Name: estimation of urinary nanocrystals in humans using calcium fluorophore labeling and nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-02-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Los autores agradecen a todos los participantes del estudio y al Núcleo de Bionutrición CCTS de la UAB y al Centro de Servicio de Imágenes de Alta Resolución de la UAB por sus contribuciones. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH DK106284 y DK123542 (TM), y UL1TR003096 (Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales).

Todos los experimentos descritos en este trabajo fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Alabama en Birmingham (UAB). Los adultos sanos (33,6 ± 3,3 años; n=10) fueron inscritos en el estudio si tenían un panel metabólico integral de sangre normal, no consumidores de tabaco, no embarazadas, un IMC entre 20-30 kg/m2,y libres de condiciones médicas crónicas o enfermedades agudas. Los participantes sanos firmaron un formulario de consentimiento informado por escrito ante...

<ol>
	<li>Fogazzi, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalluria:+a+neglected+aspect+of+urinary+sediment+analysis.">Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).</li><li>Kuo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+calcium+and+volume+predict+coverage+of+renal+papilla+by+Randall's+plaque.">Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque.</a> Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).</li><li>Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+crystalluria+in+recurrent+renal-stone+formers.">Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers.</a> Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).</li><li>Robertson, W. G., Peacock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oxalate+crystalluria+and+inhibitors+of+crystallization+in+recurrent+renal+stone-formers.">Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers.</a> Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).</li><li>Hallson, P. C., Rose, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+urinary+test+for+stone+"activity".">A new urinary test for stone "activity".</a> British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).</li><li>Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystalluria+determination+and+the+risk+of+recurrence+in+calcium+stone+formers.">Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers.</a> Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).</li><li>Baumann, J. M., Affolter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+crystalluria+to+kidney+stones,+some+physicochemical+aspects+of+calcium+nephrolithiasis.">From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis.</a> World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).</li><li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxalate+induces+mitochondrial+dysfunction+and+disrupts+redox+homeostasis+in+a+human+monocyte+derived+cell+line.">Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line.</a> Redox Biology. 15, 207-215 (2018).</li><li>Khan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+renal+epithelial+cells+in+the+initiation+of+calcium+oxalate+stones.">Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones.</a> Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).</li><li>Mulay, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oxalate+crystals+induce+renal+inflammation+by+NLRP3-mediated+IL-1beta+secretion.">Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).</li><li>Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxalate+ions+and+calcium+oxalate+crystals+stimulate+MCP-1+expression+by+renal+epithelial+cells.">Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells.</a> Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).</li><li>Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxalate+stimulates+IL-6+production+in+HK-2+cells,+a+line+of+human+renal+proximal+tubular+epithelial+cells.">Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells.</a> Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).</li><li>Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+tubular+epithelial+cell+injury,+apoptosis+and+inflammation+are+involved+in+melamine-related+kidney+stone+formation.">Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation.</a> Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).</li><li>Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+Mitochondrial+Function+in+Calcium+Oxalate+Stone+Formers.">Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers.</a> Urology. 93, 221-226 (2016).</li><li>Balcke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+hyperoxaluria+after+ingestion+of+chocolate+as+a+high+risk+factor+for+calcium+oxalate+calculi.">Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi.</a> Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).</li><li>Khan, S. R., Kok, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulators+of+urinary+stone+formation.">Modulators of urinary stone formation.