Name: monitoring neutrophil elastase and cathepsin g activity in human sputum samples
Uploaded: 2021-05-21T14:00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples at JoVE.com

该项目得到了德国教育和研究部（FKZ 82DZL004A1至M.A.A.M）和德国研究基金会（SFB-TR84TP B08至M.A..M）的赠款支持。本手稿中描述的工作得到了德国肺病研究中心 （DZL） 和 EMBL 海德堡通过 M. G 博士奖学金的支持。我们感谢J.沙特尼、布茨和舒尔曼的专家技术援助。

以下协议描述了对人类痰的分析。人类样本处理已获得海德堡大学道德委员会的批准，并获得了所有患者或其父母/法定监护人的书面知情同意（S-370/2011）和健康控制（S-046/2009）。
注：以下协议描述中性粒细胞血清蛋白酶 （NSP） 活性中的样品制备和定量。本文提出的实验程序侧重于人类痰和中性粒细胞elastase 14、20、21（NE）或导管素G 15（CG）活性测量。然而，样本制备协议的轻微适应使血液衍生细胞和肿瘤同质化的分析成为可能。此外，矩阵金属蛋白酶12和导管素S活动可以通过专用FRET探针22，23，24，25，26进行类似的调查。
1. 样品制备：细胞分离和超自然分离
注意：如果可能，痰的治疗应在预期后120分钟内进行，痰应储存在冰上，直到进一步处理。
<ol><li>如果不能自发地预测痰，诱导痰如前所述19。简言之，在启动痰诱导程序之前吸入200微克的β-2受体-拮抗剂沙丁胺醇。之后，使用雾化器吸入高压（6%）盐水溶液15分钟。在培养皿中收集预期的痰。</li>
	<li>在移液器尖的帮助下，将唾液中的粘液团块分离到培养皿中。</li>
	<li>称重粘液。 注：粘液样本的平均重量为0.8克（变化在0.1克至5克之间）：0.1 g 通常足以执行上述程序。</li>
	<li>在痰中加入 4 个 10% 的痰素 （在 PBS 中） 的 4 个部分 （v/w）： 4 mL 的 10% 痰素每克痰）。 注意：孢子素由磷酸盐缓冲剂中的浓缩二硫三醇组成，因此小心处理。</li>
	<li>在室温下（RT）将混合物在摇动摇床上孵育15分钟，溶解粘液。出于安全考虑，将摇床放入烟雾罩中。</li>
	<li>通过添加相同体积的冷 PBS（例如：每 mL 10% Sputolysin 的 1 mL 冷 PBS 来抑制反应）。</li>
	<li>通过管道混合以获得同质解决方案。</li>
	<li>通过100μm尼龙细胞过滤器将混合物过滤成50mL管。</li>
	<li>通过 40μm 尼龙细胞过滤器重复过滤步骤。</li>
	<li>在4°C下，在300 x g下将解决方案离心10分钟。</li>
	<li>小心地将超自然分数转移到一个新的管子中，并将其储存在冰上。 注：超自然分数可存储在-20°C或-80°C，直到进一步分析。</li>
	<li>轻轻地将细胞颗粒在 500 μL 的冷 PBS 中重新喷出，并将其放置在冰上。 注意：必须立即处理单元格分数。</li>
</ol>2. 中性粒细胞血清蛋白酶活性测量
注：这里采用不同的方法，通过FRET记者量化NSP活动。技术的选择取决于具体的生物医学问题和实验的目的。所展示的探针对一组肺相关酶14、15的特异性进行了广泛的测试。虽然探针针对其靶酶是特定的，但始终检查感兴趣的临床样本上的探针特异性。这可以通过在添加探针之前用特定的蛋白酶抑制剂孵育样品来实现，这应该会消除 D/A 比率的任何增加。
<ol><li>可溶性 NSP 活动量定量通过氟测定仪或板读取器检测 注意：任何能够检测荧光的仪器都可以检测样品可溶性部分的蛋白酶活性。<ol><li>在冰上解冻酶。</li>
		<li>在使用之前，将 NE 和 CG 保存在酸性存储缓冲区（50 mM 醋酸钠、200 mM NaCl、pH 5.5）以防止自乳化。</li>
		<li>要设置酶标准曲线，在激活缓冲区（10 mM Tris-HCl，500m NaCl 在 pH 7.5 中）中准备 1：2 系列稀释酶（NE 为 33.9 - 0.271 nM;CG 为 42.6 - 0.333 nM）。激活缓冲器具有中性 pH，因此能够有效地进行酶催化。<ol>
<li>要准备最高标准浓度（NE 浓度：33.9 nM），在 999 μL 的激活缓冲中稀释 1 μL NE（33.9 μM）。</li>
			<li>要准备第二个标准（NE 浓度：16.95 nM），将第一次稀释的 200 μL 与 200 μL 的激活缓冲混合。</li>
			<li>相应地准备剩余的1：2稀释。</li>
			<li>最后一个标准，即空白，由纯激活缓冲区组成。建议测量技术重复或三脚架。在标准和样品准备过程中，尽量将小瓶放在冰上。</li>
		</ol></li>
		<li>在标准制备的同时，在激活缓冲中稀释痰样。在评估其蛋白酶活性之前稀释人体样本，以保持在报告信号增加的线性范围内（捐赠者/接受者比率）。如果患者样本未稀释，发生得太快，无法进行可靠的安装。由于与CF和COPD患者的样本相比，健康的供体痰中含有较少的活性蛋白酶，通常会进行不同的稀释（健康痰超标剂为1：10，慢性阻塞性肺病或慢性阻塞性肺病患者的痰超标为1：20-500）。 注意：为了定量测量浓度未知的样品中的蛋白酶活性，需要平行测量具有已知酶浓度的标准曲线，最好是在同一板块上测量。人类痰中活性酶的浓度是通过将人类痰样中测量的斜坡与标准曲线测量的斜坡进行插值来计算的。</li>
		<li>在准备样品进行测量之前，先设置仪器。将 NE FRET 探头 （NEmo-114）的激发波长设置为 354 nm，并为供体设置检测波长至 400 nm，为接受者设置 490 nm。将 CG FRET 探头 （sSAM15）的激发波长设置为 405 nm，并将排放设定为 485（供体）和 580 nm（接受者）。</li>
		<li>将 40 μL 的样品、标准或空白添加到黑色 96 井半区域板的井中。</li>
