Name: monitoring neutrophil elastase and cathepsin g activity in human sputum samples
Uploaded: 2021-05-21T14:00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples at JoVE.com

פרויקט זה נתמך על ידי מענקים של משרד החינוך והמחקר הגרמני (FKZ 82DZL004A1 ל M.A.M) וקרן המחקר הגרמנית (SFB-TR84TP B08 ל M.A.M). העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי המרכז הגרמני לחקר הריאות (DZL) וה- EMBL היידלברג באמצעות מלגת דוקטורט עבור M.G. אנו מודים לג'יי שאטרני, ס. בוץ ו- H. Scheuermann על סיוע טכני מומחה.

<ol>
	<li>Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase,+proteinase+3+and+cathepsin+G:+Physicochemical+properties,+activity+and+physiopathological+functions.">Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions.</a> Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).</li><li>Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granule+Protein+Processing+and+Regulated+Secretion+in+Neutrophils.">Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils.</a> Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).</li><li>Pham, C. T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+serine+proteases:+Specific+regulators+of+inflammation.">Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li><li>Gehrig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+neutrophil+elastase+reduces+inflammation,+mucus+hypersecretion,+and+emphysema,+but+not+mucus+obstruction,+in+mice+with+cystic+fibrosislike+lung+disease.">Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).</li><li>McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+proteases+in+cystic+fibrosis+lung+disease+paradigms,+progress,+and+potential.">Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).</li><li>Clancy, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Neutrophil+Proteases+Are+Efficient+Regulators+of+IL-1,+IL-33,+and+IL-36+Cytokine+Activity+but+Poor+Effectors+of+Microbial+Killing.">Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing.</a> Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).</li><li>Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adaptations+upon+recruitment+to+the+lung:+New+concepts+and+implications+for+homeostasis+and+disease.">Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).</li><li>Sly, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+Factors+for+Bronchiectasis+in+Children+with+Cystic+Fibrosis.">Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis.</a> New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).</li><li>Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface-bound+elastase+and+cathepsin+G+on+human+neutrophils:+A+novel,+non-oxidative+mechanism+by+which+neutrophils+focus+and+preserve+catalytic+activity+of+serine+proteinases.">Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases.</a> Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria.">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Margaroli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+Exocytosis+by+Airway+Neutrophils+Associates+with+Early+Lung+Damage+in+Cystic+Fibrosis+Children.">Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).</li><li>Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface-bound+elastase+and+cathepsin+G+on+human+neutrophils:+a+novel,+non-oxidative+mechanism+by+which+neutrophils+focus+and+preserve+catalytic+activity+of+serine+proteinases.">Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases.</a> The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).</li><li>Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bright+Future+for+Precision+Medicine:+Advances+in+Fluorescent+Chemical+Probe+Design+and+Their+Clinical+Application.">A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application.</a> Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).</li><li>Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+monitoring+of+neutrophil+elastase+activity+with+ratiometric+fluorescent+reporters.">Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).</li><li>Guerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+G+Activity+as+a+New+Marker+for+Detecting+Airway+Inflammation+by+Microscopy+and+Flow+Cytometry.">Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry.</a> ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).</li><li>Hu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mouse+tumors+by+a+lipidated+cathepsin+S+substrate.">In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).</li><li>Korkmaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+elastase,+proteinase+3+and+cathepsin+G+activities+at+the+surface+of+human+neutrophils+with+fluorescence+resonance+energy+transfer+substrates.">Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates.</a> Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).</li><li>Craven, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-silent+FRET+Sensor+Enables+Live+Cell+Imaging+and+Flow+Cytometric+Stratification+of+Intracellular+Serine+Protease+Activity+in+Neutrophils.">Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).</li><li>Mu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+fret+reporter+for+the+real-time+visualization+of+cell-surface+proteolytic+enzyme+functions.">A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).</li><li>Hagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+rapid+and+dynamic+quantification+of+elastase+activity+on+sputum+neutrophils+from+patients+with+cystic+fibrosis+using+flow+cytometry.">New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry.</a> European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).</li><li>Dittrich, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+activity+on+sputum+neutrophils+correlates+with+severity+of+lung+disease+in+cystic+fibrosis.">Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).</li><li>Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+FRET+probe+visualizes+MMP12+activity+in+pulmonary+inflammation.">Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation.</a> Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).</li><li>Hu, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+and+other+fluorescent+proteinase+probes.">FRET-based and other fluorescent proteinase probes.</a> Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).</li><li>Trojanek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+obstruction+triggers+macrophage+activation+and+matrix+metalloproteinase+12-dependent+emphysema.">Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).</li><li>Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+matrix+metalloproteinase+12+in+cystic+fibrosis+lung+disease.">Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease.</a> Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).</li><li>Gaggar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+cystic+fibrosis+lung+disease.">The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease.</a> The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).</li><li>Guerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+FRET+Reporters+Targeting+Neutrophil+Extracellular+Traps.">Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).</li><li>Middleton, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor+for+Cystic+Fibrosis+with+a+Single+Phe508del+Allele.">Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele.</a> New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

