Name: estimation of urinary nanocrystals in humans using calcium fluorophore labeling and nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-02-09T15:00:00
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著者らは、すべての研究参加者とUAB CCTSバイオニュートリションコアとUAB高解像度イメージングサービスセンターの貢献に感謝しています。この研究は、NIH助成金DK106284とDK123542(TM)、UL1TR003096(国立トランスレーショナルサイエンス推進センター)によって支援されました。

この研究で概説されたすべての実験は、アラバマ大学バーミンガム校(UAB)制度審査委員会によって承認されました。健康な成人(33.6±3.3歳;n=10)は、正常な血液包括代謝パネル、非タバコユーザー、非妊娠者、20〜30kg/m2のBMI、および慢性病状または急性疾患がない場合、研究に登録された。健康な参加者は、研究開始前に書面によるインフォームド・コンセント・フォームに署名しまし?...

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).</li><li>Tomlinson, P. 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NTAは、カルシウム結合プローブFluo-4 AMを用いてヒト尿中のナノ結晶を評価するために本研究で使用されている。尿中のナノ結晶を検出するための標準的な方法はありません。いくつかの研究グループは尿中のナノ結晶を検出し、サンプル27、28を定量化する能力に制限されている広範なプロトコルまたは方法の使用に依存している。この研究は、高?...

尿結晶は、尿がミネラルで過飽和になると形成されます。これは健康な個体で起こり得るが、腎臓結石1を有する個人でより一般的である。尿結晶の存在と蓄積は、腎臓結石を発症するリスクを高めることができます。具体的には、これは、結晶がランドールのプラークに結合し、核を持ち、蓄積し、時間2、3、4の間に成長するときに起こる。結晶は、腎臓結石の形成と結晶の評価に先行して、腎臓結石形成体3,5に予測値を有する可能性がある。具体的には、結晶が石6,7を含むシュウ酸カルシウムの既往歴を有する患者において石の再発のリスクを予測するのに有用であることが示唆されている。
結晶は、腎上皮および循環免疫細胞機能8、9、10、11、12、13に悪影響を及ぼすと報告されている。シュウ酸カルシウム(CaOx)腎臓結石のフォーマーからの循環単球が、健康な個体14と比較して細胞バイオエネルギーを抑制していることが以前に報告されている。さらに、CaOx結晶は、細胞の生体エネルギーを減少させ、単球8におけるレドックス恒常性を破壊する。シュウ酸塩が豊富な食事の摂取は、腎尿細管損傷を引き起こし、腎臓結石形成に対して保護されている尿中高分子の産生および機能を変える可能性のある結晶尿素を引き起こす可能性がある15,16。いくつかの研究は尿の結晶が尿のpHおよび温度に応じて形および大きさを変えることができることを実証した17,18,19.また、尿タンパク質は結晶挙動20を調節することが示されている。Daudon et al.19は、結晶管内分析が腎臓結石疾患患者の管理および治療に対する応答の評価に役立つ可能性があることを提案した。結晶の存在を評価するために現在利用可能ないくつかの従来の方法は、偏光顕微鏡21、22、電子顕微鏡23、粒子カウンター3、尿濾過24、蒸発3、5または遠心分離21を含む。これらの研究は、結晶に関する腎臓結石分野に貴重な洞察を提供してきました。しかし、これらの方法の限界は、1μm未満の結晶のサイズを視覚化して定量できないことでした。このサイズの結晶は、ランドールのプラークに付着することにより、CaOx石の成長に影響を与える可能性があります。
ナノ結晶は、より大きな微結晶25と比較して腎細胞に広範な傷害を引き起こすことが示されている。ナノ結晶の存在は、ナノ粒子分析装置26,27を用いて尿中に報告されている。最近の研究では、蛍光標識ビスリン酸プローブ(アレンドロネート-フルオレセイン/アレンドロネート-Cy5)を用いてナノスケールフローサイトメトリー28を用いてナノ結晶を調べる。この染料の制限は、それが特異的ではなく、システインを除く石のほとんどすべてのタイプに結合することです。したがって、個人におけるナノ結晶の存在を正確に評価することは、結晶を診断したり、石のリスクを予測したりするのに有効なツールとなり得る。本研究の目的は、ナノ粒子追跡解析(NTA)を用いて、ナノ結晶を含むカルシウム(<1μmの大きさ)を検出し、定量化することであった。これを達成するために、NTA技術をカルシウム結合フルオロフォア、Fluo-4 AMと組み合わせて使用し、健康な成人の尿中のナノ結晶を含むカルシウムを検出し定量しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Jouan Centrifuge</td>
			<td>CR3-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Oxalate monohydrate</td>
			<td>Synthesized in the lab as previously described29.</td>
			<td> </td>
			<td>Store at RT; Stock 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>677418</td>
			<td>Store at RT; Stock 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td>Store at RT; Stock 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM*</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>20550</td>
			<td>Store at Freezer (-20&#176;C); Stock 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticles</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>742031</td>
			<td>Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight Instrument</td>
			<td>Malvern Instruments, UK</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>98-4730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon Disinfectant</td>
			<td>LanXESS Energizing Company, Germany</td>
			<td>LSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20&#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of urinary nanocrystals in humans using calcium fluorophore labeling and nanoparticle tracking analysis