		<li>要准备包含记者的主组合（主组合中的记者浓度：10 μM），在激活缓冲中稀释探头库存（DMSO中的1 mM）1：100。通过将所需的板井数量乘以 10 μL x 来准备所需的主混合体积。要达到 NEmo-1 和 sSAM 记者荧光测量的最佳最终浓度 （2 μM），请将主混合物的 10 μL 添加到每个井中（包含样本、标准或空白的 40 μL），然后开始读取。因此，NEmo-1和sSAM记者将分别监测可溶性中性粒细胞酶和导管素G活性。 注：如果试剂喷油器不可用，请务必在记者加入样品后尽快开始读出。</li>
		<li>启动读板器测量并记录每 60-90 秒的供体/接受者比率增加至少 20 分钟，或直到信号的增加达到高原。</li>
		<li>数据导出后，通过将捐赠者相对荧光单位 （RFU） 与接受者 RFU 除以每个时间点和样本来计算供体/接受者比率 （D/A 比率）。</li>
		<li>计算每个样本的 D/A 比率均值和标准偏差。</li>
		<li>确定 D/A 比率变化的线性增长中的坡度。斜率是 FRET 探头酶率的指标。通过将从人类样本中提取的线性回归坡度与酶标准计算的线性回归坡度相配，计算痰中活性酶的浓度。</li>
	</ol></li>
	<li>通过氟度计或板式读卡器检测，对膜绑定 NSP 活动进行量化<ol>
<li>如上所述，分离痰细胞。在 40μL 的 PBS 体积中重新发送 3 x 104 个单元。将单元格添加到板读取器中。</li>
		<li>设置仪器。将膜绑定 NE FRET 探头 （NEmo-214）的激发波长设置为 405 nm，并为供体设置检测波长至 485 nm，为接受者设置 580 nm。将膜绑定 CG FRET 探头 （mSAM15）的激发波长设置为 405 nm，并将排放设定为 485（供体）和 580 nm（接受者）。</li>
		<li>要准备包含记者的主混合，请将激活缓冲中的探针库存稀释到浓度为 10 μM。要达到 NEmo-2 和 mSAM 记者的荧光测量的最佳最终浓度 （2 μM），请向每口井添加 10 μL 的主混合物（包含样本、标准或空白的 40 μL），然后开始读取。因此，NEmo-2和mSAM记者将分别监测膜绑定中性粒细胞和导管素G活性。 注意：可以使用细胞负控制，例如，不主动分泌 NSP 的细胞。例如，记者用3×104 白细胞祖细胞 HL - 60 前列肌细胞的孵化代表有效的负控制。</li>
		<li>记录捐赠者/接受者比率的变化至少20分钟，或直到信号的增加达到一个高原。分析上述数据。</li>
	</ol></li>
	<li>通过荧光显微镜测量膜绑定 NSP 活动测量<ol><li>确定需要分析的条件数量。 注意：对于每次痰样测量，建议准备和分析额外的正（PC）和负（NC）控制。</li>
		<li>每次测量时，在 1.5 mL 管中以 50μL PBS 的体积重新喷出 3 x 104 个痰细胞。</li>
		<li>作为负控制，用特定抑制剂（西维莱斯特、特定的NE抑制剂或导管素G抑制剂I，特定的CG抑制剂，在最终浓度为100μM时孵育痰细胞）。在 RT 孵化 10 分钟。</li>
		<li>作为正控制，在RT用适当的酶（NE或CG分别在340纳米或200纳米孵育痰细胞10分钟）。</li>
		<li>在每个管子（正控制处理细胞、负控制处理细胞和未经处理的细胞）中加入50μL的PBS，以达到2μM的探头最终浓度。在RT孵化10-20分钟。 重要提示：添加核污渍可促进荧光显微镜成像，因为它允许在不使用 FRET 探针通道的情况下搜索感兴趣的痰细胞，从而避免记者漂白。此外，DNA污渍允许根据痰细胞的细胞核形状对痰细胞进行分割。例如，嗜中性粒细胞可以通过其多球核轻松识别。此外，还可以检索有关细胞生存能力的其他信息（具有更细分核的嗜中性粒细胞更有可能存活）。 注：除了膜绑定外，通过H-NE和H-CG、细胞外DNA关联FRET探针27，可以以同样的方式测量人类痰中DNA结合NE或CG的活性。在准备主混合物时，H-NE 和 H-CG 可在浓度为 10 μM 时添加，并在细胞平和幻灯片制备之前用痰孵育。细胞外DNA的D/A比例定量与NEmo-2和mSAM相同，唯一的区别是细胞外DNA聚合物被分割，而不是单细胞27。</li>
		<li>通过添加 100 μL 的冰冷 PBS 并在冰上传输样品来抑制反应。</li>
		<li>细胞将混合物放在显微镜滑梯上，空气干燥，用冰冷的甲醇固定10%，10分钟，空气干燥，并安装适当的安装介质。 注：显微镜幻灯片可在黑暗中储存在4°C，长达一个月，直到进一步分析。</li>
		<li>使用具有PL APO 40倍或63倍油目标的协聚焦显微镜获取显微镜图像。为了提高图像质量并缩短采集时间，建议采用顺序图像采集模式。<ol>
<li>通过氦-霓虹-激光线首先通过633 nm激发核污渍，并记录其650至715纳米之间的排放。</li>
			<li>用阿贡激光在 458 nm 兴奋时记录 FRET 记者的捐赠者（库马林 343）470 至 510 nm。获得感性接受者（5，6-TAMRA）排放在570至610纳米之间，在唯一的捐赠者兴奋后。</li>
			<li>使用二极管泵送固态 （DPSS） 激光，在 561 nm 接收者最佳激发时，在 470 至 510 nm 之间的单独通道中记录直接接受器发射。</li>
			<li>在实验开始时设置针孔，并在成像过程中保持。 注意：由于其体积小，建议使用40倍或63倍显微镜目标来正确可视化嗜中性粒细胞。通常，图像是通过多个连续的渠道获得的，从更长的激发波长开始，以防止记者在采集过程中拍照。</li>
		</ol></li>