</a> Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).</li><li>Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+action+of+citrate+in+urolithiasis+explained+by+chemical+speciation:+increase+in+pH+is+the+determinant+factor.">Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).</li><li>Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+inorganic+kidney+stone+components+in+the+presence+of+acid-base+sensitive+complexing+agents.">Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents.</a> European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).</li><li>Frochot, V., Daudon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+value+of+crystalluria+and+quantitative+morphoconstitutional+analysis+of+urinary+calculi.">Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi.</a> International Journal of Surgery. 36, 624-632 (2016).</li><li>Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+intracrystalline+and+surface-bound+proteins+on+the+attachment+of+calcium+oxalate+monohydrate+crystals+to+renal+cells+in+undiluted+human+urine.">The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine.</a> BJU International. 105, 708-715 (2010).</li><li>Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+aspects+of+spontaneous+crystalluria+studies+in+calcium+stone+formers.">Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers.</a> Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).</li><li>Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , 261-263 (2001).</li><li>Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalluria.">Crystalluria.</a> Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).</li><li>Fan, J., Chandhoke, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+crystalluria+in+freshly+voided+urines+of+recurrent+calcium+stone+formers+and+normal+individuals+using+a+new+filter+technique.">Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique.</a> Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).</li><li>Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-dependent+cellular+toxicity+on+renal+epithelial+cells+and+stone+risk+of+calcium+oxalate+dihydrate+crystals.">Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).</li><li>He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+particle+size+distribution,+aggregation,+and+crystal+phase+of+nanocrystallites+in+the+urine+of+healthy+persons+and+lithogenic+patients.">Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients.</a> IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Physicochemical+Properties+of+Nano-+and+Microsized+Crystals+in+the+Urine+of+Calcium+Oxalate+Stone+Patients+and+Control+Subjects.">Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects.</a> Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).</li><li>Gavin, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Methods+of+Determining+Urinary+Calculi+Composition:+Petrographic+Thin+Sectioning+of+Calculi+and+Nanoscale+Flow+Cytometry+Urinalysis.">Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis.</a> Scientific Reports. 6, 19328 (2016).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+Oxalate+Induces+Urinary+Nanocrystals+in+Humans.">Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans.</a> Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).</li><li>Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+nanoparticle+tracking+analysis+in+nanoparticle+research--A+mini-review.">Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review.</a> European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, 64-74 (2015).</li><li>Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+of+circulating+cell-derived+vesicles+in+ovarian+cancer+patients.">Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients.</a> Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).</li><li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores.">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li><li>Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+myoplasmic+free+calcium+in+frog+skeletal+muscle+fibers+estimated+with+fluo-3.">Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3.</a> Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).</li><li>Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+in+the+detection+of+calcium-containing+microcrystals+in+synovial+fluid.">New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid.</a> Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).</li><li>Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+speed+alters+the+apparent+size+and+concentration+of+particles+measured+using+NanoSight+nanoparticle+tracking+analysis.">Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis.</a> Placenta. 38, 29-32 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).</li><li>Tomlinson, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+circulating+exosomes+in+Parkinson's+disease.">Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).</li></ol>