הפרוטוקולים המדווחים מסבירים גישות שונות לכימות הפעילות של אלסטאז נויטרופילים וקתפסין G בדגימות כיח אנושיות. נקודות קריטיות למדידת פעילות אנזים מוצלחת הן ה- i) תזמון ותקינה מדויקים של ההליך האופרטיבי ו- ii) שימוש בבקרות שליליות וחיוביות אמינות. אם תנאים אלה מתקיימים, השיטות המתוארות אינן מוגבלות ליחה אבל יכול גם להיות מותאם בקלות לניתוח של פעילות פרוטאז בדם, נוזלי שטיפת סימפונות ומקטעי רקמות או הומוגנטים.
לכל אחת משלוש הטכניקות יש את החוזקות והמגבלות שלה, שלעתים קרובות משלימות זו את זו. לדוגמה, cytometry זרימה מאפשר ניתוח מהיר של אוכלוסיות תאים נדירים, כמו גם פנוטיפים התא אבל חסר מידע ברזולוציה מרחבית, אשר ניתן להשיג על ידי מיקרוסקופיה. במקום זאת, מדידות קורא הלוחות מאפשרות הערכה מקבילה של מספר דגימות או תנאים באופן בעל תפוקה גבוהה. מאחר שלא ניתן להקפיא ולאחסן תאי ליחה טריים, שלוש השיטות דורשות עיבוד מהיר של דגימות לאחר הציפייה. פעולה זו מגבילה את הגמישות או את התפוקה של מדידות הפעילות המאוגדות בקרום. הפיתוח של פרוטוקול cytometry זרימה המאפשר לתקן תאים לאחר תוספת בדיקה מחשוף אנזימטי ייפתח למדידה מקבילה של מספר גבוה יותר של צינורות. יתר על כן, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לטיפול ואחסון של בדיקות FRET. למעשה, כמה aminoacids נוכח מצע פפטיד, כגון מתונין, לעבור חמצון אשר מוביל לירידה ברגישות הכתב. כדי להגדיל את חיי המדף של הכתב (מוערך כשלושה חודשים ב 20 °C (60 °F), הם יכולים להיות מאוחסנים aliquots נפח קטן (1-2 μL) תחת גז אינרטי כגון חנקן או ארגון.
ב CF ומחלות ריאות דלקתיות כרוניות אחרות חשוב לזהות את הדלקת מוקדם ככל האפשר, סמנים ביולוגיים אמינים יש פוטנציאל להשיג מטרה כזו. האפשרות לזהות פעילות NSPs כבול פני השטח, אשר הוכח להזיק לרקמה שמסביב, גם בתנאים שבהם אין או מעט פעילות NE חינם, מוסיף רמה נוספת של מידע בעל ערך, אשר בקושי ניתן להשיג באמצעות שיטות קיימות אחרות4,11.
הכתבים יכולים לשמש כדי ללמוד את הקישור של פעילות NSP הקשורים קרום עם חומרת והתקדמות של מחלת ריאות, במיוחד בתחילתה המוקדמת. השיטות יכולות להיות מנוצלות כדי לפקח על יעילות הטיפול (למשל, טיפולים אנטי דלקתיים או מאפננים CFTR יעיל מאוד potentiators28) ולחקור את השיכוך וכתוצאה מכך של דלקת מונחה נויטרופילים. בנוסף, הפרוטוקולים מבוססים על הליכי מדגם לא פולשניים הנושאים סיכון נמוך מאוד עבור המטופל, ולכן ניתן להשתמש בהם בקנה מידה רחב מאוד ולפתוח את הדלתות ליישומים מרגשים רבים.