		<li>图像至少100个细胞每个条件，以决定性的统计。对于显微镜图像分析，请使用适当的软件：分段单元格并按像素逐像素计算 D/A 比率，然后计算用户手动选择的特定感兴趣区域的平均值或中位数。有关代表性结果，请参阅 图 1。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62193/62193fig01.jpg"> 图1：从 CF 患者痰中分离出的中性粒细胞的膜绑定 NE 活性的代表性图像和定量。 a） 代表共聚焦显微镜图像的嗜中性粒细胞预孵育（顶部面板）10分钟与100μM的西维莱斯特（w/）或离开未经处理（w/o）（底部面板）之前，记者NEmo-2 （2 μM）添加。左侧的第一列显示核污渍，第二列显示捐赠通道，第三列显示接受者通道，最后一列显示按像素分隔捐赠者和接受者通道获得的计算的 D/A 比率。感兴趣区域的边界（单中性粒细胞）被描绘成虚线。表示比例（10 μm）和校准条（D/A比率）。b） 显示具有代表性的 CF 患者痰中性粒细胞的 D/A 比例的盒状图和点图。用抑制剂和未经处理的细胞孵育的细胞分别以灰色和蓝色显示。每个点代表一个细胞（N：w/ 抑制剂 = 113 和 w/o 抑制剂 = 96）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62193/62193fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<ol start="4"><li>通过流动细胞测量测量膜绑定 NSP 活动<ol>
<li>在 5 mL FACS 聚苯乙烯圆底管中，在 100 μL 的 PBS 中补充 1 x 106 个细胞，并将管子放在冰上。</li>
		<li>要门痰嗜中性粒细胞，请使用以下抗体：CD14（1：50）、CD16（1：50）、CD45（1：33）和CD66b（1：50）。为所有样品准备足够的主组合。将主混合物放在黑暗中的冰上。</li>
		<li>设置图 2中描述的门控策略。嗜中性粒细胞被封为7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+事件。然后，将分析封闭事件，以分析其供体（λexc = 405 nm，λem = 450/50 nm）和接受者（λexc = 405 nm，λem = 585/42 nm）的平均荧光强化 （MFI）。</li>
		<li>在每个样本中加入 2 μL 的 FcBlock，并在 RT 孵化 5 分钟。</li>
		<li>将选定的抗体添加到每个管中，并在黑暗中的冰上孵育30分钟。</li>
		<li>通过添加 2 mL 的冷 PBS 和离心机在 300 x g 和 4 °C 下洗涤细胞 5 分钟。 在200μL的冷PBS中丢弃超自然和再补充细胞。</li>
		<li>将 200 μL 拆分为两个管，每个管 100μL，并在每个管中添加 5 μL 的细胞生存能力染色溶液。将管子放在冰上。</li>
		<li>在负控制 （NC） 试管中添加适当的特定 NSP 抑制剂（用于 NE 使用 Sivelestat，总浓度为 225 μM，用于 CG 在 100 μM 处使用导管素 G 抑制剂 I）。在 RT 中孵化样品 10 分钟。</li>
		<li>在样品中加入 100 μL 的冷 PBS，通过干净的 FACS 管中的 40μm 过滤器进行过滤，以防止仪器堵塞。</li>
		<li>将报告器（NE，NEmo-2在最终浓度为4μM，CG，mSAM在最终浓度为2μM）添加到NC样本中，轻轻漩涡管。</li>
		<li>开始获取用特定抑制剂孵育的细胞，以便在必要时稍微调整门以及记者 PMT 的电压。</li>
		<li>记录至少1000个嗜中性粒细胞。将样品保持在室温下。 注意：虽然可以记录更多的事件，但 1000 个单元格可确保在适当的统计和记录时间之间达成良好的折衷。</li>
		<li>相应地进行以下管（未经处理的痰样）。</li>
		<li>要记录膜绑定蛋白酶活性导致的 D/A 比率变化，请每 5 到 10 分钟记录 1000 个来自每个管子的嗜中性粒细胞。 注： FRET 记者成功后，捐赠渠道最惠国待遇强度将随着时间的推移而增加。接受者通道最惠国待遇强度应随着时间的推移而降低或保持不变。</li>
		<li>通过将捐赠者除以接受者通道值来计算在门控可行单嗜中性粒细胞上测量的样本的 FRET 比率。</li>
		<li>通过将样本测量与相应的 0 分钟时间点除以来使样本测量正常化（代表结果和分析请参阅图 2）。 注：对于 D/A 比率变化的动态测量，至少需要记录两个时间点（即 0 和 10 分钟）。为了使每个样本的活动测量正常化，在以后的时间点（例如 10 分钟）中测量的 D/A 比率除以探头添加后立即计算的比率（0 分钟）。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62193/62193fig2v2.jpg"> 图2：从CF患者痰中分离出的中性粒细胞上测量的加丁策略和具有代表性的膜绑定NE活性图。a） 用于门痰嗜中性粒细胞，使用以下抗体：CD14 （1：50）、 CD16 （1：50）、 CD45 （1：33） 和 CD66b （1：50）。嗜中性粒细胞被封为7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+事件。门禁事件分析为他们的捐赠者（λexc= 405 nm，λem= 450/50 nm）和接受者 （λexc= 405 nm， λem= 585/42 nm） 均值荧光强化 （MFI）。b） 代表直方图的CF痰中性粒细胞分析其膜绑定NE活性。左列显示供体信号，右列显示接收器信号。上排显示与西维莱斯特（w/）治疗的细胞的平均荧光强化度10分钟，然后再添加记者。下排显示未经处理（w/o）细胞，其记者荧光立即测量（0分钟，灰色）和10分钟（蓝色）后，记者添加。根据小组a.c显示的策略，中性粒细胞被关上门） 数据表显示了一个具有代表性的数据集，包括供体的原始最惠国待遇和接受者信号，这些信号是根据几个时间点（0-3-5-10-15-20 分钟）测量的中性粒细胞的接收信号以及计算的 D/A 比率。D/A 比率可以正常化，即到 0 分钟时间点（白色字体）。0分钟表示记者加入带有染色痰细胞的流管后尽快完成记录。MFI 数据显示为 1000 个嗜中性粒细胞的平均±标准偏差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62193/62193fig2v2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