NTA se ha utilizado en el actual estudio para evaluar nanocrystals en orina humana usando una punta de prueba obligatoria del calcio, Fluo-4 AM. No hay un método estándar disponible para detectar nanocristales en la orina. Algunos grupos de investigación han detectado nanocristales en la orina y se han basado en el uso de extensos protocolos o métodos que son limitados en su capacidad para cuantificar las muestras27,28. Este estudio muestra un método especí...

Los cristales urinarios se forman cuando la orina se sobresatura con minerales. Esto puede ocurrir en individuos sanos pero es más común en individuos con cálculos renales1. La presencia y acumulación de cristales urinarios puede aumentar el riesgo de desarrollar un cálculo renal. Específicamente, esto ocurre cuando los cristales se unen a la placa de Randall, se nuclean, se acumulan y crecen con el tiempo2,3,4. La cristaluria precede a la formación de cálculos renales y la evaluación de la cristaluria puede tener valor predictivo en formadores de cálculos renales3,5. Específicamente, se ha sugerido que la cristaluria es útil para predecir el riesgo de recurrencia de la piedra en pacientes con antecedentes de oxalato de calcio que contiene piedras6,7.
Se ha informado que los cristales tienen un impacto negativo en la función de las células inmunes renales epiteliales y circulantes8,9,10,11, 12,13. Se ha relatado previamente que los monocitos circulantes de oxalato de calcio (CaOx) formadores de cálculos renales han suprimido la bioenergética celular en comparación con los individuos sanos14. Además, los cristales de CaOx reducen la bioenergética celular e interrumpen la homeostasis redox en los monocitos8. El consumo de comidas ricas en oxalato puede causar cristaluria que podría conducir a daño renal en el túbulo y alterar la producción y función de macromoléculas urinarias que protegen contra la formación de cálculos renales15,16. Varios estudios han demostrado que los cristales urinarios pueden variar en forma y tamaño dependiendo del pH y la temperatura de la orina17,18,19. Además, se ha demostrado que las proteínas urinarias modulan el comportamiento de los cristales20. Daudon et al.19,propusieron que el análisis de cristaluria podría ser útil en el manejo de pacientes con enfermedad por cálculos renales y en la evaluación de su respuesta a las terapias. Algunos métodos convencionales actualmente disponibles para evaluar la presencia de cristales incluyen microscopía polarizada21,22,microscopía electrónica23,contadores de partículas3,filtración de orina24,evaporación3,5 o centrifugación21. Estos estudios han proporcionado la penetración valiosa al campo de la piedra de riñón con respecto a crystalluria. Sin embargo, una limitación de estos métodos ha sido la incapacidad de visualizar y cuantificar cristales de menos de 1 μm de tamaño. Cristales de este tamaño pueden influir en el crecimiento de las piedras de CaOx mediante la fijación a la placa de Randall.
Se ha demostrado que los nanocristales causan una lesión extensa a las células renales en comparación con los microcristales más grandes25. La presencia de nanocristales se ha reportado en orina utilizando un analizador de nanopartículas26,27. Estudios recientes han utilizado sondas de bisfosfato marcados fluorescentemente (alendronato-fluoresceína/alendronato-Cy5) para examinar nanocristales utilizando citometría de flujo a nanoescala28. La limitación de este tinte es que no es específico y se unirá a casi todos los tipos de piedras excepto la cisteína. Por lo tanto, evaluar con precisión la presencia de nanocristales en individuos puede ser una herramienta eficaz para diagnosticar la cristaluria y/o predecir el riesgo de cálculos. El propósito de este estudio fue detectar y cuantificar nanocristales que contienen calcio (<1 μm de tamaño) utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Para lograr esto, se utilizó la tecnología NTA en combinación con un fluoróforo de unión al calcio, Fluo-4 AM, para detectar y cuantificar nanocristales que contienen calcio en la orina de adultos sanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Jouan Centrifuge</td>
			<td>CR3-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Oxalate monohydrate</td>
			<td>Synthesized in the lab as previously described29.</td>
			<td> </td>
			<td>Store at RT; Stock 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>677418</td>
			<td>Store at RT; Stock 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>AC615095000</td>
			<td>Store at RT; Stock 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM*</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>20550</td>
			<td>Store at Freezer (-20&#176;C); Stock 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticles</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>742031</td>
			<td>Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight Instrument</td>
			<td>Malvern Instruments, UK</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>98-4730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon Disinfectant</td>
			<td>LanXESS Energizing Company, Germany</td>
			<td>LSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20&#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of urinary nanocrystals in humans using calcium fluorophore labeling and nanoparticle tracking analysis

Los cálculos renales son cada vez más frecuentes en todo el mundo en adultos y niños. El tipo más común de cálculos renales se compone de cristales de oxalato de calcio (CaOx). La cristaluria ocurre cuando la orina se sobresatura con minerales (por ejemplo, calcio, oxalato, fosfato) y precede a la formación de cálculos renales. Los métodos estándar para evaluar la cristaluria en formadores de piedra incluyen microscopía, filtración y centrifugación. Sin embargo, estos métodos detectan principalmente microcristales y no nanocristales. Se ha sugerido que los nanocristales son más dañinos para las células epiteliales renales que los microcristales in vitro. Aquí, se describe la capacidad del análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para detectar nanocristales urinarios humanos. Alimentaron a los adultos sanos una dieta controlada del oxalato antes de beber una carga del oxalato para estimular nanocrystals urinarios. La orina fue recogida por 24 horas antes y después de la carga del oxalato. Las muestras fueron procesadas y lavadas con etanol para purificar las muestras. Los nanocrystals urinarios fueron manchados con el fluoróforo obligatorio del calcio, Fluo-4. Después de la coloración, el tamaño y la cuenta de nanocristales fueron determinados usando NTA. Los hallazgos de este estudio muestran que NTA puede detectar de manera eficiente la nanocristaluria en adultos sanos. Estos hallazgos sugieren que NTA podría ser un método temprano valioso de la detección de nanocrystalluria en pacientes con enfermedad de la piedra de riñón.