נויטרופילים אלסטאז (NE), קטפסין G (CG), פרוטאז 3 (PR3) ו נויטרופילים סרין פרוטאז 4 (NSP4) הם ארבע פרוטאזים סרין נויטרופילים (NSP)1. הם מאוחסנים, יחד עם myeloperoxidase, בתוך גרגרים ראשוניים נויטרופילים או אזורופילית. בשל התוכן הפרוטאוליטי המוגבה שלהם, הפרשת הגרגרים העיקריים מוסדרת היטב ונויטרופילים צריכים להיות מאותגרים ברצף עם הפרימינג והפעלתגירויים 2.
בתוך phagolysosome, NSPs לתפקד כסוכנים bactericidal תאיים3. כאשר מופרש, NSPs הופכים מתווכים חזקים של דלקת: הם cleave ציטוקינים קולטני פני השטח, הפעלת מסלולים פרו דלקתיים מקבילים3. חשוב לציין, תנאים דלקתיים תכונה הפרשת NSPs בלתי מבוקרת. לדוגמה, בתוך דרכי הנשימה מודלק, פעילות NE מוגזמת גורמת hypersecretion ריר, מטפלזיה של תאי גביע, איון CFTR ומטריצה חוץ תאית שיפוץ4,5. קטפסין G משתתף בדלקת גם כן: הוא במיוחד cleaves ומפעיל שני מרכיבים של משפחת IL-1, IL-36α ו IL-36β6. בתיאום עם NE, CG cleaves קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז על אפיתל דרכי הנשימה וגם מפעיל TNF-α ו IL-1β.
אנטי פרוטאזות אנדוגני כגון אלפא-1-אנטיטריפסין, אלפא-1-אנטיכימוטריפסין ומעכב פרוטאז לויקוציטים הפרשתי לווסת אלסטאז נויטרופילים ופעילות קטפסין G5. עם זאת, במהלך התקדמות מחלת ריאות, הפרשת מתמשך של פרוטאזים עולה stoichiometrically מגן אנטי פרוטאז, המוביל נויטרופיליה בלתי פותרת בדרכי הנשימה, החמרה דלקת ונזק לרקמות5,7. למרות ריכוז NE ופעילות שברים מסיסים של דרכי הנשימה החולה הוכח להיות סמן ביולוגי מבטיח של חומרת המחלה8, NE ו CG גם לקשר את קרום פלזמה נויטרופילים לדנ"א חוץ תאי באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות9,10 שבו הם הופכים פחות נגיש אנטי פרוטאזות. חשוב לציין, מחקרים פרה-קוליניים הגדירו תרחיש שבו פעילות פרוטאז הקשורה לפני השטח של התא מופיעה מוקדם יותר ו/או ללא תלות בעמיתה המסיס4,11. למעשה, כדי להיות לזיהוי, פעילות פרוטאז חינם צריכה קודם להציף את מגן האנטי פרוטאז. במקום זאת, על פני השטח של התא, פעילות פרוטאז הקשורה לקרום נשארת שלם לפחות חלקית בשל חוסר הנגישות של מעכבים גדולים לקרום פלזמה התא12. להתנהגות פרוטאז מורכבת כזו יש השלכות חשובות על התפרצות דלקת בתיווך נויטרופילים והתפרצות, ולכן יש לחקור אותה בכלים מדויקים ואינפורמטיביים.
במהלך השנים, Förster תהודה העברת אנרגיה (FRET)מבוססי בדיקות מצאו יישומים ביו רפואיים רבים ככלים להעריך ביעילות ובמהירות פעילות פרוטאז ספציפית בדגימות אנושיות13. כדי לתפקד, כתבי פרוטאז מורכבים ממוטיב זיהוי (כלומר, פפטיד), המוכר על ידי אנזים היעד ומסתמך על FRET, תהליך פיזי שבו, עם עירור, פלואורופור תורם מעביר אנרגיה למולקולה מקבלת. העיבוד המופעל על ידי האנזים על הכתב, כלומר המחשוף של חלק ההכרה, גורם למקבל להתפזר מהתורם: פעילות האנזים נמדדת אפוא כשינוי תלוי זמן בתורם על פני הפלואורסצנטיות המקבלת. קריאה כזו היא נורמליזציה עצמית ויחסיות, ולכן מושפעת רק באופן שולי על ידי תנאים סביבתיים כגון pH וריכוז בדיקה מקומי. NEmo-114 ו SSAM15 הם בדיקות FRET לדווח באופן ספציפי על פעילות NE ו CG, בהתאמה. עם זאת, כתבים כאלה אינם מקומיים באופן ספציפי לכל תא סלולרי, ולכן הם מועסקים כדי לפקח על פעילות פרוטאז נוכח נוזלים אנושיים. על מנת לפקח על פעילות פרוטאז באופן מקומי מעוגל, אנו ואחרים פיתחנו בדיקות FRET המקשרות לרכיבים תת-תאיים באמצעות תגים מולקולריים14,15,16,17,18,19. אסטרטגיה סינתטית כזו אפשרה את הפיתוח של NEmo-2 ו mSAM, שתי בדיקות FRET מצויד עוגנים השומנים כי לוקליזציה קרום הפלזמה. כתבים אלה תדלקו הבנה עמוקה יותר של NE ו CG פרוטאזות סיסטיק פיברוזיס ומחלות ריאות חסימתיות כרוניות14,15.
כאן, פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור הדמיה וכימות של פעילויות NE ו- CG מסיסות וממברנות בליחה אנושית באמצעות סדרת NEmo ו- SAM של בדיקות FRET. כדי לטפל בהיבטים מגוונים של פתופיזיולוגיה NSPs ולספק מערך של שיטות שניתן לטפל בהן בהתאם לצורך הספציפי למשתמש, הניתוח באמצעות ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות, מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות וציטומטריית זרימה מוצגים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>10535253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD, viability dye</td>
			<td>Bio Legend</td>
			<td>420404</td>
			<td>5 &#181;L/100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>PR124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black flat bottom 96 well half area plate</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathepsin G</td>
			<td>Elastin Products Company</td>
			<td>SG623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathepsin G Inhibitor I</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>219372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>EP5401000137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips advanced 1.0 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>0030 089 430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete proteinase inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countig chambers improved Neubauer</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>40442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips &#216; 25mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MENZCB00250RA003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (nuclear stain)</td>
			<td>BioStatus Limited</td>
			<td>DR50050</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva software, v8.0.1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Fiji Is Just ImageJ)</td>
			<td>fiji.sc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Jo software, v10</td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoQ Plugin, v3-97</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Sputum Leucocyte Elastase</td>
			<td>Elastin Products Company</td>
			<td>SE563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rock-Shaker</td>
			<td>PEQLAB Biotechnologie GmbH</td>
			<td>MR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557742 Lot:8221983</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557820 Lot:8208791</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>557833 Lot:8059688</td>
			<td>1:33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>305122 Lot:B241921</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mSAM</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipette plus</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEmo-1</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>SC-0200</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEmo-2E</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>SC-0201</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer</td>
			<td>Pari</td>
			<td>085G3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histokitt (mounting medium)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td>
			<td>6638.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salbutamol</td>
			<td>Teva GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sivelestat</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>17779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputolysin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>560000-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sSAM</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring neutrophil elastase and cathepsin g activity in human sputum samples