<ol>
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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mouse+tumors+by+a+lipidated+cathepsin+S+substrate.">In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).</li><li>Korkmaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+elastase,+proteinase+3+and+cathepsin+G+activities+at+the+surface+of+human+neutrophils+with+fluorescence+resonance+energy+transfer+substrates.">Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates.</a> Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).</li><li>Craven, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-silent+FRET+Sensor+Enables+Live+Cell+Imaging+and+Flow+Cytometric+Stratification+of+Intracellular+Serine+Protease+Activity+in+Neutrophils.">Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).</li><li>Mu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+fret+reporter+for+the+real-time+visualization+of+cell-surface+proteolytic+enzyme+functions.">A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).</li><li>Hagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+rapid+and+dynamic+quantification+of+elastase+activity+on+sputum+neutrophils+from+patients+with+cystic+fibrosis+using+flow+cytometry.">New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry.</a> European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).</li><li>Dittrich, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+activity+on+sputum+neutrophils+correlates+with+severity+of+lung+disease+in+cystic+fibrosis.">Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).</li><li>Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+FRET+probe+visualizes+MMP12+activity+in+pulmonary+inflammation.">Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation.</a> Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).</li><li>Hu, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+and+other+fluorescent+proteinase+probes.">FRET-based and other fluorescent proteinase probes.</a> Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).</li><li>Trojanek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+obstruction+triggers+macrophage+activation+and+matrix+metalloproteinase+12-dependent+emphysema.">Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).</li><li>Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+matrix+metalloproteinase+12+in+cystic+fibrosis+lung+disease.">Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease.</a> Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).</li><li>Gaggar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+cystic+fibrosis+lung+disease.">The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease.</a> The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).</li><li>Guerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+FRET+Reporters+Targeting+Neutrophil+Extracellular+Traps.">Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).</li><li>Middleton, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor+for+Cystic+Fibrosis+with+a+Single+Phe508del+Allele.">Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele.</a> New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).</li></ol>

