaller i human urin ved hjælp af en calciumbindingssonde, Fluo-4 AM. Der findes ingen standardmetode til påvisning af nanokrystaller i urinen. Nogle forskergrupper har opdaget nanokrystaller i urinen og påberåbt sig brugen af omfattende protokoller eller metoder, der er begrænset i deres evne til at kvantificere prøverne27,28. Denne undersøgelse viser en specifik og følsom metode til påvisn...

Urinkrystaller form, når urinen bliver overmættet med mineraler. Dette kan forekomme hos raske personer, men er mere almindeligt hos personer med nyresten1. Tilstedeværelsen og akkumuleringen af urinkrystaller kan øge ens risiko for at udvikle en nyresten. Specifikt sker dette, når krystaller binder sig til Randalls plak, kerne, akkumuleres og vokser over tid2,3,4. Crystalluria går forud for nyresten dannelse og vurdering af crystalluria kan have prædiktiv værdi i nyresten tidligere3,5. Konkret er krystalluria blevet foreslået at være nyttig til at forudsige risikoen for sten gentagelse hos patienter med en historie af calciumoxalat indeholdende sten6,7.
Krystaller er blevet rapporteret til negativ indvirkning nyre epitel og cirkulerende immuncellefunktion8,9,10,11,12,13. Det er tidligere blevet rapporteret, at cirkulerende monocytter fra calciumoxalat (CaOx) nyrestens tidligere har undertrykt cellulære bioenergetics sammenlignet med raske personer14. Derudover reducerer CaOx-krystaller cellulære bioenergetics og forstyrrer redox homeostase i monocytter8. Indtagelse af måltider rig på oxalat kan forårsage krystalluri, som kan føre til nyre tubule skader og ændre produktionen og funktionen af urin makromolekyler, der beskytter mod nyrestendannelse 15,16. Flere undersøgelser har vist, at urinkrystaller kan variere i form og størrelse afhængigt af pH og temperaturen i urinen17,18,19. Desuden har urinproteiner vist sig at modulere krystaladfærd20. Daudon et al.19, foreslog, at crystalluria analyse kunne være nyttige i forvaltningen af patienter med nyresten sygdom og i vurderingen af deres reaktion på behandlinger. Et par konventionelle metoder, der i øjeblikket er tilgængelige til at evaluere tilstedeværelsen af krystaller, omfatter polariseret mikroskopi21,22, elektronmikroskopi23, partikeltællere3, urinfiltrering24, fordampning3,5 eller centrifugering21. Disse undersøgelser har givet værdifuld indsigt i nyresten feltet om krystalluri. En begrænsning af disse metoder har imidlertid været den manglende evne til at visualisere og kvantificere krystaller under 1 μm i størrelse. Krystaller af denne størrelse kan påvirke væksten af CaOx sten ved at knytte til Randall's plak.
Nanokrystaller har vist sig at forårsage omfattende skade på nyreceller sammenlignet med større mikrokrystaller25. Tilstedeværelsen af nanokrystaller er blevet rapporteret i urinen ved hjælp af en nanopartikelanalysator26,27. Nylige undersøgelser har anvendt fluorescerende mærkede bisfosfatsonder (alendronat-fluorescein/alendronat-Cy5) til at undersøge nanokrystaller ved hjælp af nanoskala flow cytometry28. Begrænsningen af dette farvestof er, at det ikke er specifikt og vil binde sig til næsten alle typer sten undtagen cystein. En nøjagtig vurdering af tilstedeværelsen af nanokrystaller hos enkeltpersoner kan således være et effektivt redskab til at diagnosticere krystallutri og/eller forudsige stenrisiko. Formålet med denne undersøgelse var at påvise og kvantificere calciumholdige nanokrystaller (< 1 μm i størrelse) ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (NTA). For at opnå dette blev NTA-teknologi brugt i kombination med en calciumbinding fluorophore, Fluo-4 AM til at detektere og kvantificere calcium indeholdende nanokrystaller i urinen hos raske voksne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Jouan Centrifuge</td>
			<td>CR3-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Oxalate monohydrate</td>
			<td>Synthesized in the lab as previously described29.</td>
			<td> </td>
			<td>Store at RT; Stock 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>677418</td>
			<td>Store at RT; Stock 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td>Store at RT; Stock 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM*</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>20550</td>
			<td>Store at Freezer (-20&#176;C); Stock 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticles</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>742031</td>
			<td>Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight Instrument</td>
			<td>Malvern Instruments, UK</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>98-4730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon Disinfectant</td>
			<td>LanXESS Energizing Company, Germany</td>
			<td>LSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20&#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of urinary nanocrystals in humans using calcium fluorophore labeling and nanoparticle tracking analysis