פרוטאזות הן רגולטורים של אינספור תהליכים פיזיולוגיים והחקירה המדויקת של פעילותם נותרה אתגר ביו-רפואי מסקרן. בין ~ 600 פרוטאזות מקודד על ידי הגנום האנושי, פרוטאזות סרין נויטרופילים (NSPs) נחקרים ביסודיות על מעורבותם בתחילת והתקדמות של מחלות דלקתיות כולל מחלות בדרכי הנשימה. באופן ייחודי, NSPs מופרש לא רק מפוזר בתוך נוזלים חוץ תאיים, אלא גם לוקליזציה לקרומי פלזמה. במהלך היווצרות מלכודת חוץ-תאית נויטרופילית (NETs), NSPs הופכים לחלק בלתי נפרד מהכרומטין המופרש. התנהגות מורכבת כזו הופכת את ההבנה של פתופיזיולוגיה NSPs למשימה מאתגרת. כאן, פרוטוקולים מפורטים מוצגים לדמיין, לכמת ולהפלות חופשי קרום קשור אלסטאז נויטרופילים (NE) ו cathepsin G (CG) פעילויות בדגימות ליחה. NE ו- CG הם NSPs שפעילותם יש תפקידים pleiotropic בפתוגנזה של סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD): הם מקדמים שיפוץ רקמות, לווסת את התגובות החיסוניות במורד הזרם לתאם עם חומרת מחלת ריאות. הפרוטוקולים מראים כיצד להפריד בין שבר נוזלי לתאי, כמו גם בידוד של נויטרופילים מליחה אנושית לכימות פעילות אנזימטית באמצעות מולקולה קטנה Förster תהודה אנרגיה מבוססי העברת אנרגיה (FRET) כתבים. כדי לאסוף תובנות ספציפיות על התפקיד היחסי של פעילויות NE ו- CG, קריאת FRET יכולה להימדד על ידי טכנולוגיות שונות: i) מדידות קורא לוחות במבחנה מאפשרות תפוקה גבוהה וזיהוי בצובר של פעילות פרוטאז; ii) מיקרוסקופיה קונפוקלית פותרת פעילות הקשורה לקרום על פני התא; iii) ציטומטריית זרימה FRET מולקולה קטנה מאפשרת הערכה מהירה של טיפולים אנטי דלקתיים באמצעות כימות פעילות פרוטאז חד-תאי ופנוטיפים. היישום של שיטות כאלה פותח את הדלתות לחקור פתוביולוגיה NSPs ואת הפוטנציאל שלהם כמו סמנים ביולוגיים של חומרת המחלה עבור CF ו COPD. בהתחשב בפוטנציאל התקינה שלהם, הקריאה החזקה שלהם ופשטות ההעברה, הטכניקות המתוארות ניתנות לשיתוף מיידי ליישום במעבדות מחקר ואבחון.