作者声明没有利益冲突。

报告的协议解释了不同的方法来量化人类痰样中中性粒细胞酶和导管素G的活性。成功酶活性测量的关键点是 i） 操作程序的精确计时和标准化，ii） 使用可靠的负控和正控。如果满足这些条件，所述方法不限于痰，但也可以很容易地适应血液、支气管湿润滑液和组织部分或同质化物中的蛋白酶活性的分析。
这三种技术各有长处和局限性，往往相辅相成。例如，流动细胞学允许快速分析稀有细胞种群以及细胞表型，但缺乏空间分辨率信息，可以通过显微镜实现。相反，板阅读器测量允许以高通量方式对多个样品或条件进行平行评估。由于新鲜的痰细胞不能冷冻和储存，这三种方法要求样品在预料后必须快速处理。这限制了膜绑定活动测量的灵活性或吞吐量。发展一个流动细胞学协议，允许修复细胞后，探针添加和酶将打开平行测量更多的管。此外，应特别注意FRET探针的处理和储存。事实上，肽基质中存在的一些氨基酸，如甲硫酸，会发生氧化，导致记者敏感性降低。为了延长记者的保质期（估计在20°C时大约三个月），它们可以在惰性气体（如氮气或砷）下储存在小容量的铝报价（1-2μL）中。
在CF和其他慢性炎症性肺病中，尽早发现炎症非常重要，可靠的生物标志物有可能实现这一目标。检测表面绑定 NSP 活动的可能性，已被证明对周围组织有害，也在没有或很少自由 NE 活动的情况下，增加了另一个级别的有价值的信息，这很难通过其他现有方法4，11实现。
记者可以用来研究膜绑定相关的NSP活动与肺病的严重程度和进展的联系，特别是在它的早期。这些方法可用于监测治疗效果（例如，抗炎治疗或高效的CFTR调节器和电阻器28），并研究由此产生的中性粒细胞驱动炎症的抑制。此外，协议基于非侵入性样本程序，这些程序对患者的风险非常低，因此，可以非常广泛地使用，并为许多令人兴奋的应用打开大门。