腎臓結石は、大人と子供の世界的に一般的になってきています。最も一般的なタイプの腎臓結石は、シュウ酸カルシウム(CaOx)結晶で構成されています。結晶尿は、尿がミネラル(例えば、カルシウム、シュウ酸塩、リン酸塩)で過飽和になると発生し、腎臓結石形成の前に起こる。石のフォーマーの結晶を評価する標準的な方法には、顕微鏡、ろ過、遠心分離が含まれます。しかし、これらの方法は、主にナノ結晶ではなく微小結晶を検出する。ナノ結晶は、インビトロの微結晶よりも腎臓上皮細胞に有害であることが示唆されている。ここでは、ナノ粒子追跡解析(NTA)がヒトの尿中ナノ結晶を検出する能力について述べる。健康な成人は、尿中ナノ結晶を刺激するためにシュウ酸塩負荷を飲む前に、制御されたシュウ酸食を与えられた。尿はシュウ酸負荷の前後に24時間採取した。試料を処理し、エタノールで洗浄し、試料を精製した。尿中ナノ結晶をカルシウム結合蛍光色素で染色し、フルオ-4 AM.染色後、ナノ結晶のサイズと数はNTAを用いて決定した。この研究結果から、NTAは健康な成人のナノ結晶を効率的に検出できることを示している。これらの知見は、NTAが腎臓結石症患者におけるナノ結晶の貴重な早期発見方法である可能性を示唆している。

この研究結果から、NTAはヒト尿中の尿中のナノ結晶を含むカルシウムの平均サイズと濃度を効率的に検出できることを示している。これは、フルオロフォア、フルオ4 AM、ナノ粒子追跡解析を用いて達成した。Fluo-4 AMはCaOxとCaPの両方の結晶に結合することができた。図3Aに示すように、CaOx結晶は50〜270nmの大きさであり、平均濃度は1.26 x 109粒子/mLであると判断し?...

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Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis

本研究の目的は、ナノ粒子追跡解析(NTA)が健康な成人からのナノ結晶を含む尿中カルシウムを検出し、定量化できるかどうかを決定することであった。現在の研究結果は、NTAが腎臓結石疾患中の尿ナノ結晶を推定する潜在的なツールである可能性を示唆している。

カルシウム蛍光色素標識とナノ粒子追跡解析を用いたヒトの尿中ナノ結晶の推定

Kidney stones are becoming more prevalent worldwide in adults and children. The most common type of kidney stone is comprised of calcium oxalate (CaOx) ...