התוצאות המוצגות באיור 1a ממחישות ערכת נתונים מייצגת של מיקרוסקופיה. האות הגרעיני משמש לזיהוי נויטרופילים על ידי הגרעינים המפולחים האופייניים להם. אזור העניין (ROI) נבחר באופן ידני (קו מקווקו באיור 1a). תמונת יחס D/A מחושבת על-ידי חלוקת העוצמות של ערוץ התורם בעוצמות של ערוץ המקבל על בסיס פיקסל אחר פיקסל. בשלב האחרון מחושב יחס D/A הממוצע לתא (ROI). באיור 1b כל נקודה מייצגת את הממוצע של החזר על ההשקעה (נויטרופילים). מומלץ לצלם ולהעריך כ-100 תאים בכל תנאי.
באיור 2a מוצגת אסטרטגיית גיטינג של ציטומטריית זרימה ייצוגית. גטינג כזה מאפשר להפלות וללמוד נויטרופילים כיח. כדי למנוע שפיכת פלואורסצנטיות או חפצי פיצוי, מומלץ להקדיש קו לייזר (למשל, לייזר כחול) לגילוי פלואורסצנטיות בדיקה FRET. פיצוי פלואורסצנטיות cytometry זרימה צריך להתבצע עבור נוגדנים ולא עבור החללית FRET. איור 2b מתאר את התפלגות MFI ב- 0 ו- 10 דקות לאחר הוספת הכתב. כל שורה באיור 2c מציינת את ערכי ה- MPI של התורם והמקבל הממוצע עבור 1000 נויטרופילים ליחה. יחס D/A מחושב על ידי חלוקת MPI התורם והמקבל. מסלול הזמן באיור 2c בצד ימין מראה את התקדמות המדידה: לאחר עלייה ראשונית מהירה, יחס ה-D/A מגיע לרמה, בהתאם לפעילות האנזים הקשור לקרום.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples at JoVE.com

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

הפרוטוקולים המתוארים בזאת מספקים מדריך כדי לדמיין ולכמת את הפעילות של פרוטאזות נויטרופילים בליחה אנושית. היישומים של ניתוח כזה משתרעים מההערכה של טיפולים אנטי דלקתיים, לאימות סמנים ביולוגיים, הקרנת תרופות ומחקרים קליניים גדולים.