中性粒细胞酶 （NE）， 导管素 G （CG）， 蛋白酶 3 （PR3） 和中性粒细胞血清蛋白酶 4 （NSP4） 是四个中性粒细胞血清蛋白酶 （NSP）1.它们与骨髓醇酶一起储存在中性粒细胞或嗜血颗粒中。由于其蛋白解含量升高，原颗粒的分泌受到严格调节，嗜中性粒细胞必须连续受到刺激和激活刺激的挑战。
在噬菌体内部，NSP作为细胞内杀菌剂3的功能。当分泌时，NSP成为炎症的有力调解者：它们切开细胞因子和表面受体，激活平行的促炎通路3。重要的是，炎症条件具有不受控制的 NSP 分泌。例如，在发炎的气道内，过量的NE活性会导致粘液超额分化、杯状细胞代谢、CFTR失活和细胞外基质重塑4、5。导热素 G 也参与炎症：它特别切开和激活 IL-1 家族的两个组件，IL-36® 和 IL-36®6。与 NE 配合，CG 在气道上皮上切蛋白酶激活受体，并激活 TNF-α和 IL-1+ 。
内源性抗蛋白酶，如α-1抗三氯苯酚、阿尔法-1-抗霉素和分泌白细胞蛋白酶抑制剂调节中性粒细胞和导管素G活性5。然而，在肺病进展过程中，蛋白酶的连续分泌超过抗蛋白酶屏蔽，导致气道中嗜血性不解，炎症恶化，组织损伤5，7。虽然在患者气道的可溶性部分的NE浓度和活性已被证明是疾病严重程度8的有希望的生物标志物，NE和CG也关联到中性粒细胞血浆膜和细胞外DNA通过静电相互作用9，10，在那里他们变得不容易获得抗蛋白酶。重要的是，前层研究定义了一个场景，即细胞表面相关的蛋白酶活性出现得更早和/或独立于其可溶性对应4，11。事实上，要成为可检测的，自由蛋白酶活动首先需要压倒抗蛋白酶盾。相反，在细胞表面，膜绑定蛋白酶活性保持至少部分完好无损，由于大抑制剂不能进入细胞等离子膜12。这种复杂的蛋白酶行为对中性粒细胞介导的炎症发作和传播有重要影响，因此需要用精确和翔实的工具进行调查。
多年来，基于Fürster共振能量转移（FRET）的探测器发现，许多生物医学应用作为工具，有效和快速地评估人类样本13中的特定蛋白酶活性。为了发挥作用，蛋白酶记者由一种识别主题（即肽）组成，该主题由靶向酶识别，并依赖于FRET，这是一个物理过程，在激发后，供体氟磷将能量传递给接受者分子。由记者身上的酶操作的处理，即识别部分的，导致接受者从供体扩散：因此，酶活性被测量为接受者荧光对供体的时间依赖变化。这种读取是自我规范化和比例化，因此仅受pH值和局部探针浓度等环境条件的轻微影响。NEmo-114和 sSAM15是 FRET 探测器，分别专门报告 NE 和 CG 活动。然而，这些记者并不专门定位到任何细胞隔间，因此他们被用来监测人流体中的蛋白酶活性。为了以空间局部的方式监测蛋白酶活动，我们和其他人开发了FRET探针，通过分子标记14、15、16、17、18、19与亚细胞成分关联。这种合成战略允许开发NEmo-2和mSAM，两个FRET探针配备脂质锚，局部到等离子膜。这些记者加深了对囊性纤维化和慢性阻塞性肺病 NE 和 CG 蛋白酶的深入了解。
在这里，通过 NEMO 和 SAM 系列 FRET 探头，为人类痰中的可溶性和膜绑定 NE 和 CG 活动进行可视化和量化提供了详细的协议。为了解决 NSP 病理生理学的不同方面，并提供一系列方法，可根据用户特定需求使用，通过荧光光谱、荧光显微镜和流动细胞测量进行分析。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>10535253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD, viability dye</td>
			<td>Bio Legend</td>
			<td>420404</td>
			<td>5 &#181;L/100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>PR124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black flat bottom 96 well half area plate</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathepsin G</td>
			<td>Elastin Products Company</td>
			<td>SG623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathepsin G Inhibitor I</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>219372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>EP5401000137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips advanced 1.0 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>0030 089 430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete proteinase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countig chambers improved Neubauer</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>40442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips &#216; 25mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MENZCB00250RA003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (nuclear stain)</td>
			<td>BioStatus Limited</td>
			<td>DR50050</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva software, v8.0.1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td>fiji.sc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo software, v10</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoQ Plugin, v3-97</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Sputum Leucocyte Elastase</td>
			<td>Elastin Products Company</td>
			<td>SE563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rock-Shaker</td>
			<td>PEQLAB Biotechnologie GmbH</td>
			<td>MR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557742 Lot:8221983</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557820 Lot:8208791</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557833 Lot:8059688</td>
			<td>1:33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305122 Lot:B241921</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mSAM</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipette plus</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEmo-1</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>SC-0200</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEmo-2E</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>SC-0201</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer</td>
			<td>Pari</td>
			<td>085G3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histokitt (mounting medium)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td>
			<td>6638.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salbutamol</td>
			<td>Teva GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sivelestat</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>17779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputolysin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>560000-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sSAM</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neutrophil elastase and cathepsin g activity in human sputum samples