このプロトコルは、ヒト尿中のカルシウム含有ナノ結晶を特異的に検出することができる。この技術は、腎臓結石の形成の初期段階だけでなく、結晶尿素に関連する他の疾患を予測するのに役立つ可能性があります。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究者IVであるパルヴィーン・クマール博士です。参加者に3日間の低シュウ酸塩食餌食を摂取させ、一晩で速く食べさせる。その後、参加者から24時間尿サンプルを採取してから、シュウ酸塩負荷を摂取させます。約8ミリモルのシュウ酸塩負荷を有する果物や野菜を含むスムージーを参加者に与えます。参加者に24時間の尿を摂取させ、翌日に戻してもらいます。すべての尿サンプルは、処理前に室温で維持してください。尿のpHと尿サンプルの体積を測定し、記録します。十分に混合し、ラベル付けされた無菌50ミリリットル円錐形チューブに尿の50ミリリットルを追加します。ベンチトップ遠心分離機を用いて室温で10分間1、200倍Gで試料を遠心する。上清を捨て、100%エタノールの5ミリリットルでペレットを再び洗浄し、再中断します。ベンチトップ遠心分離機を用いて室温で10分間1、200倍Gで試料を遠心する。上清を捨て、100%エタノールの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。後で処理するためにマイナス20°Cでサンプルを保存するか、すぐにサンプルの染色を進めます。100ナノメートルサイズの金ナノ粒子を超純水に1:1,000の比で希釈し、機器の設定を最適化するために使用します。尿サンプルを水中で20回希釈してから、5ミリモルFluo-4 AMで暗い状態で30分間染色し、NTAを用いてサンプルを分析します。NTA分析の前に、テキスト原稿に記載されているように、シュウ酸カルシウムおよびリン酸カルシウム結晶を調製する。コンピュータと機器の電源を入れ、ソフトウェアを開いてカメラの電源を入れます。ウィンドウの左上隅にあるキャプチャ アイコンをクリックして、キャプチャ モードを開始します。プラットフォームがきれいに見えるまで、最初に1ミリリットルのシリンジを使用して空気を送り込み、プラットフォームをきれいにします。装置に水を2~3回静かに加え、もう1ミリリットルのシリンジを使用して気泡を取り除きます。プラットフォームがクリーンになったら、水を加えて、カメラを見て表面に汚染がないか確認し、サンプルローディングポンプインジェクタにコントロールとして金ナノ粒子を追加して機器をセットアップします。画像が色付きピクセルを表示し始めるまで、画面上またはノブのカメラレベルをインストゥルメントの右側に調整し、カメラレベルを下げます。次に、画面を調整して画像を最適化します。ビデオ画像上でマウスボタンを左クリックします。マウスの左ボタンを押したまま、画像を上下にドラッグして、ビュー全体を表示します。注入速度を設定し、カメラの画面に金ナノ粒子が表示されるようにカメラをフォーカスします。初期セットアップの場合は注入速度を高く設定し、金ナノ粒子が確実に検出されるようにします。検出されたら、金ナノ粒子を可視化するために、毎分50マイクロリットルに速度を下げます。カメラレベルを調整してパーティクルを視覚化します。染色されていないサンプルの場合は、レベル 5 で画面ゲインを調整してカメラのフォーカスを得て、カメラレベルを 8 に設定します。フォーカスが設定されたら、サンプルを記録します。最適化後、他のサンプルを評価する前に装置を再度水で洗浄し、チューブがきれいで粒子が存在しないことを確認します。染色されたサンプルを分析するには、適切な蛍光フィルターを含むフィルター位置にカメラを調整し、サンプルを希釈して染色したサンプルをサンプルローディングポンプインジェクタにロードし、分析のために1分あたり20マイクロリットルの速度に下げます。画面のゲインを 5 に、カメラ レベルを 13 に調整します。各測定後にデータを保存します。各サンプルの5つの測定値すべてについてナノ粒子の平均数を計算し、平均の標準偏差または標準偏差を使用してデータを分析します。ペア分析には T 検定を使用します。Fluo-4 AMは、50〜270ナノメートルの大きさで、1ミリリットル当たり1,2億6,000万粒子の平均濃度を有するシュウ酸カルシウム結晶と、30〜225ナノメートルの平均濃度を有するリン酸カルシウム結晶と、1ミリリットル当たり平均濃度2,2億2,000万粒子に結合することができました。シュウ酸塩負荷の前に採取された24時間尿サンプルには、110〜300ナノメートルの間のいくつかの尿ナノ結晶が含まれていました。これに対し、シュウ酸後のサンプルに存在する尿中ナノ結晶が有意に増加した。この方法の再現性を確認するために、サンプルを3回測定し、技術的複製に有意な変動はなかった。このプロトコルを試みると、気泡のないサンプルをマシンに追加するのが難しい場合があります。これを防ぐには、機械に空気と水を加え、サンプルをゆっくりと追加します。また、サンプルを継続的に監視し、気泡がないことを確認してください。この新しい方法は、病気の進行を監視し、腎臓結石のリスクを予測するために、シュウ酸カルシウム腎臓結石病の個人でテストされます。

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle

Ferumoxytol、FDA承認酸化鉄ナノ粒子で幹細胞のラベリング

Stem cell based therapies offer significant potential for the field of regenerative medicine. However, much remains to be understood regarding the in vivo ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

細胞追跡のためのin vivoでの19 F MRI における

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

マウスにおけるタキサンの薬物動態学的および薬力学的分析のための頸動脈煎茶

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

ヒトにおける労作骨格筋損傷の誘導および評価

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

モデルは、ヒトにおける臨床的に関連する低酸素症をシミュレートします

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Comparing Bibliometric Analysis Using PubMed, Scopus, and Web of Science Databases

PubMed、Scopus、および Web のサイエンス データベースを使用した書誌分析の比較

Literature databases (i.e., PubMed, Scopus, and Web of Science) differ in terms of their coverage, focus, and the tool they provide. PubMed focuses mainly ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

酸性揉捻法を用いた全腎ネフロン数の推定

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

エレクトロマップを用いた光マッピングデータのハイスループット解析

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...