ניטור נויטרופילים אלסטאז וקטפסין G פעילות בדגימות כיח אנושי

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

הבדיקה והפרוטוקולים שלנו ב- FRET מאפשרים כימות מהיר ורגיש של פעילות אלסטאז וקטספין G חופשיות וכבולות פני השטח בליחה מחולים עם מחלות דרכי הנשימה הנויטרופילית. שיטות אלה, מאפשרים לחקור היבטים שונים של פתופיזיולוגיה פרוטאסים. מדידות קוראי הלוחות מאפשרות הקרנות גדולות.מיקרוסקופיה קונפוקלית מדמיין פעילות אנזימים עם פתרון תת-תאי. בעוד ציטומטריית זרימה, מאפשרת כימות פעילות פנוטיפים ופרוטאז של תא יחיד באופן מותאם אישית. טכניקה זו ניתן להרחיב למחלות דרכי הנשימה שונות כגון סיסטיק פיברוזיס, bronchiectasis או COPD.וזה יכול להיות מותאם BioSamples שונים כגון דם או לבאש alveola הסימפונות או דגימות עכברים. לפני תחילת הליך אינדוקציה ליחה, לשאוף 200 מיקרוגרם של בטא 2 אנטגוניסטים קולטן salbutamol. לאחר מכן, לשאוף היפרטוני 6% תמיסת מלח במשך 15 דקות באמצעות nebulizer.לאסוף את ליחה expectorated בצלחת פטרי. ריר נפרד גושים מהרוק לתוך צלחת פטרי בעזרת קצה פיפטה. לשקול את הריר, ולאחר מכן להוסיף ארבעה חלקים נפח לכל משקל של 10%Sputolysin ו PBS ליחה.הדגירה את התערובת בטמפרטורת החדר על שייקר נדנדה במשך 15 דקות כדי להמיס את הריר. להרוות את התגובה על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS קר עבור כל מיליליטר של 10% Sputolysin. פיפטה התערובת כדי לקבל פתרון הומוגני.מסננים את התערובת דרך מסננת תאי ניילון 100 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר. חזור על שלב הסינון דרך מסננת 40 מיקרון, ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנט לצינור טרי ומאחסנים אותו בקרח.בעדינות resuspend גלולת התא ב 500 microliters של PBS קר ומניחים אותו על קרח. להפשיר אנזימים על קרח ולהגדיר עקומת אנזים סטנדרטית כמתואר בכתב היד טקסט. במקביל להכנה הסטנדרטית, לדלל דגימות ליחה במאגר ההפעלה.על קורא הלוחות, הגדר את אורך גל העירור עבור החללית NE FRET NEmo-1 עד 354 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל 400 ננומטר לתורם ו 490 ננומטר עבור מקבל. עבור CG FRET בדיקה sSam להגדיר את אורך גל עירור ל 405 ננומטר ואת הפליטה ל 485 ננומטר לתורם, ו 580 ננומטר עבור מקבל. הוסף 40 מיקרוליטרים של דגימות, תקנים, או כדורי סרק לתוך בארות של צלחת שחור 96 גם חצי שטח ולהוסיף את תערובת הורים.התחל את קורא הלוחות והקלט את התורם לעלייה ביחס המקבל לאחר כל 60 עד 90 שניות למשך 20 דקות לפחות, או עד שהעלייה באות מגיעה לרמה. יצא את הנתונים וחשב את התורם ליחס מקבל על-ידי חלוקת RFU התורם על-ידי RFU מקבל עבור כל נקודת זמן ומדגם. לאחר מכן חשב את הממוצע של יחס התורם למקבל ואת סטיית התקן.קבע את השיפוע בתוך הצמיחה הליניארית של התורם לשינוי ביחס המקבל. עבור כל מדידה, resuspend 30, 000 תאי ליחה בנפח של 50 microliters של PBS בצינור 1.5 מיליליטר. הדגירה את תאי כיח עם מעכב מסוים כמו שליטה שלילית אנזים מתאים כשליטה חיובית במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.הוסף 50 מיקרוליטרים של PBS המכיל כתב FRET וכתם גרעיני לכל צינור כדי לקבל ריכוז סופי של 2 מיקרומולאר. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 20 דקות. להרוות את התגובה על ידי הוספת 100 microliters של PBS קר כקרח ומניחים את הדגימות על קרח.ציטוספין את התערובת על שקופיות מיקרוסקופיה. ואז אוויר יבש ולתקן את התאים עם קרח קר 10% מתנול במשך 10 דקות. לאחר הקיבעון, האוויר יבש ולהרכיב את המדגם עם מדיום הרכבה מתאים.לכוד את התמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי. תמונה לפחות 100 תאים לכל תנאי לסטטיסטיקה חד משמעית. לבזבז מחדש 1 מיליון תאים ב 100 מיקרוליטרים של PBS בצינור 5 מיליליטר FACS עגול התחתון, ומניחים את הצינור על קרח.הוסף שני מיקרוליטרים של בלוק FC לכל מדגם. ואז להדגיר את הדגימות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים נוגדן לכל צינור ומדגירה על קרח בחושך במשך 30 דקות.לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS קר צנטריפוגה ב 300 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, resuspend ב 200 מיקרוליטרים של PBS. מחלקים את המתלים לשני צינורות, 100 מיקרוליטרים כל אחד ומוסיפים חמישה מיקרוליטרים של כתם הכדאיות של התא.מוסיפים מעכב NSP ספציפי מתאים לצינור הבקרה השלילית ומדגירה את הדגימה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף PBS לדגימה וסנן אותו באמצעות מסנן 40 מיקרון לתוך צינור FACS נקי. הוסף את הכתב לדגימת הבקרה השלילית ומערבולת בעדינות.התחל לרכוש תאים דגירה עם מעכב ספציפי זה ובמידת הצורך, להתאים מעט את השערים, כמו גם את מתחי PMTs הכתב. כדי לתעד שינויים בתורם כדי לקבל יחס עקב פעילות פרוטאז קשורה קרום, שיא 1000 נויטרופילים מכל צינור, כל חמש עד 10 דקות. לחשב את יחס FRET על ידי חלוקת התורם על ידי ערכי ערוץ המקבל עבור הדגימות נמדד על נויטרופילים יחידים קיימא מגודר.תמונות של נויטרופילים טרום דגירה עם 100 מיקרומולאר Sivilestat או נשאר מטופל לפני הכתב NEmo-2 תוספת מוצגים כאן. האות הגרעיני שימש לזיהוי נויטרופילים לפי המאפיינים שלהם מפולחים גרעינים ואת ההחזר על ההשקעה נבחר באופן ידני. התורם לקבל יחס של נויטרופילים כיח זומם.כל נקודה מייצגת את הממוצע של החזר על ההשקעה. גטינג cytometry זרימה מאפשר להפלות וללמוד נויטרופילים כיח. התפלגות MFI באפס ו -10 דקות נצפתה לאחר הוספת כתב.ערכי MFI התורם והמקבל הממוצע עבור 1000 נויטרופילים ליחה חושבו. יחס ה-D/A הגיע לרמה לאחר עלייה ראשונית. אינדוקציה כיח תורמים בריאים לוקח קצת תרגול לפני השלמות.זכור להירגע ולנשום את התרסיס במשך 10 עד 15 דקות לפני הציפייה. בנוסף, תמיד שומר תאי ליחה על קרח ולעבד אותם בהקדם האפשרי לאחר expectoration. מצאנו כי פעילות פרוטאז כבול פני השטח עולה בקנה אחד עם נזק ריאות מוקדם אצל ילדים עם חומרת מחלת ריאות בחולי CF מבוגרים.לכן יחד, שיטות אלה מאפשרות לחקור פרוטאזות כסמנים ביולוגיים דלקתיים מוקדמים במחלות דרכי הנשימה נויטרופילית.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

קביעת פעילות Phagocytic דוגמאות של נוגדן קלינית

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

מדידת פעילות השינואז בדגימות ביולוגיות

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...