蛋白酶是无数生理过程的调节器，对其活动的精确调查仍然是一个耐人寻味的生物医学挑战。在人类基因组编码的约600个蛋白酶中，中性粒细胞塞林蛋白酶（NSP）因参与炎症性疾病（包括呼吸系统疾病）的发病和进展而进行了彻底调查。无独有偶，分泌的 NSP 不仅在细胞外流体中扩散，而且局部化为等离子膜。在中性粒细胞外陷阱 （NETs） 形成过程中，NSP 成为分泌染色质的组成部分。这种复杂的行为使得对NSP病理生理学的理解成为一项具有挑战性的任务。在这里，详细的协议显示可视化，量化和区分自由和膜绑定中性粒细胞（NE）和导管素G（CG）活动在痰样本。NE 和 CG 是 NSP，其活动在囊性纤维化 （CF） 和慢性阻塞性肺病 （COPD） 的发病机理中具有全息作用：它们促进组织改造，调节下游免疫反应，并与肺病严重程度相关。协议展示了如何分离流体和细胞部分，以及通过小分子Fürster共振能量转移（FRET）记者将嗜中性粒细胞与人类痰分离，进行酶活性定量。为了收集对 NE 和 CG 活动的相对作用的具体见解，FRET 读数可以通过不同的技术进行测量：i） 体外 板读取器测量允许高通量和批量检测蛋白酶活性：ii） 锥显微镜在细胞表面的膜结合活性：iii） 小分子 FRET 流细胞测量通过单细胞蛋白酶活性定量和表型，可快速评估抗炎治疗。这些方法的实施为探索NSP病理生物学及其作为CF和COPD疾病严重程度生物标志物的潜力打开了大门。鉴于其标准化潜力、强大的读数和简单的传输，所述技术可立即共享，供整个研究和诊断实验室实施。

图1a中显示的结果说明了具有代表性的显微镜数据集。核信号用于通过中性粒细胞特有的分段核来识别中性粒细胞。感兴趣的区域 （ROI） 是手动选择的（图1a中的虚线）。D/A 比率图像的计算方法是将供体通道的特性除以接受者通道的强化度，逐像素。在最后一步计算每个单元的平均D/A比率（投资回报率）。在图 1b中，每个点表示一个投资回报率（中性粒细胞）的平均值。建议对每种情况的大约 100 个细胞进行成像和评估。
图2a显示了具有代表性的流动细胞测量门控策略。这种门控允许歧视和研究痰中性粒细胞。为了避免荧光溢出或补偿文物，建议将激光线（如蓝色激光）用于 FRET 探头荧光检测。流细胞学荧光补偿应针对抗体而不是 FRET 探头进行。图2b描绘了记者添加后0和10分钟的MFI分布。图 2c中的每一行都表示 1000 痰中性粒细胞的平均供体和接受者 MFI 值。D/A比率是通过划分捐赠者和接受者最惠国待遇来计算的。右侧图2c中的时间过程显示了测量的进展：在快速初始增加后，D/A 比率根据膜绑定酶的活性达到高原。

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Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