Nyresten bliver mere udbredt på verdensplan hos voksne og børn. Den mest almindelige type nyresten består af calciumoxalat (CaOx) krystaller. Crystalluria opstår, når urinen bliver overmættet med mineraler (f.eks. calcium, oxalat, fosfat) og går forud for nyrestensdannelse. Standardmetoder til vurdering af krystallutri i stenformer omfatter mikroskopi, filtrering og centrifugering. Men disse metoder primært opdage mikrokrystaller og ikke nanokrystaller. Nanokrystaller er blevet foreslået at være mere skadelige for nyre epitelceller end mikrokrystaller in vitro. Her beskriver vi nanopartikelsporingsanalysens (NTA) evne til at detektere humane nanokrystaller i urinen. Raske voksne blev fodret med en kontrolleret oxalat kost før du drikker en oxalat belastning for at stimulere urin nanokrystaller. Urin blev indsamlet i 24 timer før og efter oxalatbelastningen. Prøverne blev behandlet og vasket med ethanol for at rense prøver. Urin nanokrystaller blev plettet med calcium bindende fluorophore, Fluo-4 AM. Efter farvning blev størrelsen og antallet af nanokrystaller bestemt ved hjælp af NTA. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at NTA effektivt kan detektere nanokrystallutri hos raske voksne. Disse fund tyder på, at NTA kan være en værdifuld metode til tidlig påvisning af nanokrystallutri hos patienter med nyrestenssygdom.

Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at NTA effektivt kan påvise gennemsnitsstørrelsen og koncentrationen af calciumholdige nanokrystaller i urinen hos mennesker. Dette blev opnået ved hjælp af fluorophore, Fluo-4 AM og nanopartikelsporingsanalyse. Fluo-4 AM var i stand til at binde sig til både CaOx og CaP krystaller. Som vist i figur 3Ablev CaOx-krystaller bestemt til at være mellem 50-270 nm i størrelse og har en gennemsnitlig koncentration på 1,26 x 109 partikle...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis

Formålet med denne undersøgelse var at afgøre, om nanopartikelsporingsanalyse (NTA) kunne påvise og kvantificere calciumholdige nanokrystaller i urinen fra raske voksne. Resultaterne fra den nuværende undersøgelse tyder på NTA kunne være et potentielt redskab til at estimere urin nanokrystaller under nyresten sygdom.

Vurdering af urin nanokrystaller hos mennesker ved hjælp af calcium fluorophor mærkning og nanopartikel tracking analyse

Kidney stones are becoming more prevalent worldwide in adults and children. The most common type of kidney stone is comprised of calcium oxalate (CaOx) ...