Los hallazgos de este estudio muestran que NTA puede detectar eficientemente el tamaño medio y la concentración de calcio que contiene nanocristales urinarios en la orina humana. Esto se logró mediante el uso del fluoróforo, Fluo-4 AM, y el análisis de seguimiento de nanopartículas. Fluo-4 AM fue capaz de unirse a los cristales de CaOx y CaP. Como se muestra en la Figura 3A,se determinó que los cristales de CaOx tenían un tamaño de entre 50-270 nm y una concentración media de 1,26 ...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis

El objetivo de este estudio fue determinar si el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) podría detectar y cuantificar el calcio urinario que contiene nanocristales de adultos sanos. Los hallazgos del estudio actual sugieren que NTA podría ser una herramienta potencial para estimar nanocristales urinarios durante la enfermedad por cálculos renales.

Estimación De Nanocristales Urinarios En Humanos Usando Etiquetado De Fluoróforo De Calcio Y Análisis De Seguimiento De Nanopartículas

Kidney stones are becoming more prevalent worldwide in adults and children. The most common type of kidney stone is comprised of calcium oxalate (CaOx) ...

Este protocolo puede detectar específicamente nanocristales que contienen calcio en la orina humana. Esta técnica podría potencialmente ser útil para predecir los primeros tiempos de la formación de la piedra de riñón así como otras enfermedades asociadas a urea cristalina. Demostrando el procedimiento estará el Dr.Parveen Kumar, un investigador IV en mi laboratorio.Haga que los participantes consuman una dieta baja en oxalato durante tres días y ayunen durante la noche. Luego recoja una muestra de orina de 24 horas de los participantes antes de que consuman una carga de oxalato. Alimente a los participantes con un batido que contenga frutas y verduras con una carga de oxalato de aproximadamente ocho milimoles.Haga que los participantes recojan su orina durante 24 horas después del consumo de oxalato y la devuelvan al día siguiente. Mantenga todas las muestras de orina a temperatura ambiente antes del procesamiento. Mida y registre el pH de la orina y el volumen de las muestras de orina.Mezcle bien y agregue 50 mililitros de orina en un tubo cónico estéril etiquetado de 50 mililitros. Centrífuga la muestra a 1, 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de sobremesa. Deseche el sobrenadante, luego lave y resuspiente el pellet nuevamente con cinco mililitros de etanol 100%.Centrífuga la muestra a 1, 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de sobremesa. Deseche el sobrenadante y resuspend el pellet en un mililitro de etanol al 100%. Guarde la muestra a menos 20 grados Centígrados para su posterior procesamiento o proceda inmediatamente con la tinción de las muestras.Diluya nanopartículas de oro de tamaño de 100 nanómetros en agua ultrapura en una proporción de 1:1,000 y utilícelos para optimizar los ajustes del instrumento. Diluya las muestras de orina 20 veces en agua antes de la tinción con cinco milimoares Fluo-4 AM durante 30 minutos en la oscuridad y analice las muestras usando NTA. Prepare el oxalato del calcio y los cristales del fosfato de calcio según lo descrito en el manuscrito del texto antes del análisis de NTA.Encienda la computadora y el instrumento, luego abra el software y encienda la cámara. Haga clic en el icono de captura en la esquina superior izquierda de la ventana para iniciar el modo de captura. Limpie la plataforma bombeando primero aire en ella usando una jeringa de un mililitro hasta que la plataforma parezca limpia.Agregue suavemente agua al aparato dos o tres veces y use otra jeringa de un mililitro para eliminar cualquier burbuja de aire. Una vez que la plataforma esté limpia, agregue agua y verifique si hay contaminación en la superficie viendo la cámara, luego agregue nanopartículas de oro como control al inyector de la bomba de carga de muestras para configurar el instrumento. Ajuste el nivel de la cámara en la pantalla o en la perilla del lado derecho del instrumento hasta que la imagen comience a mostrar píxeles de colores y, a continuación, reduzca el nivel de la cámara.A continuación, ajuste la pantalla para optimizar la imagen. Haga clic con el