本文所述的协议提供了一个指南，可视化和量化人类痰中中性粒细胞蛋白酶的活动。这种分析的应用范围从抗炎治疗的评估，到生物标志物验证、药物筛选和大队列临床研究。

监测人类痰样中的中性粒细胞和导管素 G 活性

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

我们的 FRET 探头和协议能够快速、敏感地量化嗜中性气道疾病患者在痰中的自由和表面绑定 elastase 和导管 G 活性。这些方法，使得探索蛋白酶病理生理学的不同方面成为可能。板阅读器测量允许进行大排量筛选。共聚焦显微镜可视化酶活性与亚细胞溶液。在流动细胞测量的同时，以个性化的方式实现单细胞表型和蛋白酶活性定量。该技术可扩展到不同的气道疾病，如囊性纤维化、支气管切除术或慢性阻塞性肺病。它可以适应不同的生物样本，如血液或支气管牛皮或小鼠样本。在开始痰诱导程序之前，吸入200微克β2受体拮抗剂沙丁胺醇。之后，使用雾化器吸入高音6%盐溶液15分钟。在培养皿中收集预期的痰。在移液器尖的帮助下，将唾液中的粘液团块分离到培养皿中。称重粘液，然后在痰中加入四个体积部分，每重量为 10%的痰素和 PBS。在室温下将混合物在摇动摇床上孵育15分钟，溶解粘液。通过为每毫升10%的斯普托利辛添加一毫升冷PBS来抑制反应。派珀特混合物获得同质溶液。通过100微米尼龙细胞过滤器将混合物过滤成50毫升管。在 4 摄氏度的 300 倍 G 下，通过 40 微米滤网重复过滤步骤，然后离心机在 300 倍 G 下 10 分钟。将超自然人转移到一个新的管子里，并储存在冰上。轻轻地将细胞颗粒在 500 微升的冷 PBS 中恢复，并将其放置在冰上。解冻冰上的酶，并设置文本手稿中描述的酶标准曲线。在标准制备的同时，在激活缓冲中稀释痰样。在读板器上，为NE FRET探头NEmo-1至354纳米设置激发波长，为供体设置发射波长至400纳米，为接受者设置490纳米的激发波长。对于CG FRET探测器，SSam将激发波长设置为405纳米，为供体设置发射波长为485纳米，为接受者设定580纳米。将 40 微升样品、标准或空白添加到黑色 96 井半区域板的井中，并添加主混合。启动读板器并记录捐赠者接受者比率每 60 到 90 秒后增加至少 20 分钟，或直到信号增加达到高原。导出数据并计算捐赠者与接受者的比例，将捐赠者 RFU 除以每个时间点和样本的接受者 RFU。然后计算捐赠者与接受者比率的均值和标准偏差。确定捐赠者与接受者比率变化的线性增长中的坡度。每次测量，在1.5毫升的管中，在50微升PBS的体积中再补充3万个痰细胞。用特定抑制剂作为负控制和适当的酶作为阳性控制，在室温下孵化痰细胞10分钟。在每个管子上加入50微升PBS，其中含有FRET记者和核污渍，最终浓度为2微摩尔。在室温下孵化混合物10至20分钟。通过添加100微升冰冷PBS并将样品放在冰上来抑制反应。在显微镜幻灯片上将混合物切入。然后空气干燥，用冰冷的10%甲醇固定细胞10分钟。固定后，空气干燥，并安装样品与适当的安装介质。使用对焦显微镜捕捉图像。图像至少100个细胞每个条件，以决定性的统计。在5毫升FACS聚苯乙烯圆底管中，在100微升PBS中补充100万个细胞，并将管子放在冰上。在每个样品中添加两个 FC 块的微升。然后在室温下将样品孵化五分钟。每根管子加入抗体，在黑暗中在冰上孵育30分钟。在 300 倍 G 和 4 摄氏度下用两毫升的冷 PBS 和离心机清洗细胞。最后，在PBS的200微升中恢复。将悬架分成两个管子，每个管子100微升，并添加5个微升的细胞生存性污渍。在负控制管中加入适当的特定 NSP 抑制剂，并在黑暗中的室温下将样品孵育 10 分钟。将 PBS 添加到样品中，并通过 40 微米滤芯将其过滤到干净的 FACS 管中。将记者添加到负控制样本中，轻轻漩涡。开始获取使用这种特定抑制剂孵育的细胞，如有必要，稍微调整门以及记者PMTs电压。要记录捐赠者接受因膜绑定蛋白酶活性而发生的比例的变化，每5至10分钟记录1000个来自每个管子的嗜中性粒细胞。通过将捐赠者除以接受者通道值来计算在门控可行单嗜中性粒细胞上测量的样本的 FRET 比率。此处显示了用 100 微摩尔西维利斯塔特预先孵育的嗜中性粒细胞图像，或在记者 NEmo-2 添加之前未得到处理的图像。核信号用于根据中微子的特征分段核来识别中性粒细胞，并手动选择投资回报率。绘制了接受痰中性粒细胞比例的捐赠者。每个点表示一个投资回报率的平均值。流动细胞测量门控使歧视和研究痰中性粒细胞成为可能。记者加法后观察到的MFI分布为零和10分钟。计算了1000个痰中性粒细胞的平均供体和接受者MFI值。D/A比率在初始增加后达到稳定值。健康的捐赠者痰诱导需要一些实践之前完美。记得在预料到之前放松和呼吸气溶胶10到15分钟。此外，始终将痰细胞保存在冰上，并在预料到后尽快处理。我们发现，表面绑定蛋白酶活动与儿童早期肺损伤和成年CF患者肺部疾病的严重程度有关。因此，这些方法共同有助于探索蛋白酶作为中性嗜血性气道疾病的早期炎症生物标志物。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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科研

免疫与感染

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