Denne protokol kan specifikt detektere calciumholdige nanokrystaller i urinen hos mennesker. Denne teknik kan potentielt være nyttig til at forudsige tidlige stadier af nyresten dannelse samt andre sygdomme forbundet med krystal urinstof. Demonstration af proceduren vil være Dr.Parveen Kumar, en forsker IV i mit laboratorium.Har deltagerne forbruge en lav-oxalat kost i tre dage og hurtigt natten over. Derefter indsamle en 24-timers urinprøve fra deltagerne, før de har dem forbruge en oxalat belastning. Foder deltagerne med en smoothie, der indeholder frugt og grøntsager med en oxalatbelastning på ca. otte millimol.Få deltagerne til at indsamle deres urin i 24 timer efter oxalatforbruget og returnere det den følgende dag. Alle urinprøver opbevares ved stuetemperatur inden forarbejdning. Måle og registrere urin pH og mængden af urinprøver.Bland grundigt og tilsæt 50 milliliter urin i et mærket sterilt 50 milliliter konisk rør. Prøven centrifugeres ved 1.200 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af en bænk-top centrifuge. Kassér supernatanten, vask og genbrug pellet igen med fem milliliter 100% ethanol.Prøven centrifugeres ved 1.200 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af en bænk-top centrifuge. Kassér supernatanten og genbrug pelleten i en milliliter 100% ethanol. Prøven opbevares ved minus 20 grader Celsius til senere behandling, eller fortsæt straks med farvning af prøverne.Fortynd 100 nanometer-størrelse guld nanopartikler i ultrapure vand i et forhold på 1:1, 000 og bruge dem til at optimere indstillingerne på instrumentet. Urinprøverne fortyndes 20 gange i vand, inden de farvning med fem millimolar Fluo-4 AM fortyndes i 30 minutter i mørke, og prøverne analyseres ved hjælp af NTA. Forbered calciumoxalat og calciumphosphatkrystaller som beskrevet i tekstmanuskriptet forud for NTA-analyse.Tænd computeren og instrumentet, åbn derefter softwaren, og tænd kameraet. Klik på hentningsikonet i øverste venstre hjørne af vinduet for at starte hentningstilstanden. Rengør platformen ved først at pumpe luft ind i den ved hjælp af en en milliliter sprøjte, indtil platformen ser ren ud.Tilsæt forsigtigt vand til apparatet to til tre gange, og brug en anden milliliter sprøjte til at fjerne eventuelle luftbobler. Når platformen er ren, tilsæt vand og kontroller for enhver forurening på overfladen ved at se kameraet, og tilsæt derefter guldnanopartikler som kontrol til prøvebelastningspumpeinjektoren for at konfigurere instrumentet. Juster kameraniveauet på skærmen eller på knappen til højre side af instrumentet, indtil billedet begynder at vise farvede pixel, og reducer derefter kameraniveauet.Juster derefter skærmen for at optimere billedet. Venstre klik på museknappen på videobilledet. Hold venstre museknap nede, og træk billedet op og ned for at få hele visningen.Opsæt infusionshastigheden, og fokuser kameraet, så guldnananopartiklerne er synlige på kameraskærmen. Indstil infusionshastigheden til høj for indledende opsætning for at sikre, at guldnananopartiklerne opdages. Når det er opdaget, reducere hastigheden til 50 mikroliter i minuttet for at visualisere guld nanopartikler.Juster kameraniveauet for at visualisere partiklerne. For ikke-indgroede prøver skal du justere skærmgevinsten på niveau fem for at opnå kamerafokus og indstille kameraniveauet til otte. Når fokus er indstillet, skal du optage eksemplet.Efter optimering rengøres apparatet igen med vand, før du vurderer andre prøver for at sikre, at slangen er ren, og at partikler ikke er til stede. For at analysere farvede prøver skal du justere kameraet til den filterposition, der indeholder det passende fluorescerende filter, og indlæse fortyndede og farvede prøver på prøveindlæsningspumpens injektor, hvilket reducerer hastigheden til 20 mikroliter pr. minut til analyse. Juster skærmforøgelsen til fem og kameraniveau til 13.Gem dataene efter hver måling. Det gennemsnitlige antal nanopartikler for alle fem aflæsninger for hver enkelt prøve beregnes, og dataene analyseres ved hjælp af middelværdiens standardafvigelse eller standardfejl. Brug T-test til parret analyse.Fluo-4 AM var i stand til at binde sig til både calciumoxalatkrystaller, som var mellem 50 og 270 nanometer i størrelse og havde en gennemsnitlig koncentration på 1.260 millioner partikler pr. milliliter og calciumphosphatkrystaller, som var mellem 30 og 225 nanometer og havde en gennemsnitlig koncentration på 2.220 millioner partikler pr. milliliter. 24-timers urinprøver indsamlet før oxalat belastning indeholdt nogle urin nanokrystaller mellem 110 til 300 nanometer i størrelse. I modsætning hertil var der en betydelig stigning i urin nanokrystaller til stede i post-oxalat prøver.For at bekræfte metodens reproducerbarhed blev prøverne målt tre gange, og der var ingen signifikant variation i tekniske replikater. Når du forsøger denne protokol, kan der være problemer med at tilføje prøver uden bobler til maskinen. For at forhindre dette tilsættes luft og vand til maskinen og derefter langsomt tilføje prøver.Sørg også for løbende at overvåge dine prøver, og at der ikke er nogen bobler til stede. Denne nye metode vil blive testet hos personer med calcium oxalat nyresten sygdom til at overvåge sygdomsprogression og / eller til at forudsige nyresten risiko.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle

Mærkning stamceller med Ferumoxytol, en FDA-godkendt jernoxid Nanopartikel

Stem cell based therapies offer significant potential for the field of regenerative medicine. However, much remains to be understood regarding the in vivo ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsåren infusioner farmakokinetisk og farmakodynamisk analyse af Taxaner i mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Induktion og vurdering af anstrengelses Skeletal Muscle Damage i mennesker

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

En model til simulere klinisk relevant Hypoxi i mennesker

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In vivo- sporing af edemaudvikling og mikrovaskulær patologi i en model af eksperimentel cerebral malaria ved anvendelse af magnetisk resonansbilleddannelse

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Comparing Bibliometric Analysis Using PubMed, Scopus, and Web of Science Databases

Sammenligning af Bibliometrisk analyse ved hjælp af PubMed, Scopus og Web of Science-databaser

Literature databases (i.e., PubMed, Scopus, and Web of Science) differ in terms of their coverage, focus, and the tool they provide. PubMed focuses mainly ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimering af Neron nummer i hele nyrerne ved hjælp af Acid maceration metode

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Høj gennemløbs analyse af optiske kortlægnings data ved hjælp af Elektromap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...