botón izquierdo del ratón en la imagen de vídeo. Mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón y arrastre la imagen hacia arriba y hacia abajo para obtener toda la vista.Configure la velocidad de infusión y enfoque la cámara para que las nanopartículas de oro sean visibles en la pantalla de la cámara. Establezca la velocidad de infusión en alta para la configuración inicial para asegurarse de que se detectan las nanopartículas de oro. Una vez detectado, reduzca la velocidad a 50 microlitros por minuto para visualizar nanopartículas de oro.Ajuste el nivel de la cámara para visualizar las partículas. Para muestras no manchadas, ajuste la ganancia de pantalla en el nivel cinco para lograr el enfoque de la cámara y establezca el nivel de la cámara en ocho. Una vez establecido el foco, registre el ejemplo.Después de la optimización, vuelva a limpiar el aparato con agua antes de evaluar otras muestras para asegurarse de que el tubo esté limpio y las partículas no estén presentes. Para analizar las muestras teñidas, ajuste la cámara a la posición del filtro que contiene el filtro fluorescente adecuado y cargue las muestras diluidas y teñidas en el inyector de la bomba de carga de la muestra, reduciendo la velocidad a 20 microlitros por minuto para el análisis. Ajuste la ganancia de pantalla a cinco y el nivel de la cámara a 13.Guarde los datos después de cada medición. Calcule el número promedio de nanopartículas para las cinco lecturas de cada muestra individual y analice los datos utilizando la desviación estándar o el error estándar de la media. Utilice pruebas T para el análisis por pareado.Fluo-4 AM fue capaz de unirse tanto a los cristales de oxalato de calcio, que tenían entre 50 y 270 nanómetros de tamaño y tenían una concentración media de 1,260 millones de partículas por mililitro, como a los cristales de fosfato de calcio, que estaban entre 30 y 225 nanómetros y tenían una concentración media de 2, 220 millones de partículas por mililitro. Las muestras de orina de 24 horas recogidas antes de que la carga del oxalato contuviera algunos nanocrystals urinarios entre 110 a 300 nanómetros de tamaño. En cambio, había un aumento significativo en nanocrystals urinarios presentes en muestras del poste-oxalato.Para confirmar la reproducibilidad del método, las muestras se midieron tres veces y no hubo variación significativa en las réplicas técnicas. Al intentar este protocolo, puede haber alguna dificultad con la adición de muestras sin burbujas a la máquina. Para evitar esto, agregue aire y agua a la máquina y luego agregue muestras lentamente.Además, asegúrese de monitorear continuamente sus muestras y que no haya burbujas presentes. Este nuevo método será probado en individuos con enfermedad de la piedra de riñón del oxalato del calcio para supervisar la progresión de la enfermedad y/o para predecir riesgo de la piedra de riñón.

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Investigación

Medicina

Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle

Etiquetado de las células madre con Ferumoxytol, uno de nanopartículas de hierro aprobada por la FDA de óxido

Stem cell based therapies offer significant potential for the field of regenerative medicine. However, much remains to be understood regarding the in vivo ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Inducción y evaluación de daños de esfuerzo del músculo esquelético en seres humanos

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

Un modelo para simular la hipoxia clínicamente relevantes en seres humanos

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Comparing Bibliometric Analysis Using PubMed, Scopus, and Web of Science Databases

Comparación del análisis bibliométrico con PubMed, Scopus y Web of Science Databases

Literature databases (i.e., PubMed, Scopus, and Web of Science) differ in terms of their coverage, focus, and the tool they provide. PubMed focuses mainly ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimación del número de Nefrona en riñón entera utilizando el método de maceración ácida

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Análisis de alto rendimiento de datos de asignación óptica mediante electromap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...